Resistens testing for HIV-1 infiserte individer sviktende antiretroviral terapi (ART) kan veilede fremtidige terapier og forbedre behandlingsresultatene. Optimalisere individuelle og befolkningshelseutfall i høy HIV-prevalens men ressurs-begrensede innstillinger til slutt vil kreve rimelig og tilgjengelig legemiddelresistens genotyping og tolkningsmetoder.
HIV-1 resistens har potensial til å seriøst kompromiss effektiviteten og virkningen av antiretroviral terapi (ART). Som ART programmer i Afrika sør for Sahara fortsetter å ekspandere, bør individer på ART overvåkes nøye for fremveksten av legemiddelresistens. Overvåking av overført narkotika motstand å spore overføring av virusstammer som allerede er resistente mot ART er også kritisk. Dessverre, er resistens testing fortsatt ikke er lett tilgjengelig i ressurs begrensede innstillinger, fordi genotyping er dyrt og krever avansert laboratorium og datastyring infrastruktur. En åpen tilgang genotypisk legemiddelresistens overvåking metode for å håndtere individer og vurdere overført resistens er beskrevet. Metoden bruker fri programvare med åpen kildekode for tolkningen av legemiddelresistens mønstre og generering av individuelle pasientrapporter. Den genotyping protokollen har en forsterkning hastighet på større enn 95% for plasmaprøvene med viral belastning> 1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Følsomheten reduseres betydelig for viral belastning <1000 HIV-1 RNA kopier / ml. Metoden som beskrives her ble validert mot en metode for HIV-1 resistens testing godkjent av United States Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotyping metode. Begrensninger av metoden beskrevet her inkluderer det faktum at den ikke er automatisert og at det også kunne forsterke den sirkulerende rekombinant form CRF02_AG fra en validerings panel av prøver, selv om det forsterkede undergrupper A og B fra det samme panelet.
HIV-epidemien i det sørlige Afrika har utviklet seg raskt en med en samtidig eksponentiell økning i personer på antiretroviral terapi (ART), spesielt i Sør-Afrika to, tre. Som bevis på epidemiologiske virkningen av storskala behandlingsprogrammer i å redusere forekomsten fire og økende levealder i ressurs-begrensede innstillinger (RLS) 5 fortsetter å hope seg opp, vil arbeidet med å øke ART dekning intensiveres. Utviklingen av retningslinjene til bruk av behandlingen som et forebyggende verktøy 6, 7 under test og behandle programmer betyr at det absolutte antall individer for behandling vil øke ytterligere. Et stort antall individer vil være på ART for lengre perioder av gangen som den gjennomsnittlige levealder for personer på ART nærmer seg at av HIV infisert befolkningen åtte. Utvikling og overføring av HIV legemiddelresistens har alltiys vært betraktet som en trussel mot prestasjoner av ART 9-12. Således er det et behov for en mer rigorøs overvåking og kontroll av legemiddelresistens som flere individer er initiert på ART.
Genotypisk legemiddelresistenstesting (GRT) har vært brukt med hell i utviklede land, både for overvåking samt overvåking av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I disse innstillingene, har GRT blitt integrert i den behandling for HIV-1 infiserte individer. De fleste internasjonale retningslinjer anbefaler GRT for voksne eller pediatriske pasienter som sviktet ART (første-og andrelinje) 13-15, pediatriske pasienter eksponert for forebygging av mor-til-barn smitte (PMTCT) regimer, men senere smittet 16, og i miljøer med høye nivåer av overført resistens hos akutt infiserte individer 13-15. Imidlertid har kostnadene, teknologi og infrastruktur krav begrenset gjennomføringtering av lignende tilnærminger til narkotika motstand overvåking i RLS.
Den sørafrikanske HIV behandling og overvåking retningslinjer for øyeblikket ikke anbefale bruk av GRT i guiding valg av ART for personer sviktende første-linjen regimene 17. Enkeltpersoner er slått primært basert på virologisk (HIV-1 RNA) parametre. Men i 2012, Southern African HIV Klinikere Society publiserte de første Southern African ARV legemiddelresistens testing retningslinjer 18. Disse retningslinjene anbefaler GRT testing for alle voksne sviktende første-og andrelinje ART og for infiserte spedbarn og barn utsatt for PMTCT 18. Imidlertid er GRT ikke anbefalt 18 for akutt infiserte individer, fordi det ikke er noen strøm bevis for høye nivåer av overført legemiddelresistens i Sør-Afrika 19-29. Det er forventet at noen av disse anbefalingene vil bli integrert over tid inn i det nasjonale treling og overvåking retningslinjer for de ulike landene i regionen. Allerede i 2013 sørafrikanske retningslinjer for behandling er det nå anbefaling av GRT på tidspunktet for andre-linjefeil for voksne og på tidspunktet for første-eller andre-linjen PI-basert regime fiasko for barn 30.
Det har vist seg at å innlemme GRT inn retningslinjer for behandling i Sør-Afrika ville være potensielt kostnadsnøytralt. Tatt i betraktning kostnadene for de andre behandling legemidler som er relativt dyrere enn de første linje narkotika, bruker GRT å identifisere pasienter som virkelig trenger å bli byttet til andre linje behandling vil ikke medføre noen ekstra kostnader til programmet. I tillegg kan GRT også identifisere andre årsaker til svikt, bevare behandlingstilbud og generere informasjon om nye resistensmønstre 31. Derfor er det nødvendig å redusere kostnadene for legemiddelresistens overvåkingsmetoder enda lenger for å forbedre tilgang, kvaliteten på pleien end utfall.
Her presenterer vi en GRT metode utviklet for å bruke generiske (open source) primere for revers transkripsjon, polymerase chain reaction (PCR) og sekvensering (tabell 1), så vel som for det meste åpen kildekode programvare for legemiddelresistens tolkning. For klinisk ledelse, er protokollen kompletteres av en omfattende gjennomgang og rapporteringsmetode med spesialist tolkning av laboratorielegemiddelresistens rapport med nær tilslutning til de nasjonale retningslinjer for behandling. Protokollen er delt inn i fire ulike komponenter; 1) HIV ribonukleinsyre (RNA) Extraction, 2) Omvendt transkripsjon og Polymerase Chain Reaction (PCR) forsterkning av virale mål, 3) Sekvensering og 4) Bioinformatikk metoder for analyse av chromatograms, justering, curation og tolkning av sekvensdata.
Flere lavpris in-house metoder har blitt beskrevet i arbeidet med å prøve å få HIV legemiddelresistens genotyping rimeligere 33, 34, 36. Det er ingen tvil om behovet for å integrere legemiddelresistens testing i kontinuum av omsorg for enkeltpersoner på antiretroviral behandling i ressurs-begrensede innstillinger. Men de fleste av de rapporterte metoder fokuserer på anvendelse av legemiddelresistens genotyping i overvåking av resistens på et samfunnsnivå. Saturn / Livet Technologies genotyping metoden er en fullt integrert protokoll for overvåking og oppfølging av legemiddelresistens. Denne metoden ble utviklet for å være en rimelig protokoll implementere meste åpen kildekode og åpne ressurser tilgang bioinformatikk for tolkningen av legemiddelresistens og generering av rapporter for klinisk ledelse.
Det ble vist gjennom sammenligning med FDA godkjente Viroseq genotyping metode for å værenøyaktig i å identifisere legemiddelresistens mutasjoner fra et panel av ANRS kvalitetstestprøver, i 100% av laboratoriepanelprøver som ble vellykket forsterket. Nøyaktigheten ble også vurdert på kliniske prøver av subtype C virus, den mest dominerende subtype i det sørlige Afrika. Fremgangsmåten var nøyaktig som på undertype C-prøvene som det var på undertype A og B. Imidlertid, hvis fremgangsmåten skal anvendes i andre deler av verden hvor CRF02_AG er utbredt, er det behov for modifisering av de primere ettersom metoden unnlatt å forsterke en av panelprøver som ble vist å ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenerert sett av primere som er følsomme for alle gruppe M virus 33, 36 kan anvendes i områder hvor subtype fordelingen er mer heterogen 38..
Følsomheten av revers transkripsjon og PCR kan økes ved å ekstrahere RNA fra høyere volumer av plasma, for eksempel 500 ml. Plasmaet kan sentrifugeuged på 21 000 xg i 90 min å konsentrere viruspartikler før du fortsetter med protokollen som beskrevet av QIAamp viral RNA ekstraksjon mini kit.
Som vist, har den nye metoden en ekstra fordel at den produserer omfattende rapporter for individuell pasientbehandling. Disse rapportene er en konsolidering av genotype, immunologiske og virologisk overvåkingsdata samt klinisk og behandlingshistorikk fra RegaDB. Dette er ledsaget av en detaljert laboratorie tolkning av motstandsprofil, etterfulgt av et like detaljert gjennomgang av pasientens kliniske historie samt behandling anbefalinger. Bruken av en spesialist med å gjennomgå rapportene og gi behandling anbefalinger for pasientene gir sårt tiltrengte mentorer for sykepleier utøvere samt uerfarne klinikere, som i økende grad gir ART i Sør-Afrika som en del av WHOs anbefalinger for oppgaven giring. Disse kliniskerapporter har vist seg å være effektive læremidler for klinikere med liten eller ingen erfaring i legemiddelresistens ledelse. Fra et pasientperspektiv, reduserer vår metode behovet for å reise til sentraliserte områder for å få tilgang til spesialist HIV-tjenester.
Dermed blir beskrevet protokoll som helhet gir en god plattform der HIV legemiddelresistens ledelse kan bli integrert, til en rimelig pris, i den behandling for HIV-infiserte individer sviktende ART. Dataene som genereres kan brukes for epidemiologiske formål å bedømme utviklingen og overføring av legemiddelresistens i samfunnet. Størrelsen på pol fragment generert er god nok for mer komplekse fylogenetisk analyse som vil gi bedre forståelse av epidemien på populasjonsnivå.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke alle kolleger som har gjort dette arbeidet mulig, spesielt Maya Balamane, Elizabeth Johnston hvit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, og Lungani Ndwandwe. Forfatterne vil også takke alle de ansatte i avdeling for helse og Afrika Senter personell som jobber Hlabisa HIV behandling og pleie Programme.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |