Pruebas de resistencia a los medicamentos para el VIH-1 en individuos infectados no respondían al tratamiento antirretroviral (ART) puede guiar futuras terapias y mejorar los resultados del tratamiento. Optimización de los resultados de salud individual y poblacional en la alta prevalencia del VIH, sino entornos con recursos limitados, en última instancia requerirá genotipado resistencia a los medicamentos asequibles y accesibles y los métodos de interpretación.
VIH-1 resistencia a los medicamentos tiene el potencial de comprometer seriamente la eficacia y el impacto de la terapia antirretroviral (ART). Como los programas de TAR en África subsahariana siguen expandiéndose, las personas en tratamiento antirretroviral deben ser estrechamente monitorizados para la aparición de resistencia a los medicamentos. La vigilancia de la farmacorresistencia transmitida para rastrear la transmisión de cepas virales resistentes a los antirretrovirales ya es también crítico. Desafortunadamente, las pruebas de resistencia a los medicamentos aún no es de fácil acceso en los entornos con recursos limitados, ya que la genotipificación es caro y requiere de laboratorio sofisticado y la infraestructura de gestión de datos. Un acceso abierto método de seguimiento de la resistencia genotípica al fármaco para gestionar personas y evaluar la resistencia a fármacos de transmisión se describe. El método utiliza el software libre de código abierto para la interpretación de los patrones de resistencia a los medicamentos y la generación de informes individuales de los pacientes. El protocolo de determinación del genotipo tiene una tasa de amplificación de más de un 95% para las muestras de plasma con AVcarga iral> 1000 VIH-1 RNA copias / ml. La sensibilidad disminuye significativamente para cargas virales <1.000 copias de ARN del VIH-1 / ml. El método descrito aquí se valida con un método para el VIH-1 resistencia a los fármacos de ensayo aprobados por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (FDA), el método de genotipificación ViroSeq. Limitaciones del método descrito aquí incluyen el hecho de que no está automatizado y que también falló para amplificar la forma circulante CRF02_AG recombinante a partir de un panel de validación de muestras, aunque se amplificó subtipos A y B de la misma panel.
La epidemia de VIH en el sur de África ha ido evolucionando rápidamente 1 con un aumento exponencial concomitante en los individuos en terapia antirretroviral (ART), especialmente en el sur de África 2, 3. Como evidencia del impacto epidemiológico de los programas de tratamiento a gran escala en la reducción de la incidencia de 4 y el aumento de la esperanza de vida en los entornos con recursos limitados (RLS) 5 continúa acumulándose, se intensificarán los esfuerzos para aumentar la cobertura de ART. La evolución de las directrices para el uso del tratamiento como herramienta de prevención 6, 7, bajo la prueba y los programas de tratamiento significa que el número absoluto de personas en tratamiento se incrementará aún más. Un gran número de personas estarán en ART durante períodos más largos de tiempo ya que la esperanza media de vida de las personas en tratamiento antirretroviral se acerca a la de la población no infectada por VIH 8. El desarrollo y la transmisión de la farmacorresistencia del VIH tiene always sido considerado una amenaza para los logros de la ART 12.9. Por lo tanto, hay una necesidad de más rigurosa vigilancia y el control de la resistencia a fármacos como se inician más individuos en ART.
Efectuar pruebas de resistencia genotípica de drogas (TRB) se ha utilizado con éxito en los países desarrollados, tanto para la vigilancia y el monitoreo del VIH-1 resistencia a los medicamentos en las personas que reciben tratamiento antirretroviral. En esta configuración, GRT se ha integrado en la continuidad de la atención para el VIH-1 en individuos infectados. La mayoría de las guías internacionales recomiendan TRB para adultos y pacientes pediátricos en su defecto ART (de primera línea y de segunda línea) 13-15, los pacientes pediátricos expuestos a la prevención de la transmisión materno-infantil (PTMI) regímenes pero posteriormente infectan 16, y en entornos con altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión entre las personas con infección aguda 13-15. Sin embargo, los requisitos de coste, la tecnología y la infraestructura han limitado la implementaciónción de enfoques similares para la supervisión resistencia a los medicamentos en el SPI.
El tratamiento de Sudáfrica el VIH y las directrices de seguimiento no se recomienda actualmente el uso de toneladas de registro bruto en la orientación de la elección de la terapia antirretroviral para las personas que fallan regímenes de primera línea 17. Las personas se conectan basado principalmente en virológica parámetros (VIH-1 RNA carga viral). Sin embargo en 2012, el sur de África Los clínicos Sociedad VIH publicó las primeras directrices de las pruebas de resistencia de drogas ARV África del Sur 18. Estas directrices recomiendan las pruebas TRB para todos los adultos en su defecto de primera línea y de segunda línea y para los bebés y niños infectados expuestos a pMTCT 18. Sin embargo, GRT, no se recomienda para las personas de 18 infectados en forma aguda debido a que no hay evidencia actual de altos niveles de resistencia a los medicamentos de transmisión en el sur de África 19-29. Se espera que algunas de estas recomendaciones se integrarán con el tiempo en el tre nacionaldirectrices tamiento y seguimiento de los distintos países de la región. Ya en los 2013 las directrices de tratamiento de Sudáfrica ahora hay recomendación del GRT en el momento del fallo de segunda línea para adultos y al momento de la falla régimen basado en IP de primera o de segunda línea para los niños 30.
Se ha demostrado que la incorporación de TRB en las guías de tratamiento en Sudáfrica sería potencialmente costo-neutral. Teniendo en cuenta el costo de los medicamentos de segunda línea régimen que son relativamente más caros que los fármacos de primera línea, utilizando TRB para identificar a los pacientes que realmente necesitan ser cambiado a la terapia de segunda línea no supondrá ningún coste adicional para el programa. Además, GRT también puede identificar otras razones para el fracaso, la conservación de las opciones de tratamiento y generar información sobre los patrones de resistencia emergentes 31. Por lo tanto, es necesario para reducir el coste de los métodos de monitoreo de resistencia a fármacos aún más con el fin de mejorar el acceso, la calidad de un cuidadolos resultados d.
A continuación, presentamos un método TRB destinados a utilizar (de código abierto) cebadores genéricos para la transcripción reversa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación (Tabla 1), así como software de código abierto en su mayoría para la interpretación resistencia a los medicamentos. Para la gestión clínica, el protocolo se complementa con un método integral y notificando a la interpretación especialista del informe resistencia a los medicamentos de laboratorio con una estrecha adhesión a las directrices nacionales de tratamiento. El protocolo se divide en cuatro componentes diferentes: 1) Ácido VIH ribonucleico (ARN) Extracción, 2) transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación de dianas virales, 3) Secuenciación y 4) los métodos de bioinformática para el análisis de los cromatogramas, alineación, curación y la interpretación de los datos de secuencia.
Varios de bajo costo métodos internos se han descrito en los esfuerzos para tratar de hacer el genotipado de resistencia del VIH más asequible 33, 34, 36. No hay duda de la necesidad de integrar las pruebas de resistencia a los medicamentos en el continuo de la atención a las personas en tratamiento antirretroviral en entornos con recursos limitados. Sin embargo, la mayoría de los métodos denunciados se centran en la aplicación de genotipado resistencia a los medicamentos en la vigilancia de la resistencia a los medicamentos a nivel de población. El método de genotipificación SATURN / Life Technologies es un protocolo totalmente integrado para la vigilancia y el seguimiento de la farmacorresistencia. Este método fue diseñado para ser un protocolo asequible implementar fuente mayoría abiertos y abiertas recursos bioinformáticos de acceso para la interpretación de la resistencia a los medicamentos y la generación de informes para la gestión clínica.
Se ha demostrado a través de la comparación con el método de genotipificación ViroSeq aprobado por la FDA para serprecisa en la identificación de mutaciones de resistencia a medicamentos de un panel de muestras de ensayos de aptitud ANRS, en el 100% de las muestras del panel de laboratorio que fueron amplificados con éxito. La precisión también se evaluó en muestras clínicas de los virus del subtipo C, el subtipo más dominante en el sur de África. El método era tan precisa sobre muestras del subtipo C, ya que era el subtipo A y B. Sin embargo, si el método se utiliza en otras partes del mundo donde CRF02_AG es frecuente, hay una necesidad para la modificación de los cebadores ya que el método fallado para amplificar una de las muestras de panel que ha demostrado tener CRF02_AG. Alternativamente, un conjunto degenerado de cebadores sensibles a todos los virus del grupo M 33, 36 podría ser utilizado en regiones en las que la distribución subtipo es más heterogéneo 38.
La sensibilidad de la transcripción inversa y la PCR se puede aumentar mediante la extracción de ARN a partir de mayores volúmenes de plasma, tales como 500 ml. El plasma se puede Centrifuged a 21.000 xg durante 90 minutos para concentrar las partículas virales antes de proceder con el protocolo descrito por el mini-kit de extracción de ARN viral QIAamp.
Como se muestra, el nuevo método tiene una ventaja adicional que produce informes completos para la gestión individual del paciente. Estos informes son una consolidación del genotipo, el inmunológico y los datos de vigilancia virológica, así como la historia clínica y el tratamiento de RegaDB. Esto va acompañado de una interpretación de laboratorio detallada del perfil de resistencia seguida de un examen igualmente detallada de la historia clínica del paciente, así como recomendaciones de tratamiento. La utilización de un médico especialista para revisar los informes y proporcionar recomendaciones de tratamiento para los pacientes ofrece la tutoría muy necesaria para los profesionales de enfermería, así como a los médicos sin experiencia, que están proporcionando cada vez ART en Sudáfrica como parte de las recomendaciones de la OMS para el cambio de tareas. Estos clínicainformes han demostrado ser medios de enseñanza eficaces para los médicos con poca o ninguna experiencia en la gestión de resistencia a los medicamentos. Desde la perspectiva del paciente, nuestro método reduce la necesidad de viajar a sitios centralizados para acceder a los servicios de VIH especializados.
Por lo tanto, el protocolo descrito considerado en su conjunto ofrece una buena plataforma a través del cual la gestión de la resistencia del VIH se puede integrar, a un costo accesible, en la continuidad de la atención a las personas infectadas por el VIH no ART. Los datos generados se pueden usar para fines epidemiológicos para evaluar la evolución y la transmisión de la resistencia a los medicamentos en la comunidad. El tamaño del fragmento pol generado es lo suficientemente bueno para el análisis filogenético más complejo que producirá mejor comprensión de la epidemia a nivel de la población.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean dar las gracias a todos los colegas que hicieron posible este trabajo, especialmente Maya Balamane, Elizabeth Johnston Blanco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott y Lungani Ndwandwe. Los autores también desean agradecer a todo el personal del Departamento de Salud y personal de África Centro que trabajan el Tratamiento del VIH Hlabisa y el Programa de Atención.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |