Lægemiddelresistens testning for HIV-1-inficerede individer svigtende antiretroviral behandling (ART) kan vejlede fremtidige behandlinger og forbedre behandlingsresultater. Optimering individuelle og befolkningens sundhedsresultater i høj hiv-forekomst, men med begrænsede ressourcer i sidste ende vil kræve økonomisk overkommelige og tilgængelige lægemiddelresistens genotypebestemmelse og tolkning metoder.
HIV-1 resistens har potentiale til alvorligt at kompromittere effektiviteten og virkningen af antiretroviral behandling (ART). Som kunst-programmer i Afrika syd for Sahara fortsætter med at udvide, skal personer på ART overvåges nøje for fremkomst af resistens. Overvågning af transmitteret resistens at spore transmission af virusstammer allerede er resistente over for ART er også kritisk. Desværre lægemiddelresistens test er stadig ikke let tilgængelig i ressource begrænsede indstillinger, fordi genotypebestemmelse er dyrt og kræver avanceret laboratorieudstyr og datastyring infrastruktur. En åben adgang genotype overvågning resistens metode til at styre individer og vurdere transmitteret resistens er beskrevet. Den metode bruger gratis open source-software til fortolkning af narkotika resistensmønstre og generering af den enkelte patients rapporter. Genotypebestemmelse protokol har en forstærkning på mere end 95% for plasmaprøver med AV-iral belastning> 1.000 HIV-1 RNA kopier / ml. Følsomheden falder signifikant for viral belastning <1.000 HIV-1 RNA kopier / ml. Den her beskrevne metode blev valideret mod en metode til HIV-1 lægemiddel resistenstestning godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotypebestemmelse metode. Begrænsninger af den her beskrevne fremgangsmåde kan nævnes, at det ikke er automatiseret, og at det også har undladt at forstærke den cirkulerende rekombinant form CRF02_AG fra en validering panel af prøver, selv om det forstærkede undertyper A og B fra samme panel.
Hiv-epidemien i det sydlige Afrika har været i hastig udvikling 1 med en samtidig eksponentiel stigning i personer på antiretroviral behandling (ART), især i Sydafrika 2, 3. Som bevis på den epidemiologiske konsekvenser af storstilede behandlingsprogrammer reducere forekomsten 4 og stigende levealder i områder med begrænsede ressourcer (RLS) 5 fortsætter med at akkumulere, vil indsatsen for at øge ART dækning intensiveres. Udviklingen af retningslinjer i retning af anvendelse af behandling som et forebyggende værktøj 6, 7 under testen og behandle programmer betyder, at det absolutte antal personer i behandling vil stige yderligere. Et stort antal personer, vil være på ART, for længere perioder som den gennemsnitlige forventede levetid for enkeltpersoner på ART nærmer det af HIV-inficerede population 8. Udvikling og overførsel af hiv resistens har always blevet betragtet som en trussel mod resultaterne af ART 9-12. Således er der behov for mere stringent overvågning og kontrol af resistens som flere personer indledes på ART.
Genotypisk resistens testning (BRT) er blevet anvendt med succes i de udviklede lande, både for overvågning samt overvågning af HIV-1 resistens hos personer, der modtager ART. I disse indstillinger, har BRT blevet integreret i kontinuum af omsorg for HIV-1-inficerede individer. De fleste internationale retningslinjer anbefaler BRT for voksne patienter eller børn svigtende ART (first-line og second-line) 13-15, pædiatriske patienter udsat for forebyggelse af mor-til-barn-smitte (PMTCT) regimer, men efterfølgende smittet 16, og i indstillinger med høje niveauer af transmitteret lægemiddelresistens blandt akut inficerede individer 13-15. Imidlertid har de omkostninger, teknologi og infrastruktur krav begrænset gennemføførelsen af lignende tilgange til lægemiddelresistens overvågning i RLS.
Den sydafrikanske HIV-behandling og overvågning af retningslinjer i øjeblikket ikke anbefale brug af BRT vejlede valg af kunst for personer svigtende første linje regimer 17. Enkeltpersoner er tændt primært baseret på virologisk (HIV-1 RNA viral belastning) parametre. Men i 2012 offentliggjorde sydafrikanske HIV Klinikere Society den første sydlige lægemiddelresistens test afrikanske ARV retningslinjer 18. Disse retningslinjer anbefaler BRT test for alle voksne svigtende første-line og second-line kunst og for smittede spædbørn og børn udsættes for PMTCT 18. Dog er BRT ikke anbefales 18 for akut inficerede individer, fordi der ikke er nogen aktuel evidens for høje niveauer af transmitteret resistens i det sydlige Afrika 19-29. Det forventes, at nogle af disse henstillinger vil blive integreret med tiden i den nationale Treasureatment og overvågning retningslinjer i de forskellige lande i regionen. Allerede i 2013 sydafrikanske retningslinjerne for behandling er der nu anbefaling af BRT på tidspunktet for second-line fiasko for voksne og på tidspunktet for første-eller second-line PI-baserede regime fiasko for børn 30.
Det er blevet påvist, at indarbejde BRT i behandlingsvejledninger i Sydafrika ville være potentielt omkostningsneutral. I betragtning af omkostningerne i den anden linje regime lægemidler, der er relativt dyrere end den første linje lægemidler ved hjælp af BRT til at identificere patienter, der virkelig har brug for at være skiftet til anden linje terapi vil ikke medføre yderligere omkostninger til programmet. Derudover kan BRT også pege på andre årsager til fiasko, bevare behandlingsmuligheder og generere oplysninger om nye resistensmønstre 31. Derfor er det nødvendigt at reducere omkostningerne til lægemiddelresistens metoder overvågning endnu mere for at forbedre adgangen, kvaliteten af pleje end resultater.
Her præsenterer vi en BRT metode designet til at bruge generiske (open source) primere til revers transkription, polymerase chain reaction (PCR) og sekventering (tabel 1), såvel som for det meste open source software til lægemiddelresistens fortolkning. Til klinisk ledelse, er den protokol komplimenteres af en omfattende gennemgang og rapportering metode med specialist fortolkning af laboratorie resistens rapport med tæt tilslutning til de nationale retningslinjer for behandling af. Protokollen er opdelt i fire forskellige komponenter: 1) HIV ribonukleinsyre (RNA) Udvinding, 2) Reverse Transcription og Polymerase Chain Reaction (PCR) af virale mål 3) Sequencing og 4) Bioinformatik metoder til analyse af kromatogrammer, tilpasning, datasikring og fortolkning af sequencer-data.
Adskillige lavpris in-house metoder er blevet beskrevet i bestræbelserne på at forsøge at gøre hiv-resistens genotypebestemmelse mere overkommelige 33, 34, 36. Der er ingen tvivl om behovet for at integrere modstand narkotikatests i kontinuum af omsorg for personer på antiretroviral behandling i områder med begrænsede ressourcer. Imidlertid fokuserer de fleste af de rapporterede metoder for anvendelsen af resistens genotypebestemmelse i overvågningen af resistens på populationen. Saturn / Life Technologies genotypebestemmelse metode er en fuldt integreret protokol for overvågning og kontrol af resistens. Denne metode blev udviklet til at være en overkommelig protokol gennemførelse af det meste open source og åbne ressourcer adgang bioinformatik for fortolkningen af lægemiddelresistens og generering af rapporter til klinisk ledelse.
Det blev vist ved sammenligning med FDA godkendte Viroseq genotypebestemmelse metode til at værepræcis at identificere drug resistente mutationer fra et panel af ANRS præstationsprøvning prøver i 100% af laboratorie panel prøver, der blev succesfuldt forstærket. Præcisionen blev også vurderet på kliniske prøver af subtype C virus, den mest dominerende subtype i det sydlige Afrika. Fremgangsmåden var som nøjagtig på undertype C prøver som det var på undertype A og B. Men hvis metode skal anvendes i andre dele af verden, hvor CRF02_AG er fremherskende, er der et behov for ændring af primerne, idet fremgangsmåden undladt at forstærke en af panelets prøver, der viste sig at have CRF02_AG. Alternativt kan et degenereret sæt af primere, der er følsomme for alle gruppe M virus 33, 36 kan anvendes i områder, hvor subtype fordelingen mere heterogen 38.
Følsomheden af revers transkription og PCR kan øges ved at ekstrahere RNA fra større mængder af plasma, såsom 500 ml. Plasmaet kan centrifugaluged ved 21.000 xg i 90 min for at koncentrere de virale partikler før du fortsætter med den protokol, som beskrevet af QIAamp virale RNA-ekstraktion mini kit.
Som vist den nye fremgangsmåde har en yderligere fordel, at den producerer omfattende rapporter til individuel patient. Disse rapporter er en konsolidering af genotype, immunologiske og virologiske overvågningsdata samt kliniske og behandling historie fra RegaDB. Dette er ledsaget af en detaljeret laboratorium fortolkning af modstand profil efterfulgt af en lige så detaljeret gennemgang af patientens kliniske historie samt behandling anbefalinger. Brugen af en specialist læger til at gennemgå rapporterne og give behandling anbefalinger for patienterne giver den tiltrængt mentorskab for sygeplejerske praktiserende læger samt uerfarne klinikere, som i stigende grad leverer ART i Sydafrika som en del af WHO-anbefalingerne for opgaven gearskift. Disse kliniskerapporter har vist sig at være effektive undervisningsmateriale til klinikere med lidt eller ingen erfaring med resistens management. Fra en patient perspektiv, vores metode mindsker behovet for at rejse til centrale steder for at få adgang til specialiserede hiv-tjenester.
Således beskrevne protokol som helhed giver en god platform, hvorigennem HIV resistens management kan integreres, til en overkommelig pris, i et kontinuum af omsorg for HIV-smittede personer ikke ART. De data, der genereres kan anvendes til epidemiologiske formål at vurdere udviklingen og overførsel af resistens i samfundet. Størrelsen af den pol-fragmentet genereret er godt nok til mere komplekse fylogenetisk analyse, som vil producere en bedre forståelse af epidemien i befolkningen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende alle de kolleger, der har gjort dette arbejde muligt, især Maya Balamane, Elizabeth Johnston Hvid, Sharon Sjöblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, og Lungani Ndwandwe. Forfatterne vil også gerne takke alle medarbejdere på Institut for Sundhed og Africa Centre personale, der arbejder Hlabisa HIV Behandling og pleje-programmet.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |