간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.
인간의 간 조직에 백혈구 침윤 모든 성인 염증성 간 질환의 일반적인 과정이다. 만성 침투 간경변 섬유증과 진행의 발전을 구동 할 수있다. 간으로 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 간 질환의 중요한 치료 표적을 식별 할 수 있습니다. 백혈구 모집 중에 키 상호 작용은 전단 응력의 조건에서 내피 세포와 염증 세포의입니다. 간을 모집 간 사인 내피 세포 (HSEC)에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 낮은 전단 채널 내에서 발생합니다. 간 정현파 내의 조건은 특정 유속 인간 HSEC 단일 층으로 늘어선 채널을 통해 백혈구를 관류하여 효과적으로 요약 할 수있다. 이러한 조건에서 백혈구가 내피에 걸쳐 크롤링 단계 이후의 윤회 다음 활성화 및 밀착성 다음에 간단한 테 더링 단계를 거쳐층. 위상차 현미경을 사용하여,이 '접착 캐스케이드'의 각각의 단계는 시각 및 오프라인 분석 하였다 기록 될 수있다. 내피 세포 또는 백혈구는이 과정에서 특정 분자의 역할을 결정하기 위해 억제제로 전처리 할 수있다.
그것은 지금 잘 일반적으로 백혈구 모집은 다단계 접착 폭포 1의 패러다임을 따르도록 설정됩니다. 이 혈관 벽을 일렬로 세우는 내피 세포로 흐르는 혈액에서 백혈구의 캡처를 포함한다. 처음에는 백혈구는 수용체 또는 면역 글로불린 슈퍼 패밀리의 구성원을 셀렉틴에 의해 매개되는 압연 단계를 받고있다. 이는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)가 내피 글리코 칼 릭스에 제시 케모카인에 의해 활성화되는 백혈구 표면에 발현한다. 이 백혈구의 표면에 '친 화성이 높은'상태로 인테 확인의 변경에 이르게 체포 및 내피 세포에 회사 접착. 밀착성이어서 용기에 백혈구의 형상 변화와 크롤링하여 이어진다. 마지막 단계는 세포층 또는 세포 횡단 루트를 통해 발생할 수있는 내피 세포 단일 층을 통해 윤회입니다.
다단계 접착 계단식 설명하면서의 신체 내에서 백혈구 모집의 일반적인 메커니즘은 특정 기관의 차이가 있습니다. 간에서 백혈구 모집의 대부분은 채용 일반적 후 모세관 세정맥 (2) 내에 발생하는 다른 장기에 대비 간 정현파들 내에 발생한다. 간 사인 곡선은 낮은 전단 환경이며, 백혈구는 독립적 인 2 셀렉틴되어 접착력을 굳게하기 전에 간단한 테 더링 단계를 받고있다. 이 채널은 불연속 및 fenestrae, 직경 모공 100 ~ 200 nm의를 포함하는 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어와 기저막 3 부족합니다. 인간의 간 사인 내피를 통해 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 해명하는 기관에게 염증성 간 질환에 대한 구체적인 치료 목표를 식별 할 수 있습니다.
흐름 접착 분석은 백혈구 모집을 공부에 필수적인 도구입니다. 그들은 수 백혈구 recru의 재건잘 정의 된 힘에서 접착력을 분석하는 전단 응력의 존재 itment. 분석에 대한 가장 자주 사용하는 배양 내피 세포 단일 층 또는 정제 된 기판에 연구 백혈구의 부착입니다. 시판 유동 챔버는 두 개의 평면 표면들 사이 층류 조건 하에서 세포를 perfuse 후 현미경 (4)에 접착 동적 프로세스를 시각화하는데 사용된다. 이전 그룹은 특정 접착제의 상호 작용은 흐름에서 일어날 것을 증명하고 정적 분석 5,6에서 공부 할 수 없습니다.
우리는 간 사인 곡선을 요점을 되풀이 낮은 전단 응력 조건에서 백혈구 모집을 연구하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 인간의 기본 HSEC이 microslides 및 백혈구의 배양은 다음 간 사인 곡선 내에서 전단 응력을 재현하기 위해 계산 된 유량의 비율이 단층을 통해 관류 할 수 있습니다. 전단 응력은 OPP로 표면에 평행 한 접선인가 스트레스수직 수직 응력에 osed. 경계를 따라 이동하는 유체는 그 경계에 전단 응력을 발휘합니다. 전단 응력은 림프구 윤회 7의 필수 구성 요소로 표시되었습니다. 이러한 조건에서 접착 캐스케이드의 각 단계는 위상차 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 이 방법은 기존의 접착 분자 (8)의 연구, 케모카인 및 케모카인 수용체 9-11의 역할과 같은 혈관 접착 단백질 1 (VAP-1과 같은 비정형 부착 분자를 포함하는 간 내 백혈구의 채용에 중요한 통찰력을 허용했다 ) 8,12 일반적인 림프와 혈관 내피 수용체 1 (CLEVER-1) 13. 이 분석은 우리 그룹의 출판물의 여러 가지에 언급 된 반면, 그 설명을 간략하고있다 그리고 우리는 문제 해결에 도움이 기술적 오류를 방지하는 단계를 안내하여 상세한 단계를 제공하기 위해이 기회를 촬영했을 때 시도분석을 보내고. 또한, 우리는 최근에 전단 응력의 정확한 변경을 허용하는 마이크로 챔버의 소싱을 변경했습니다. 우리는이 다른 내피 세포와 면역 세포에 대한 분석의 적용 가능성을 넓혀 생각합니다. 다음의 방법은 인간의 간 사인 내피 세포 및 말초 혈액 림프구와 흐름을 기준으로 접착 분석을 수행하기위한 준비와 기술에 대해 설명합니다.
성공적 유동 검정을 수행하기위한 가장 중요한 단계는 내피 세포의 건강과 합류 단층 전에 유동 접착 분석 준비가되었다는 것을 보장한다. 기본 내피 세포는 문화 어렵고 배양 방법의 변화에 민감 할 수 있습니다. 그것은 1) 유량 용기가 적절하게 균일 단층의 내피 세포로 코팅하는 것이 중요합니다; HSEC에 대해 우리는 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I를 사용하지만 다른 내피 인구 다를 수 있습니다, 2) 문화 매체를 들면, 세포 유형에 적합한 HSEC 우리는 프로토콜 섹션에서 우리의 완전한 매체를 설명했다. 다른 중요한 단계는 전단 응력의 생리적 인 수준을 반영하도록 적절한 속도로 시린지 펌프를 설정 있습니다.
유동 검정시에는 내피 단층 손상 또는 내피 세포 표면에서의 면역 세포를 제거 할 수 유동 회로 내에서 기포를 방지 할 필요가있다. 이는 EN에 의해 방지 될 수있다모든 실리콘 튜브 및 어댑터는 모든 기포를 제거하고 용지를 사용하기 전에 예비 가온되는 것을, 연결 전에 세척 버퍼로 관류하는 것을 suring. 는 액체 / 액체 계면이 연결 중에있어 매우 중요하다 마이크로 슬라이드상의 포트에 어댑터를 연결하는 경우에 공기가 존재하는 경우, 이것은 주사기 출금 중에 내피 단층을 방해한다 시스템 내에서 에어 갭을 형성 할 것이다 단계. 시린지 외통의 백혈구 세포 용액 따라서 실험 내내 일정한 셀 밀도를 유지하고, 침전하지 않도록 일정한 교반이 필요하다.
기록 단계 동안에 그것 내피 층의 화상이 적절히 집중하고 정확한 오프라인 분석을 허용하도록 클리어되고 보장하는 것이 중요하다, 즉 유동 검정 (포스트 백혈구 볼 러스)의 두 번째 단계 동안 충분한 시간은 세척 완충액 중에 남아 녹음하기 전에 단계는 다음을 보장하기 위해보다 추천모든 비 접착 성 백혈구가 제거됩니다. 유사하게는 좁은 모세관에서 흐름 패턴을 방해 할 세포의 손실을 방지하고, 또한 위상차 현미경 하에서 큰 부착 백혈구로부터 구별하기 어려울 수있는 적절한 밀도의 단층에서 내피 세포를 사용하는 것이 필수적이다. 우리는 인간의 간 사인 내피 세포에 대한 최적의 파종 밀도를 설명 그러나 이것은 다른 내피 인구와 종 사이에 차이가있을 수 있습니다.
상당한 진전이의 intravital 현미경으로 동물 모델에서 백혈구 모집을 공부에서했다. 유동 접착 분석 방법의 주요 장점은 백혈구 모집 일차 인간 내피 세포와 이진 시스템에서 연구 될 수 있다는 것이다. 또한, 이러한 상호 작용은 전단 응력의 생리 관련 수준에서 공부하실 수 있습니다. differenc이있을 수 있으므로 그것은 인간의 셀룰러 시스템과 동물의 intravital 연구의 연구 결과를 확인하는 것이 중요하다종 사이의 내피 세포의 특성 에스. 유동 검정의 한계 중 하나는 백혈구 모집 내피 단층의 단세포 환경에서 연구되고 있다는 것이다. 백혈구가 내피를 통해 접착 transmigrated 일단 또한 그들은 격리 및 다운 스트림 공정을 실시 할 충분한 수의 존재에 있지 않을 수 있습니다.
이러한 제한에도 불구하고 유동 접착 분석은 마스터 링 된 후에는 백혈구 접착 캐스케이드의 추가 분석을 수행하도록 개발 및 다세포 환경 요점을 되풀이하도록 구성 될 수있다. 단일 필드 및 추적 소프트웨어의 사용의 장시간 녹음이 백혈구의 크롤링 동작을 분석하는데 사용될 수있다. 또한 유동 검정 완료시 microslides보다 상세히 접착 및 이주를 연구하는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 면역 형광 라벨을 이용하여 심문 할 수있다. 또한, 우리는 이전에 개발 한흐르는 백혈구가 간세포의 존재에 의해 에어컨 간 내피 세포와 상호 작용 할 수있는 시험 관내 모델 에드. 이 분석은 또한 백혈구의 모집단을 연구하기 위해 개발 될 수있다 : 우리 그룹은 규제 T 세포, B 세포, 간 침투 백혈구 등의 부분 집합으로 연구를 수행하고있다.
이러한 연구 흐름 접착 분석은 인간의 시스템에서 일반 및 기관 특정 백혈구 모집을 연구하는 강력한 도구입니다 증거입니다.
The authors have nothing to disclose.
SS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 중간 임상 친목, CW에 의해 투자된다.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |