Test di resistenza ai farmaci per l'HIV-1 individui infetti in mancanza di terapia antiretrovirale (ART) in grado di guidare le terapie future e migliorare i risultati del trattamento. Ottimizzazione dei singoli e della popolazione esiti di salute in alta prevalenza di HIV, ma a risorse limitate in ultima analisi richiederà conveniente e accessibile genotipizzazione resistenza ai farmaci e metodi di interpretazione.
HIV-1 farmacoresistenza ha il potenziale di compromettere seriamente l'efficacia e l'impatto della terapia antiretrovirale (ART). Poiché i programmi ART nell'Africa sub-sahariana continuano ad espandersi, gli individui su ART devono essere attentamente monitorati per la comparsa di resistenza ai farmaci. Sorveglianza della resistenza trasmessa farmaco per monitorare la trasmissione di ceppi virali resistenti ai già ART è anche critico. Purtroppo, test di resistenza ai farmaci non è ancora facilmente accessibile nelle impostazioni limitate risorse, perché la genotipizzazione è costosa e richiede sofisticate di laboratorio e infrastruttura di gestione dei dati. Un genotipica metodo di monitoraggio farmacoresistenza accesso aperto per gestire gli individui e valutare la resistenza ai farmaci trasmesso e descritta. Il metodo utilizza il software libero e open source per l'interpretazione dei modelli di resistenza ai farmaci e la generazione di report dei singoli pazienti. Il protocollo genotipizzazione ha un indice di amplificazione superiore al 95% per i campioni di plasma con avcarico Iral> 1,000 HIV-1 RNA copie / ml. La sensibilità diminuisce in modo significativo per carica virale <1.000 copie di HIV-1 RNA / ml. Il metodo qui descritto è stato validato nei confronti di un metodo di HIV-1 resistenza Drug Testing approvata dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA), il metodo di genotipizzazione Viroseq. Limiti del metodo qui descritto comprendono il fatto che non è automatizzato e che essa non anche per amplificare la forma circolante CRF02_AG ricombinante da un gruppo di validazione di campioni, anche se amplificato sottotipi A e B dello stesso pannello.
L'epidemia di HIV in Africa australe si è evoluto rapidamente 1 con un aumento esponenziale concomitante persone in terapia antiretrovirale (ART), soprattutto in Sud Africa 2, 3. Come prova sull'impatto epidemiologico dei programmi di trattamento su larga scala nel ridurre l'incidenza 4 e aumentando l'aspettativa di vita in contesti a risorse limitate (RLS) 5 continua ad accumularsi, saranno intensificati gli sforzi per aumentare la copertura ART. L'evoluzione di orientamenti verso l'uso del trattamento come strumento di prevenzione 6, 7 sotto test e programmi di trattamento significa che il numero assoluto di individui in trattamento aumenterà ulteriormente. Un gran numero di persone saranno in ART per periodi di tempo più lunghi come l'aspettativa di vita media degli individui su ART si avvicina a quella della popolazione infetta da HIV 8. Lo sviluppo e la trasmissione di resistenza ai farmaci HIV ha Always stato considerato una minaccia per le conquiste della ART 9-12. Pertanto, vi è la necessità per la sorveglianza ed il monitoraggio della resistenza ai farmaci più rigorosa come più individui sono avviate su ART.
Test di resistenza ai farmaci genotipica (TSL) è stato utilizzato con successo nei paesi sviluppati, sia per la sorveglianza e il monitoraggio del virus HIV-1 farmaco-resistenza nei soggetti trattati con ART. In queste impostazioni, TSL è stato integrato nel continuum di cura per l'HIV-1 individui infetti. La maggior parte delle linee guida internazionali raccomandano tsl per i pazienti pediatrici mancanza ART (di prima linea e di seconda linea) 13-15 adulto o, pazienti pediatrici esposti alla prevenzione della trasmissione da madre a figlio (PMTCT) regimi, ma successivamente infettati 16, e in ambienti con alti livelli di resistenza trasmessa droga tra gli individui con infezione acuta 13-15. Tuttavia, il costo, la tecnologia e infrastruttura, hanno limitato l'attuazionezione di approcci simili alla droga monitoraggio della resistenza in RLS.
Il trattamento South African HIV e il monitoraggio attualmente non raccomandano l'uso di tsl nel guidare la scelta di ART per gli individui in mancanza di prima linea regimi 17. Gli individui sono accesi basata principalmente su parametri (carico virale di HIV-1 RNA) virologica. Tuttavia, nel 2012, il Southern African HIV clinici Society ha pubblicato le prime linee guida del Sud ARV africana test resistenza ai farmaci 18. Queste linee guida raccomandano test tsl per tutti gli adulti in mancanza di prima linea e di seconda linea ART e per i neonati infetti e bambini esposti a PMTCT 18. Tuttavia, TSL non è raccomandato 18 per gli individui con infezione acuta perché non ci sono evidenze attuali livelli elevati di resistenza ai farmaci trasmessa in Sud Africa 19-29. Si prevede che alcune di queste raccomandazioni saranno integrati nel tempo in tre nazionaliatment e monitoraggio linee guida dei vari paesi della regione. Già, in 2013 linee guida di trattamento sudafricani ora c'è la raccomandazione di tsl al momento del guasto di seconda linea per gli adulti e al momento del guasto regime basato-PI-prima o seconda linea per i bambini 30.
E 'stato dimostrato che l'integrazione GRT nelle linee guida di trattamento in Sud Africa sarebbe potenzialmente costo-neutrale. Considerando il costo dei farmaci di seconda linea di regime che sono relativamente più costosi rispetto ai farmaci di prima linea, con TSL per identificare i pazienti che hanno veramente bisogno di essere passato a terapia di seconda linea non comporterà alcun costo aggiuntivo per il programma. Inoltre, GRT può anche identificare altre ragioni per il fallimento, conservare le opzioni di trattamento e generare informazioni sui modelli di resistenza emergenti 31. Pertanto, è necessario ridurre il costo di metodi di monitoraggio della farmaco resistenza ulteriormente per migliorare l'accesso, la qualità delle cure und esiti.
Qui, vi presentiamo un metodo GRT progettato per utilizzare generici (open source) primer per la trascrizione inversa, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento (Tabella 1), così come il software open source per lo più per l'interpretazione resistenza ai farmaci. Per la gestione clinica, il protocollo è accompagnato da una revisione e reporting metodo completo con l'interpretazione specialista del farmaco rapporto resistenza laboratorio con stretta aderenza alle linee guida nazionali di trattamento. Il protocollo è diviso in quattro componenti differenti; 1) HIV Acido ribonucleico (RNA) Estrazione, 2) trascrizione inversa e Polymerase Chain Reaction (PCR) amplificazione di bersagli virali, 3) sequenziali e 4) metodi bioinformatici per l'analisi dei cromatogrammi, allineamento, curation e l'interpretazione dei dati di sequenza.
Diversi low cost metodi in-house sono state descritte negli sforzi per cercare di rendere l'HIV farmaco-resistenza genotipizzazione più abbordabile 33, 34, 36. Non vi è alcun dubbio sulla necessità di integrare test di resistenza ai farmaci nel continuum di cura per le persone in terapia antiretrovirale in paesi a risorse limitate. Tuttavia, la maggior parte dei metodi riportati riguardare l'applicazione di farmacoresistenza genotipizzazione nella sorveglianza della resistenza ai farmaci a livello di popolazione. Il metodo di genotipizzazione Saturno / Life Technologies è un protocollo completamente integrato per la sorveglianza e il monitoraggio della resistenza ai farmaci. Questo metodo è stato progettato per essere un protocollo di attuazione conveniente soprattutto open source e aperto le risorse di bioinformatica di accesso per l'interpretazione della resistenza ai farmaci e la generazione di report per la gestione clinica.
E 'stato dimostrato attraverso il confronto con il metodo di genotipizzazione Viroseq approvato dalla FDA per essereaccurate per identificare mutazioni di resistenza droga da un panel di ANRS campioni di prova di abilità, nel 100% dei campioni di pannelli di laboratorio che sono stati amplificati con successo. La precisione è stata valutata anche su campioni clinici di virus sottotipo C, il sottotipo più dominante in Africa australe. Il metodo era esatto sul sottotipo campioni C come era il sottotipo A e B. Tuttavia, se il metodo potrebbe essere utilizzato in altre parti del mondo dove CRF02_AG è prevalente, vi è la necessità per la modifica dei primer in quanto il metodo fallito per amplificare uno dei campioni del pannello che è stato dimostrato di avere CRF02_AG. In alternativa, una serie di primer degenerato sensibili a tutto gruppo M virus 33, 36 potrebbe essere utilizzata in regioni in cui la distribuzione sottotipo è più eterogenea 38.
La sensibilità della trascrizione inversa e PCR può essere aumentata con l'estrazione di RNA da maggiori volumi di plasma, come 500 ml. Il plasma può essere centrifuged a 21.000 xg per 90 min a concentrare le particelle virali prima di procedere con il protocollo come descritto dal mini kit di estrazione di RNA virale QIAamp.
Come mostrato, il nuovo metodo ha un ulteriore vantaggio che produce rapporti completi per la gestione del singolo paziente. Queste relazioni sono un consolidamento del genotipo, il immunologici e virologici dati di monitoraggio così come la storia clinica e il trattamento da RegaDB. Questo è accompagnato da una interpretazione laboratorio dettagliata del profilo di resistenza seguita da una revisione altrettanto dettagliata della storia clinica del paziente e raccomandazioni di trattamento. L'utilizzo di un medico specialista per esaminare i rapporti e fornire raccomandazioni per il trattamento per i pazienti fornisce mentorship tanto necessaria per infermieri e medici inesperti, che sono sempre forniscono ART in Sud Africa come parte delle raccomandazioni dell'OMS per le attività di spostamento. Questi clinicarelazioni hanno dimostrato di essere strumenti didattici efficaci per i medici con poca o nessuna esperienza nella gestione della resistenza ai farmaci. Dal punto di vista del paziente, il nostro metodo riduce la necessità di recarsi in luoghi centralizzati per accedere ai servizi di HIV specialistici.
Pertanto, il protocollo descritto nel suo complesso offre una buona piattaforma attraverso la quale l'HIV gestione farmacoresistenza può essere integrato, ad un costo accessibile, nel continuum di cure per individui infetti da HIV in mancanza ART. I dati generati possono essere usate per scopi epidemiologici per valutare l'evoluzione e trasmissione di farmacoresistenza nella comunità. La dimensione del frammento pol generato è sufficiente per più complessa analisi filogenetica che produrrà una migliore comprensione della epidemia a livello di popolazione.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi che hanno reso possibile questo lavoro, in particolare Maya Balamane, Elizabeth Johnston Bianco, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, e Lungani Ndwandwe. Gli autori desiderano inoltre ringraziare tutto il personale del Dipartimento di Salute e personale Africa Centro che lavorano la Hlabisa trattamento di HIV e il programma Care.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |