항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.
HIV-1 약 저항은 심각 항 레트로 바이러스 치료 (ART)의 효과 및 영향을 손상시킬 가능성이있다. 사하라 사막 이남의 아프리카에있는 예술 프로그램을 계속 확장으로, 예술에 개인은 밀접하게 약제 내성의 출현을 감시해야한다. ART에 이미 내성 바이러스 균주의 전송을 추적 할 수있는 전송 약물 저항의 감시도 중요합니다. 유전자형이 비싸고 정교한 실험 및 데이터 관리 인프라를 필요로하기 때문에 불행하게도, 약제 내성 검사는 여전히 자원 제한 설정에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 개인 관리 및 전송 약제 내성을 평가하기 위해 오픈 프리 유전형 약제 내성 모니터링 방법을 설명한다. 이 방법은 약제 내성 패턴의 해석과 개별 환자 보고서의 생성을위한 무료 오픈 소스 소프트웨어를 사용합니다. 유전자형 프로토콜은 AV와 혈장보다 큰 95 %의 증폭 율이iral로드> 1000 HIV-1 RNA에 복사 / ㎖. 감도는 바이러스 부하 <1000 HIV-1 RNA에 복사 / ㎖에서 상당히 감소한다. 여기에 설명 된 방법은 미국 식품의 약국 (FDA), Viroseq 유전자형 방법에 의해 승인 된 테스팅을 HIV-1 약물 저항의 방법에 대하여 검증 하였다. 여기에 기술 된 방법의 제한은 자동화하고 동일한 패널 아형 및 B를 증폭 있지만 그것은 또한, 샘플의 유효성 패널 순환 재조합 형태 CRF02_AG를 증폭 실패한되지 않는다는 사실을 포함한다.
남부 아프리카에서 HIV 전염병은 특히 남아프리카 공화국 2, 3, 항 레트로 바이러스 치료 (ART)에 개인의 동반 지수 증가와 함께 급속 한 발전하고있다. 발생 4를 줄이고 자원 제한 설정에서 기대 수명 (RLS)을 5 증가에 큰 규모의 치료 프로그램의 역학적 영향에 대한 증거로 축적 계속, 예술의 범위를 확대하기위한 노력이 강화 될 것이다. 검사 및 치료 프로그램에 따라 예방 도구 6, 7과 같은 치료의 사용으로 가이드 라인의 진화는 치료에 대한 개인의 절대 수는 더욱 증가 할 것을 의미합니다. 개인의 큰 숫자는 예술에 대한 개인의 평균 수명은 HIV에 감염되지 않은 인구 8의 가까워지면서 오랜 시간 동안 예술에있을 것입니다. HIV의 약제 내성의 발달 및 전송 ALWA 마련되어YS ART 9-12의 성과에 대한 위협으로 간주되었다. 따라서, 많은 개인은 ART에 개시 될 때보다 엄격한 감시 및 약물 저항의 모니터링을위한 필요성이 존재한다.
유전형 약제 내성 (GRT) 테스트는 감시뿐만 아니라 예술을받는 개인의 HIV-1 약제 내성 모니터링 모두 선진국에서 성공적으로 사용되어왔다. 이 설정에서, GRT는 HIV-1에 감염된 사람들을위한 치료의 연속성에 통합되었습니다. 대부분의 국제 가이드 라인은 성인이나 ART (첫 번째 줄과 두 번째 줄) 13-15 실패 소아 환자에 대한 GRT를 추천, 소아의 어머니에 아이 전송 (PMTCT)식이 요법의 예방에 노출 된 환자 만, 이후 16 감염과 함께 설정에서 심하게 감염된 개인 13 ~ 15 사이에서 전송 약물 저항의 높은 수준. 그러나, 비용, 기술 및 인프라 요구 사항은 implemen을 제한RLS의 약제 내성 감시와 유사한 접근 방법 테이션.
남아프리카 공화국 에이즈 치료 및 모니터링 가이드 라인은 현재 첫 선 17식이 요법 실패하는 사람들을위한 예술의 안내 선택에 GRT의 사용을 권장하지 않습니다. 개인은 주로 한 바이러스 (HIV-1 RNA 바이러스 부하) 매개 변수를 기반으로 전환됩니다. 그러나 2012 년, 남부 아프리카의 HIV 임상의 사회는 최초의 남부 아프리카의 ARV 약물 저항 테스트 가이드 라인 (18)을 발표했다. 이 지침은 첫 번째 줄과 두 번째 줄 ART 실패한 모든 성인과 PMTCT (18)에 노출 감염된 유아와 어린이를위한 GRT 테스트를 권장합니다. 남부 아프리카 19-29로 전송 약물 저항의 높은 수준에 대한 현재의 증거가 없기 때문에 그러나, GRT 심하게 감염된 개인에 대해 18을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 그것은 이러한 추천 몇몇 국가 트레으로 시간이 지남에 따라 통합 될 것으로 기대된다지역의 다양한 국가의 atment 및 모니터링 지침. 이미 2013 년 남아프리카 공화국의 치료 지침에 성인을위한 두 번째 라인 실패의 시간과 아이들 (30)에 대한 첫 번째 또는 두 번째 라인 PI 기반 요법의 실패시에 GRT의 추천은 지금있다.
그것은 남아 프리카 공화국에서 치료 지침에 GRT를 도입하는 것은 잠재적으로 비용 중립 될 것으로 나타났습니다. 진정으로 두 번째 라인 치료로 전환 할 필요가 환자를 식별하는 GRT를 사용하여, 상대적으로 고가의 첫 번째 줄의 약물보다 두 번째 라인 요법 약물의 비용을 고려하면 프로그램에 대한 추가 비용을 발생하지 않습니다. 또, GRT 또한, 실패 다른 이유를 식별 치료 옵션을 보존하고 신흥 저항 패턴 (31)에 대한 정보를 생성 할 수있다. 따라서, 더욱 프리, 케어의 질을 향상시키기 위해 약물 저항 모니터링 방법의 비용을 감소시킬 필요가D 결과.
여기서, 우리는 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 시퀀싱 (표 1)뿐만 아니라 약제 내성 해석 대부분 오픈 소스 소프트웨어 일반 (오픈 소스) 프라이머를 사용하도록 설계 GRT 방법을 제시한다. 임상 관리의 경우, 프로토콜은 국가의 치료 지침에 밀착성을 가진 실험실 약제 내성 보고서의 전문 해석과 함께 종합적인 검토 및보고 방법에 의해 칭찬. 프로토콜은 네 가지 구성 요소로 나누어 져 1) HIV 리보 핵산 (RNA) 추출, 2) 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 바이러스 성 대상의 확대, 3) 시퀀싱 및 크로마토 그램, 정렬의 분석을위한 4) 생물 정보학 방법, 큐 레이션 및 시퀀스 데이터의 해석.
여러 저렴한 비용으로 사내 방법은 33, 34, 36 HIV 약제 내성 유전자형이 더 저렴한 만들려고하는 노력에 설명되어있다. 자원 제한 설정에서 항 레트로 바이러스 치료에 대한 개인에 대한 치료의 연속체에 약물 저항 테스트를 통합 할 필요성 의심의 여지가 없다. 그러나,보고 된 방법 중 대부분은 집단 수준에서 약제 내성의 감시에 약제 내성 유전자형의 적용에 초점을 맞춘다. 토성 / 생활 기술의 유전자형 방법은 감시 및 약제 내성 감시를위한 완벽하게 통합 된 프로토콜입니다. 이 방법은 임상 관리에 대한 보고서의 약제 내성과 세대의 해석에 대부분 오픈 소스와 오픈 액세스 생물 정보학 자원을 구현하는 저렴한 프로토콜 될 수 있도록 설계되었습니다.
그것은 될 수있는 FDA 승인 Viroseq 유전자형 방법에 비교하여 나타내었다성공적으로 증폭 된 실험실 패널 샘플을 100 % ANRS 숙련도 시험 샘플의 패널에서 약제 내성 변이를 식별하는 정확한. 정확도는 또한 서브 타입 C 바이러스, 남부 아프리카에서 가장 지배적 인 하위 유형의 임상 샘플을 평가 하였다. 방법 CRF02_AG가 유행이다 세계의 다른 부분에 사용되는 경우에있어서 그것이 그러나 아형 및 B.에 있었던 것에 아형 C 샘플 최저 정확, 방법시기 프라이머의 변형이 필요하다 CRF02_AG을 표시했다 패널 샘플을 증폭하는 데 실패했습니다. 서브 타입의 분포가 38 이질적이고 또는 M (33)를 바이러스 모든 그룹에 민감 프라이머의 타락한 세트, 36 지역에서 사용할 수 있습니다.
역전사 및 PCR의 감도는 500 ㎖ 같은 플라즈마의 높은 볼륨에서 RNA를 추출함으로써 증가 될 수있다. 혈장은 원심 수QIAamp 바이러스 RNA 추출 미니 키트가 설명 된대로 프로토콜을 진행하기 전에 바이러스 입자를 집중하는 90 분 동안 21,000 XG에서 uged.
도시 된 바와 같이, 새로운 방법은 개별 환자 관리를위한 포괄적 인 보고서를 생성하는 추가적인 장점이 있습니다. 이 보고서는 RegaDB에서 유전자형의 통합, 면역 학적 및 바이러스 학적 모니터링 데이터뿐만 아니라 임상 치료의 역사입니다. 이것은 동일하게 상세한 환자의 임상 기록의 검토뿐만 아니라 치료 권장 다음에 저항 프로파일에 대한 자세한 실험 해석을 동반한다. 보고서를 검토하고 환자에 대한 치료 권장 사항을 제공하는 전문 의사의 사용은 간호사 실무자뿐만 아니라 점점 작업의 이동에 대한 WHO 권장 사항의 일환으로 남아프리카 공화국에있는 예술을 제공하고 경험이 임상에 대한 많이 필요한 멘토링을 제공한다. 이러한 임상보고서는 약제 내성 관리에 거의 또는 전혀 경험이있는 임상의를위한 효과적인 교재로 표시되었습니다. 환자 관점에서, 우리의 방법은 전문 HIV 서비스에 액세스하는 중앙 사이트에 여행 할 필요가 줄어 듭니다.
따라서, 전체적으로 촬영 기술 프로토콜은 HIV 약제 내성 관리는 HIV 감염자 실패 예술에 대한 치료의 연속체로, 저렴한 비용으로 통합 될 수있는 좋은 플랫폼을 제공합니다. 생성 된 데이터는 여행자의 약제 내성의 진화 및 전송을 평가하기 위해 역학적 목적을 위해 사용될 수있다. 생성 된 폴 조각의 크기는 인구 수준에서 전염병의 더 나은 이해를 만들어 더 복잡한 계통 발생 학적 분석에 충분합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는이 작품은 가능한 한 모든 동료, 특히 마야 Balamane, 엘리자베스 존스턴 화이트, 샤론 Sjoblom, 그렉 오르 딩 Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, 제임스 가비, 개빈 콥, Senzo Maphanga, Terusha Chetty을 인정하고 싶습니다 , Kevi Naidoo, 앤드류 Skingsley, 캐서린 스토트, 그리고 Lungani Ndwandwe. 저자는 또한 건강의 부와 Hlabisa HIV 치료 및 관리 프로그램을 작동 아프리카 센터 직원의 모든 직원에게 감사의 말씀을 전합니다.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |