Summary

Dans l'imagerie in vivo de Optic Nerve Fiber intégrité par IRM de contraste amélioré chez la souris

Published: July 22, 2014
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Summary

Cette vidéo illustre un procédé, en utilisant un T scanner clinique 3, pour l'imagerie RM de renforcement du contraste de la projection visuelle de la souris naïve et pour des études répétitives et longitudinaux in vivo de la dégénérescence du nerf optique associés à une lésion du nerf optique à l'écrasement aiguë et de la dégénérescence du nerf optique chronique dans souris knock-out (KO p50).

Abstract

Le système visuel de rongeur englobe les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones qui forment le nerf optique pour entrer centres thalamiques et du mésencéphale et projections post-synaptiques dans le cortex visuel. Sur la base de sa structure anatomique distinct et l'accessibilité pratique, il est devenu la structure privilégiée pour les études sur la survie neuronale, la régénération axonale et la plasticité synaptique. Les récents progrès dans l'IRM ont permis la visualisation in vivo de la partie rétino-tectale de cette projection à l'aide de manganèse médiation amélioration du contraste (MEMRI). Ici, nous présentons un protocole MEMRI pour illustration de la projection visuelle chez la souris, que les résolutions de (200 um) 3 peuvent être obtenus en utilisant communes à 3 Tesla. Nous montrons comment l'injection intravitréenne d'une dose unique de 15 nmol MnCI2 conduit à une amélioration saturé de la projection intact dans les 24 heures. A l'exception de la rétine, des changements dans l'intensité du signal sont indédent de la stimulation visuelle coïncidé ou vieillissement physiologique. Nous appliquons en outre cette technique pour suivre longitudinalement dégénérescence axonale suite à une lésion du nerf optique aiguë, un paradigme qui Mn 2 + transport complètement arrestations sur le site de la lésion. Inversement, Mn 2 + transport actif est quantitativement proportionnelle à la viabilité, le nombre et l'activité électrique des fibres axonales. Pour cette analyse, nous illustrons Mn 2 + cinétique de transport le long du trajet optique dans un modèle de souris transgénique (NF-kB p50 KO) l'affichage de l'atrophie spontanée sensorielle, notamment visuelle, des projections. Chez ces souris, MEMRI indique réduite mais non retardé Mn 2 + transport par rapport aux souris de type sauvage, révélant ainsi des signes de dégradations structurales et / ou fonctionnelles des mutations par NF-kB.

En résumé, MEMRI comble bien des essais in vivo et post mortem histologie pour la characterizatisur l'intégrité et l'activité des fibres nerveuses. Il est très utile pour les études longitudinales sur la dégénérescence et la régénération axonale, et les enquêtes de souris mutantes pour phénotypes authentiques ou inductibles.

Introduction

Sur la base de sa structure neuro-anatomique favorable du système visuel rongeur offre des possibilités uniques pour évaluer les composés pharmacologiques et leur capacité à servir de médiateur neuroprotection 1 ou effets pro-régénératives 2,3. En outre, il permet des études sur les caractéristiques fonctionnelles et neuro-anatomique de mutants de souris, comme l'a récemment illustré pour les souris dépourvues de la protéine d'échafaudage présynaptique Basson 4. En outre, un large éventail d'outils complémentaires offre supplémentaire comportant des cellules rétiniennes ganglionnaires (GRC) et le nombre d'axones RGC ainsi que l'activité RGC, par exemple, par électrorétinographie et des tests de comportement, et la détermination des réarrangements corticales par imagerie optique des signaux intrinsèques. Les derniers développements techniques de microscopie laser permettent la visualisation in situ de RGC régénération de tissu profond imagerie de fluorescence dans des spécimens entiers de montage de nerf optique (ON) et le cerveau. Dans ce histologapproche ical, tétrahydrofuranne base compensation des tissus en combinaison avec la lumière microscopie à fluorescence de la feuille permet la résolution des fibres simples qui ré-entrer dans le ON déafférenté et des voies optiques 5. Bien que de telles techniques pourrait être supérieure à la résolution et la détermination de profils de croissance, ils ne permettent pas d'analyses répétitives et longitudinaux des événements de croissance individuels, qui sont particulièrement souhaités pour évaluer le processus de régénération à long terme.

Contraste l'IRM a été utilisée pour la visualisation invasive de la projection rétino-tectale chez la souris et le rat 6,7. Ceci peut être réalisé par dépôt intra-oculaire directe des ions paramagnétiques (par exemple, Mn 2 +) à des cellules de la rétine. Comme un analogue de calcium, Mn 2 + est incorporé dans RGC soma via des canaux calciques voltage-dépendants et transporté activement le long du cytosquelette axonal de l'ON intacte et des voies optiques. Bien qu'il s'accumule dans les noyaux du cerveaude la projection visuelle, c'est à dire le corps genouillé latéral (CGL) et colliculus supérieur (SC), propagation transsynaptique dans le cortex visuel primaire semble négligeable 8,9, mais il peut se produire 10,11. Sous séquençage MR, paramagnétique Mn 2 + augmente M. contraste principalement en raccourcissant T 1 spin-réseau temps de relaxation 12. Cette Mn 2 + amélioré IRM (MEMRI) a été appliquée avec succès dans diverses études neuro-anatomiques et fonctionnelles des rats, y compris l'évaluation de la régénération axonale et la dégénérescence après ON blessures 13,14, la cartographie anatomique précise de la projection 15 rétino-tectale , ainsi que la détermination des caractéristiques de transport axonal après le traitement pharmacologique 16. Améliorations récentes dans les doses, la toxicité, et la cinétique des protocoles IRM neuronales Mn 2 + absorption et le transport, ainsi que l'amélioration ont étendu son application à des études sur transgénique9 souris en utilisant 3 Tesla, couramment utilisés dans la pratique clinique 17.

Ici, nous présentons un protocole approprié pour MEMRI longitudinal imagerie in vivo de la projection rétino-tectale souris et illustrons son applicabilité en évaluant Mn 2 + amélioration du signal dépend des conditions de neurodégénérescence naïfs et divers. Notre protocole met l'accent spécifique sur l'acquisition de données MR dans un champ magnétique modéré 3 T qui est généralement plus accessibles que les scanners pour animaux dédiés. Chez les souris naïves, nous illustrons comment intensité de signal spécifique à l'appareil peut être sensiblement et de façon reproductible devenir augmenté après intravitréenne (ivit) Mn 2 + application. Quantitativement, Mn 2 + propagation le long de la projection visuelle se produit indépendamment du processus normal de vieillissement (mesurée entre les souris de 3 et 26 mois) et l'augmentation est réfractaire à une stimulation visuelle et de l'adaptation à l'obscurité. En revanche, Mn <sjusqu'à> 2 + enrichissement dans les centres thalamiques et du mésencéphale est diminuée suivant aiguë ON écrasement blessures 18 ainsi que dans les souris knock-out NFKB1 (p50 KO) souffre de la mort spontanée RGC apoptotique et sur ​​la dégénérescence 19. Ainsi, l'expansion à l'analyse histologique conventionnelle, analyse MEMRI longitudinal de chaque animal permet le profilage de la cinétique uniques de processus neurodégénératifs. Cela devrait s'avérer utile pour des études sur la neuroprotection et la régénération axonale associés aux interventions pharmacologiques ou génétiques.

Protocol

Toutes les interventions sur les animaux sont effectuées en conformité avec la Convention européenne pour la protection des animaux et l'utilisation des animaux de laboratoire et de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences sont approuvés par le comité d'éthique local. La procédure de ON blessures chez les souris est décrit ailleurs 9. Une. Injection intravitréenne de mang…

Representative Results

La capacité de cette technique d'imagerie afin d'évaluer avec précision la vitalité et la fonctionnalité de la projection visuelle repose sur une application précise de Mn 2 + posologie non toxique pour le corps vitré et son absorption par les CGR. Cette hypothèse majeure est testée à la figure 1, où la couche spécifique Mn 2 + absorption est démontrée par autometallography (TIMM coloration) 21. Sections de la rétine ont été analysées à 24 heur…

Discussion

MEMRI du système visuel s'étend techniques classiques neurobiologiques pour évaluer la fonctionnalité dans des conditions pathologiques et naïfs. En plus de fournir un aperçu unique de l'intégrité d'un isolé CNS faisceau de fibres, MEMRI peut être facilement complétée par des tests de comportement, par exemple, l'optométrie et des tâches à base d'eau visuellement, pour enquêter sur les conséquences immédiates d'un paradigme donné pour la perception visuelle. Il relie ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AK est soutenu par la Fondation Oppenheim et HR est soutenu par la Fondation Velux. Nous remercions I. Krumbein pour Buder technique et K. de soutien histologique, et J. Goldschmidt (Institut Leibniz de neurobiologie, Magdeburg, Allemagne) pour des conseils techniques sur TIMM coloration.

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Isoflurane Actavis, Munich, Germany PZN 7253744
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion 
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

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Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

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