التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد يحدث داخل القنوات المتخصصة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية الكبدي فريدة من نوعها. المرحلة المجهر النقيض من التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية كبدي تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية يمكن أن يسهل توضيح الآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه العملية.
الكرية البيضاء التسلل إلى أنسجة الكبد الإنسان هو عملية مشتركة في جميع أمراض الكبد التهابات الكبار. تسلل مزمن يمكن أن تدفع تطور التليف والتقدم إلى تليف الكبد. يمكن فهم الآليات الجزيئية التي تتوسط التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد تحديد الأهداف العلاجية الهامة لمرض الكبد. التفاعل الرئيسية خلال تجنيد الكرية البيضاء هو أن الخلايا الالتهابية مع البطانة تحت ظروف إجهاد القص. التوظيف في الكبد يحدث داخل قنوات القص منخفضة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية كبدي (HSEC). الظروف داخل الجيوب الكبدية يمكن تلخيصها بواسطة perfusing كريات الدم البيضاء من خلال قنوات مبطنة من قبل الطبقات الوحيدة HSEC الإنسان في معدلات تدفق محددة. في هذه الظروف يخضع كريات الدم البيضاء خطوة الربط قصيرة تليها تفعيل والتصاق شركة، تليها خطوة الزحف والتهجير لاحقة عبر البطانيةالطبقة. باستخدام مجهر تباين الطور، كل خطوة من هذا 'تتالي التصاق' يمكن تصور وسجلت تليها تحليل غير متصل. الخلايا البطانية أو كريات الدم البيضاء يمكن سابقة التجهيز مع مثبطات لتحديد دور جزيئات محددة خلال هذه العملية.
والآن راسخة بأن التوظيف الكرية البيضاء في العام التالي نموذج للالتصاق سلسلة متعددة الخطوات 1. وهذا ينطوي على الاستيلاء على كريات الدم البيضاء من الدم يتدفق من قبل الخلايا البطانية المبطنة لجدار الوعاء الدموي. في البداية، كريات الدم البيضاء الخضوع خطوة المتداول الذي selectin بوساطة المستقبلات أو أعضاء الفصيلة المناعي. وهذا يسمح أعرب G-بروتين المستقبلات إلى جانب (GPCRs) على سطح الكرية البيضاء ليتم تفعيلها من خلال كيموكينات عرضت على الكنان السكري البطانية. وهذا يؤدي إلى تغيير تأكيد إنتغرين إلى حالة 'تقارب عالية' على سطح الكرية البيضاء واعتقال والتصاق شركة إلى البطانة. ثم تبعتها شركة التصاق بسبب تغير الشكل والزحف من الكرية البيضاء على متن السفينة. والخطوة الأخيرة هي التهجير من خلال أحادي الطبقة البطانية، والتي يمكن أن تحدث عبر طرق paracellular أو العابر للخلايا.
في حين أن تتالي التصاق متعددة الخطوات تصفق الآلية العامة للتوظيف الكرية البيضاء داخل الجسم هناك اختلافات محددة الجهاز. في الكبد غالبية التوظيف الكرية البيضاء يحدث داخل الجيوب الكبدية وعلى النقيض من الأجهزة الأخرى التي يحدث فيها التجنيد عموما داخل الأوردة الشعرية بعد 2. الجيوب الكبدية هي بيئة منخفضة القص وكريات الدم البيضاء الخضوع خطوة الربط وجيزة قبل أن يرسخ التصاق التي selectin مستقلة 2. تصطف هذه القنوات من قبل البطانة الجيبية الكبدي الذي هو متقطع ويحتوي نافذي، المسام مفتوحة 100-200 نانومتر في القطر، وتفتقر إلى الغشاء القاعدي 3. يمكن توضيح الآليات الجزيئية التي تتوسط التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية الكبدي تحديد الجهاز الأهداف العلاجية محددة لأمراض الكبد الالتهابية.
فحوصات التصاق تدفق هي أدوات أساسية في دراسة التجنيد الكرية البيضاء. أنها تسمح إعادة بناء الكرية البيضاء recruitment في وجود إجهاد القص لتحليل التصاق تحت قوات محددة جيدا. الاستخدام الأكثر شيوعا لفحص هو التصاق الكرية البيضاء الدراسة إلى الطبقات الوحيدة البطانية مثقف أو ركائز المنقى. وتستخدم الدوائر تدفق المتاحة تجاريا ليروي الخلايا تحت ظروف تدفق الصفحي بين اثنين من الأسطح المسطحة ثم تصور عملية دينامية للالتصاق على المجهر 4. وقد أثبتت جماعات السابقة أن بعض التفاعلات لاصقة فقط تجري تحت التدفق ولا يمكن دراستها في المقايسات ثابتة 5،6.
وقد استخدمنا هذه التقنية لألخص الجيوب الكبدية ودراسة توظيف الكرية البيضاء تحت ظروف إجهاد القص منخفضة. HSEC الإنسان الأساسية هي تربيتها في microslides وكريات الدم البيضاء ثم يمكن perfused على هذا أحادي الطبقة بمعدل تدفق المحسوبة لإنتاج إجهاد القص داخل الجيوب الكبدية. إجهاد القص هو الإجهاد التي يتم تطبيقها بالتوازي أو عرضية إلى السطح كما مقابلosed الإجهاد الطبيعي الذي هو عمودي. فإن أي السائل الذي يتحرك على طول حدود ممارسة إجهاد القص على تلك الحدود. وقد تبين إجهاد القص لتكون عنصرا أساسيا في الخلايا اللمفاوية التهجير 7. في ظل هذه الظروف كل خطوة من تتالي التصاق يمكن تصور من قبل النقيض من المرحلة المجهري. هذه الطريقة سمحت معلومات هامة عن تجنيد كريات الدم البيضاء داخل الكبد بما في ذلك دراسة جزيئات الالتصاق التقليدية 8، ودور كيموكينات ومستقبلات chemokine 9-11، وجزيئات الالتصاق شاذة مثل التصاق الأوعية الدموية البروتين 1 (VAP-1 ) 8،12 اللمفاوية والأوعية الدموية شيوعا والبطانية مستقبلات 1 (CLEVER-1) 13. في حين تم ذكر هذا الاختبار في العديد من المنشورات مجموعتنا، وقد تم وصفه وجيزة واتخذنا هذه الفرصة لتقديم مفصلة خطوة خطوة الدليل لمساعدتك في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ومنع الأخطاء الفنية عند محاولةجي الفحص. وعلاوة على ذلك، ونحن قد تغيرت مؤخرا الحصول على مصادر للغرف شريحة مجهرية الذي يسمح تعديلات دقيقة في إجهاد القص. نحن نعتقد أن هذا يوسع تطبيق الفحص على الخلايا البطانية والمناعية الأخرى. يصف الطريقة التالية إعداد وتقنية لتنفيذ تدفق استنادا التصاق مقايسة مع الخلايا البطانية الجيبية كبدي الإنسان والخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي.
الخطوة الأكثر أهمية لأداء بنجاح فحص التدفق هو ضمان أن أحادي الطبقة صحية ومتموجة من الخلايا البطانية مستعدة قبل مقايسة التصاق التدفق. الخلايا البطانية الأولية يمكن أن يكون صعبا للثقافة وحساسية للتغييرات في أساليب زراعة. من المهم أن 1) يتم بشكل كاف وبشكل موحد المغلفة غرف تدفق مع الخلايا البطانية في أحادي الطبقة، لHSEC نستخدم الفئران الذيل نوع الكولاجين أنا ولكن هذا قد تختلف عن السكان البطانية الأخرى، 2) مستنبت مناسب لنوع من الخلايا، ل HSEC التي وصفناها لدينا المتوسطة كاملة في قسم البروتوكول. وتشمل الخطوات الحيوية الأخرى وضع ضخ حقنة بمعدل المناسبة لتعكس مستويات الفسيولوجية للإجهاد القص.
أثناء فحص التدفق فمن الضروري لمنع فقاعات الهواء داخل الدائرة التدفق التي يمكن أن تتلف أحادي الطبقة البطانية أو تجريد الخلايا المناعية من سطح البطانية. هذا يمكن الوقاية منها عن طريق حماماتsuring أن جميع أنابيب السيليكون ومحولات و perfused مع غسل العازلة قبل الصدد، أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء والتي يتم prewarmed وسائل الإعلام قبل استخدامها. عند توصيل محولات لالمنافذ على شريحة مجهرية من المهم جدا أن هناك واجهة السائل / السائلة أثناء الاتصال، إذا كان هناك أي الهواء ثم وهذا سوف يشكل فجوة الهواء داخل النظام الذي سوف تعطل أحادي الطبقة البطانية أثناء الانسحاب حقنة الخطوة. الحل الكرية البيضاء في برميل حقنة يحتاج الانفعالات العادية للتأكد من أن الخلايا لا تسوية، وبالتالي الحفاظ على كثافة خلايا ثابتة طوال التجربة.
خلال خطوات التسجيل فمن المهم لضمان تركيز الصورة من طبقة بطانة الأوعية الدموية على نحو كاف وواضح للسماح حاليا تحليل دقيق، وأنه خلال الخطوة الثانية من فحص تدفق (آخر الكرية البيضاء البلعة) أن يتم ترك ما يكفي من الوقت أثناء غسل العازلة واستأنف المرحلة قبل تسجيل للتأكد من أنتتم إزالة كافة كريات الدم البيضاء غير ملتصق. وبالمثل فإنه من الضروري استخدام الخلايا البطانية في أحادي الطبقة من الكثافة المناسبة لمنع فقدان الخلايا التي يمكن أن تتداخل مع أنماط التدفق في الشعيرات الدموية الضيقة وأيضا يمكن أن يكون من الصعب أن تميز من كريات الدم البيضاء الملتصقة أكبر تحت النقيض من المرحلة المجهري. وصفناها الأمثل كثافة البذر للخلايا البطانية الجيبية كبدي الإنسان، ولكن هذا قد تختلف بين السكان وأنواع مختلفة البطانية.
وقد تم إحراز تقدم كبير في دراسة التجنيد الكرية البيضاء في النماذج الحيوانية مع intravital المجهري. والميزة الرئيسية لطريقة الفحص التصاق تدفق هو أن التوظيف الكرية البيضاء يمكن دراستها في النظام الثنائي مع الخلايا البطانية الإنسان الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التفاعلات يمكن دراستها تحت المستويات الفسيولوجية ذات الصلة من إجهاد القص. من المهم أن تؤكد نتائج الدراسات حيوي داخلي في الحيوانات مع الأنظمة الخلوية الإنسان ما قد يكون هناك differencوفاق في خصائص البطانية بين الأنواع. واحدة من القيود المفروضة على تدفق مقايسة هو أن التوظيف الكرية البيضاء ويجري درس في بيئة وحيدة الخلية من أحادي الطبقة البطانية. بالإضافة مرة واحدة انضمت في كريات الدم البيضاء وtransmigrated عبر البطانة أنها قد لا تكون في موجودة بأعداد كافية لتكون معزولة وتعرض لعمليات المصب.
على الرغم من هذه القيود، بمجرد يتقن مقايسة التصاق تدفق يمكن وضعها لتنفيذ مزيد من التحليل للتتالي التصاق الكرية البيضاء وتكييفها مع بيئة متعددة الخلايا ألخص. تسجيل فترات طويلة من الحقول واحد واستخدام برامج تتبع يمكن استخدامها لتحليل السلوك الزحف من كريات الدم البيضاء. وعلاوة على ذلك عند الانتهاء من فحص التدفق يمكن استجواب microslides باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري ووضع العلامات مناعي لدراسة التصاق والتهجير في مزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير سابقاإد نموذجا في المختبر حيث يمكن كريات الدم البيضاء التي تتدفق التفاعل مع البطانة الكبدي مكيفة من وجود خلايا الكبد. كما يمكن تطوير هذا الفحص لدراسة المجموعات السكانية الفرعية من كريات الدم البيضاء: كان أداء مجموعتنا الدراسات مع مجموعات فرعية مثل الخلايا التنظيمية T والخلايا B، والكبد التسلل كريات الدم البيضاء.
هذه الدراسات هي دليل على أن مقايسة التصاق تدفق هو أداة قوية لدراسة العامة والجهاز التوظيف الكرية البيضاء محددة في النظم البشرية.
The authors have nothing to disclose.
ويتم تمويل SS من قبل الزمالة ويلكوم ترست المتوسطة السريرية، CW من قبل ويلكوم ترست برنامج المنح.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |