Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.
HIV-1 resistentie heeft de potentie om de effectiviteit en impact van antiretrovirale therapie (ART) ernstig in gevaar brengen. Zoals ART-programma's in sub-Sahara Afrika verder uit te breiden, moeten individuen op ART nauwlettend worden gecontroleerd op het ontstaan van resistentie. Surveillance verzonden resistentie transmissie van virale stammen al resistent ART volgen is ook kritisch. Helaas, resistentie testen is nog steeds niet gemakkelijk toegankelijk met beperkte middelen, want genotypering is duur en vereist geavanceerde laboratorium-en datamanagement-infrastructuur. Een open toegang genotypische resistentie controle methode om individuen te beheren en te beoordelen overgedragen resistentie wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gratis open source software voor de interpretatie van resistentie patronen en het genereren van individuele patiënt rapporten. De genotypering protocol heeft een versterkingsfactor van meer dan 95% voor plasma monsters met avIral load> 1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De gevoeligheid aanzienlijk vermindert virale lading <1000 HIV-1 RNA kopieën / ml. De hier beschreven methode werd gevalideerd aan de hand van een methode van HIV-1 drug-resistentie testen goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), de Viroseq genotyperingsmethode. Beperkingen van de hier beschreven werkwijze is het feit dat het niet geautomatiseerd en dat deze evenmin de circulerende recombinante vorm CRF02_AG een validatie panel monsters versterken, hoewel versterkt subtypes A en B van hetzelfde paneel.
De HIV-epidemie in zuidelijk Afrika is snel 1 evolueren met een gelijktijdige exponentiële toename van individuen op antiretrovirale therapie (ART), met name in Zuid-Afrika 2, 3. Als bewijs van de epidemiologische gevolgen van grootschalige behandelprogramma's in het verminderen van de incidentie 4 en stijgende levensverwachting in gebieden met beperkte middelen (RLS) 5 blijft ophopen, zal inspannen om ART dekking te verhogen worden geïntensiveerd. De evolutie van de richtlijnen voor het gebruik van de behandeling als preventief instrument 6, 7 onder het testen en behandelen van programma's betekent dat het absolute aantal mensen op behandeling verder zal toenemen. Grote aantallen individuen zal op ART voor langere tijd als de gemiddelde levensverwachting van mensen op ART nadert dat van de HIV-geïnfecteerde populatie 8. De ontwikkeling en overdracht van HIV resistentie heeft always beschouwd als een bedreiging voor de verworvenheden van ART 9-12. Er is dus een noodzaak van een strengere bewaking en monitoring van resistentie als meer mensen worden geïnitieerd op ART.
Genotypische resistentie testen (BRT) is met succes gebruikt in de ontwikkelde landen, zowel voor het toezicht en de monitoring van HIV-1 drug-resistentie bij personen die ART. In deze instellingen, is GRT is geïntegreerd in het continuüm van de zorg voor HIV-1 geïnfecteerde individuen. De meeste internationale richtlijnen adviseren BRT voor volwassen patiënten of kinderen niet ART (eerste lijn en tweede lijn) 13-15, pediatrische patiënten blootgesteld aan preventie van moeder-op-kind overdracht (pMTCT) regimes maar vervolgens geïnfecteerd 16, en in de instellingen met hoge niveaus van overdraagbare resistentie onder acuut geïnfecteerde individuen 13-15. Echter, de kosten, technologie en infrastructuur eisen de uitvoering beperktlegging van een soortgelijke aanpak om resistentie controle in RLS.
De Zuid-Afrikaanse hiv-behandeling en richtsnoeren voor monitoring op dit moment geen gebruik van BRT in het begeleiden van de keuze van ART voor individuen niet de eerste lijn regimes 17 aanraden. Individuen ingeschakeld voornamelijk gebaseerd op virologische (HIV-1-RNA virale last) parameters. Maar in 2012, de Zuid-Afrikaanse HIV Artsen Society publiceerde de eerste Zuid-Afrikaanse ARV resistentietest richtlijnen 18. Deze richtlijnen bevelen brt testen voor alle volwassenen falende eerste lijn en tweede lijn ART en voor geïnfecteerde zuigelingen en kinderen blootgesteld aan pMTCT 18. Echter, brt niet aanbevolen 18 voor acuut geïnfecteerde individuen, omdat er geen actueel bewijs voor hoge niveaus van overdraagbare resistentie in zuidelijk Afrika 19-29. Verwacht wordt dat sommige van deze aanbevelingen worden geïntegreerd over de tijd in de nationale treatment en monitoring richtlijnen van de verschillende landen in de regio. Reeds in de 2013 Zuid-Afrikaanse behandelrichtlijnen is er nu aanbeveling van GRT op het moment van de tweede lijn mislukking voor volwassenen en op het moment van eerste-of tweede-lijn PI-gebaseerde regime mislukking voor kinderen 30.
Het is aangetoond dat de integratie van BRT in behandelingsrichtlijnen in Zuid-Afrika potentieel kosten-neutraal zou zijn. Gezien de kosten van de tweede lijnregime geneesmiddelen die relatief duurder dan de eerste lijn drugs, met BRT in patiënten die echt moeten worden geschakeld tweede lijn therapie identificeren extra kosten voor het programma niet optreden. Daarnaast kunnen BRT zich ook over andere redenen voor het falen, conserveren behandelingsopties en het genereren van informatie over opkomende resistentie patronen 31. Daarom moeten de kosten van resistentie bewakingsmethoden verder om de toegang, de kwaliteit van de zorg een verbetering verminderend resultaten.
Hier presenteren we een BRT methode ontworpen om generieke (open source) primers gebruikt voor reverse transcriptie polymerase-kettingreactie (PCR) en sequentie (tabel 1), en meestal openbron resistentie interpretatie. Voor klinische behandeling, is het protocol aangevuld door een uitgebreide evaluatie en rapportage methode met gespecialiseerde interpretatie van het laboratorium resistentie rapport met dicht naleving van de nationale behandelrichtlijnen. Het protocol bestaat uit vier componenten: 1) HIV ribonucleïnezuur (RNA) extractie, 2) reverse transcriptie en polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie van virale targets, 3) Sequencing 4) Bioinformatics voor de analyse van chromatogrammen, uitlijning, curation en interpretatie van sequence data.
Verschillende lage kosten in-house methoden zijn beschreven in inspanningen om te proberen aan HIV resistentie genotypering meer betaalbare 33, 34, 36 te maken. Er is geen twijfel over de noodzaak om resistentie testen te integreren in het continuüm van zorg voor individuen op antiretrovirale therapie in gebieden met beperkte middelen. Echter, de meeste van de gerapporteerde methoden richten op de toepassing van resistentie genotypering in de surveillance van resistentie op populatieniveau. De Saturn / Life Technologies genotyperingsmethode is een volledig geïntegreerde protocol voor het toezicht en de controle van resistentie. Deze methode is ontworpen om een betaalbare protocol implementeren meestal open source en open middelen toegang bioinformatica voor de interpretatie van resistentie en het genereren van rapporten voor klinische behandeling zijn.
Het werd aangetoond door vergelijking met de FDA goedgekeurde Viroseq genotyperingsmethode tenauwkeurig in het identificeren van resistentie mutaties van een panel van ANRS bekwaamheidstesten monsters, in 100% van het laboratorium panel monsters die met succes werden versterkt. De nauwkeurigheid werd ook beoordeeld op klinische monsters van subtype C virussen, de meest dominante subtype in zuidelijk Afrika. De werkwijze was zo nauwkeurig op subtype C monsters als op subtype A en B. Indien de werkwijze worden gebruikt in andere delen van de wereld waar CRF02_AG voorkomt, is het noodzakelijk dat de wijziging van de primers omdat de werkwijze niet een van het paneel monsters die bleek CRF02_AG hebben amplificeren. Als alternatief, een gedegenereerde set primers die gevoelig zijn voor alle groep M virussen 33, 36 kan worden gebruikt in regio's waar het subtype verdeling is heterogener 38.
De gevoeligheid van de reverse transcriptie en PCR kan worden verhoogd door het extraheren van RNA uit hogere volumes plasma, bijvoorbeeld 500 ml. Het plasma kan worden CENTRIFuged bij 21.000 xg gedurende 90 min om de virale deeltjes concentreren voordat u verder gaat met het protocol zoals beschreven door de QIAamp virale RNA-extractie mini kit.
Zoals getoond, de nieuwe methode een extra voordeel dat het produceert uitgebreide rapporten voor individuele Patiëntenzorg. Deze rapporten zijn een consolidatie van het genotype, de immunologische en virologische monitoringgegevens evenals de klinische en behandeling geschiedenis van RegaDB. Dit wordt vergezeld van een gedetailleerde laboratorium interpretatie van de weerstand profiel, gevolgd door een even gedetailleerd overzicht van de klinische voorgeschiedenis van de patiënt, alsmede aanbevelingen behandeling. Het gebruik van een gespecialiseerde artsen om de rapporten te beoordelen en aanbevelingen behandeling voor de patiënten biedt de broodnodige mentorschap voor nurse practitioners als onervaren artsen, die steeds meer het verstrekken van ART in Zuid-Afrika in het kader van de aanbevelingen van de WGO voor de taak verschuiven. Deze klinischerapporten is gebleken dat effectieve leermiddelen voor clinici met weinig of geen ervaring met resistentie management. Vanuit een patiënt perspectief onze werkwijze vermindert de noodzaak om te reizen naar centrale locaties om HIV gespecialiseerde diensten.
Zo is de beschreven protocol als geheel biedt een goed platform waarlangs HIV resistentie management kan worden geïntegreerd, tegen een betaalbare prijs, in het continuüm van zorg voor HIV-geïnfecteerde individuen falende ART. De gegenereerde data kan gebruikt worden voor epidemiologische doeleinden om de evolutie en de transmissie van resistentie in de gemeenschap te beoordelen. De grootte van de pol fragment gemaakt goed genoeg voor complexere fylogenetische analyse die beter begrip van de epidemie zal produceren op populatieniveau.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag alle collega's die dit werk mogelijk gemaakt, vooral Maya Balamane, Elizabeth Johnston Wit, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty erkennen , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, en Lungani Ndwandwe. De auteurs willen ook graag al het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en het Africa Centre personeel dat de Hlabisa HIV behandeling en zorg programma werken bedanken.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |