Motstånd Drogtester för HIV-1 infekterade individer misslyckas antiretroviral terapi (ART) kan vägleda framtida terapier och förbättra behandlingsutfallet. Optimera individuella och befolkningshälsoresultat i hög hiv-prevalens men resursfattiga områden i slutändan kommer att kräva överkomliga och tillgängliga läkemedelsresistens genotypning och metoder för tolkning.
HIV-1 resistens har potential att allvarligt äventyra effektiviteten och effekten av antiretroviral terapi (ART). Som ART-program i Afrika söder om Sahara fortsätter att expandera, bör individer på ART övervakas noga för uppkomsten av läkemedelsresistens. Övervakning av de överförda läkemedelsresistens för att spåra överföringen av virala stammar som redan är resistenta mot ART är också kritisk. Tyvärr är drogresistensbestämning fortfarande inte lätt tillgängliga i resurs begränsade inställningar, eftersom genotypning är dyr och kräver avancerad laboratorie-och datahantering infrastruktur. En öppen tillgång genotypisk läkemedelsresistens övervakningsmetod för att hantera individer och bedöma överföras resistens beskrivs. Metoden använder fri programvara med öppen källkod för tolkning av drogresistensmönster och generering av enstaka patientrapporter. The genotyping protokollet har en förstärkningshastighet som överstiger 95% för plasmaprover med AViral belastning> 1000 HIV-1 RNA kopior / ml. Känsligheten minskar avsevärt för virusnivåer <1,000 HIV-1 RNA kopior / ml. Den metod som beskrivs här validerades mot en metod för HIV-1 resistens provning godkänt av den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration (FDA), den Viroseq genotypning metoden. Begränsningar av den metod som beskrivs här hör att det inte är automatiserad och att det inte heller förstärka cirkulerande rekombinanta formen CRF02_AG från en valideringspanel av prover, även om den förstärkta subtyper A och B från samma panel.
Hiv-epidemin i södra Afrika har snabbt 1 utvecklas med en samtidig exponentiell ökning av individer på antiretroviral behandling (ART), särskilt i Sydafrika 2, 3. Som bevis på den epidemiologiska effekterna av storskaliga behandlingsprogram för att minska förekomsten 4 och ökad förväntad livslängd i resursfattiga områden (RLS) 5 fortsätter att ackumuleras, kommer insatser för att öka ART täckning intensifieras. Utvecklingen av riktlinjer mot användningen av behandling som ett förebyggande verktyg 6, 7 under testet och behandla program innebär att det absoluta antalet individer på behandling kommer att öka ytterligare. Ett stort antal personer kommer att vara på ART för längre perioder som den genomsnittliga livslängden för individer på ART närmar sig den för HIV oinfekterade befolkningen 8. Utveckling och överföring av HIV resistens har Always ansetts vara ett hot mot resultaten av ART 9-12. Det finns således ett behov av mer rigorös kontroll och övervakning av läkemedelsresistens som fler individer initieras på ART.
Genotypisk resistens testar (BRT) har använts med framgång i utvecklade länder, både för övervakning och uppföljning av HIV-1 resistens hos personer som får ART. I dessa inställningar har BRT integrerats i vårdkedjan för HIV-1-infekterade individer. De flesta internationella riktlinjer rekommenderar BRT för vuxen eller barn misslyckas ART (första linjens och andra linjens) 13-15, barn som utsätts för förebyggande av mor-till barn (PMTCT) regimer men därefter smittade 16, och i miljöer med höga halter av överförd resistens hos akut infekterade individer 13-15. Däremot har kostnads, teknik och infrastruktur krav begränsat genomföranförandet av liknande metoder för läkemedelsresistens övervakning i RLS.
Den sydafrikanska HIV-behandling och övervakningsriktlinjer för närvarande inte rekommendera användning av BRT i att vägleda val av ART för individer misslyckas första linjens regimer 17. Individer kopplas främst baserad på virologiska (HIV-1-RNA virusmängd) parametrar. Men under 2012, Södra Afrikas HIV Clinicians Society publicerade de första sydliga riktlinjer Afrikanska ARV resistens testning 18. Riktlinjerna rekommenderar GRT testning för alla vuxna missar första linjens och andra linjens ART och för infekterade spädbarn och barn som utsätts för PMTCT 18. Dock är BRT rekommenderas inte 18 för akut infekterade individer eftersom det inte finns några aktuella bevis för höga nivåer av överförd resistens i södra Afrika 19-29. Det förväntas att en del av dessa rekommendationer kommer att integreras med tiden i den nationella Treatment och övervaknings riktlinjer i de olika länderna i regionen. Redan på 2013 sydafrikanska behandlingsriktlinjer finns det nu rekommendation av BRT vid andra linjens misslyckande för vuxna och vid första eller andra linjens PI-baserad behandling misslyckande för barn 30.
Det har visat sig att införliva BRT i behandlingsriktlinjer i Sydafrika skulle vara potentiellt kostnadsneutralt. Med tanke på kostnaden för den andra linjens behandling läkemedel som är relativt dyrare än första linjens läkemedel, med hjälp av BRT för att identifiera patienter som verkligen behöver byta till andra linjens behandling kommer inte att leda någon extra kostnad för programmet. Dessutom kan BRT också identifiera andra orsaker till misslyckanden, spara behandlingsalternativ och generera information om nya resistensmönster 31. Därför är det nödvändigt att minska kostnaderna för läkemedelsresistens övervakningsmetoder ytterligare i syfte att förbättra tillgängligheten, kvaliteten på vården end utfall.
Här presenterar vi ett BRT metod som syftar till att använda generiska (öppen källkod) primer för omvänd transkription, polymeraskedjereaktion (PCR) och sekvensering (tabell 1), samt mestadels öppen källkod för drogmotstånd tolkning. För klinisk behandling, är det protokoll som kompletteras av en omfattande översyn och rapporteringsmetod med specialist tolkning av laboratorie resistens rapport med nära anslutning till de nationella behandlingsriktlinjer. Protokollet är indelat i fyra olika delar, 1) HIV ribonukleinsyra (RNA) Utvinning, 2) Omvänd transkription och Polymerase Chain Reaction (PCR) av virala mål, 3) Sekvense och 4) bioinformatiska metoder för analys av kromatogram, anpassning, säkring och tolkning av sekvensdata.
Flera lågprisbolag interna metoder har beskrivits i arbetet med att försöka göra HIV-drogmotstånd genotypning billigare 33, 34, 36. Det råder ingen tvekan om behovet av att integrera resistens testning i vårdkedjan för individer på antiretroviral behandling i resursfattiga områden. Men de flesta av de rapporterade metoderna fokuserar på tillämpningen av läkemedelsresistens genotypning i övervakningen av läkemedelsresistens hos en befolkningsnivå. Saturn / Life Technologies genotypning metod är en helt integrerad protokoll för kontroll och övervakning av läkemedelsresistens. Denna metod var avsedd att vara ett prisvärt protokoll genomföra mestadels öppen källkod och öppna resurser åtkomst bioinformatik för tolkning av läkemedelsresistens och generering av rapporter för klinisk behandling.
Det visades genom jämförelse med FDA godkända Viroseq genotypning metod för att varakorrekt identifiera drogresistensmutationer från en panel av ANRS kvalifikationsprövning prover, i 100% av laboratoriepanelprover som framgångsrikt förstärks. Noggrannheten bedömdes också på kliniska prover av subtyp C-virus, den mest dominerande subtypen i södra Afrika. Metoden var så exakt på subtyp C-prov som det var på subtyp A och B. Men om metoden skulle kunna användas i andra delar av världen där CRF02_AG är utbredd, finns det ett behov av ändring av primers eftersom metoden misslyckades med att förstärka en av panelprover som visade sig ha CRF02_AG. Alternativt kan en degenererad uppsättning av primrar som är känsliga för alla grupp M virus 33, 36 skulle kunna användas i regioner där subtyp fördelningen är mer heterogen 38.
Känsligheten av omvänd transkription och PCR kan ökas genom att man extraherar RNA från större volymer av plasma, t.ex. 500 ml. Plasmat kan centrifuged vid 21.000 xg under 90 minuter för att koncentrera viruspartiklarna innan du fortsätter med det protokoll som beskrivs av QIAamp viralt RNA extraktion mini kit.
Såsom visas har det nya förfarandet en ytterligare fördel att den producerar omfattande rapporter för individuell behandling av patienten. Dessa rapporter är en konsolidering av genotyp, immunologiska och virologiska övervakningsuppgifter samt klinisk och behandlingshistorik från RegaDB. Detta åtföljs av en detaljerad laboratorie tolkning av resistensprofil följt av en lika detaljerad genomgång av patientens kliniska historia samt behandlingsrekommendationer. Användningen av en specialistläkare för att granska rapporterna och ger behandlingsrekommendationer för patienterna ger den välbehövliga mentorskap för sjuksköterskor såväl som oerfarna kliniker, som allt oftare tillhandahåller ART i Sydafrika som en del av WHO: s rekommendationer för uppgiften växling. Dessa kliniskarapporter har visat sig vara effektiva läromedel för kliniker med liten eller ingen erfarenhet av drogresistenshantering. Ur ett patientperspektiv, minskar vår metod behovet av att resa till centraliserade webbplatser för att få tillgång till specialist hiv-tjänster.
Således, den beskrivna protokollet som helhet ger en bra plattform, där HIV-läkemedelsresistens hantering kan integreras, till en rimlig kostnad, i vårdkedjan för HIV-infekterade individer misslyckas ART. De data som genereras kan användas för epidemiologiska syften att bedöma utvecklingen och överföring av resistens i samhället. Storleken på pol fragment genereras är bra nog för mer komplexa fylogenetisk analys som kommer att producera bättre förståelse av epidemin på befolkningsnivå.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla kolleger som gjort detta arbete möjligt, speciellt Maya Balamane, Elizabeth Johnston Vit, Sharon Sjöblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, och Lungani Ndwandwe. Författarna vill också tacka all personal på Institutionen för hälsa och Afrika Centre personal som arbetar i Hlabisa HIV Behandling och Omvårdnadsprogrammet.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |