Leucocyte rekruttering til leveren sker inden de specialiserede kanaler leverens sinusoider, som er foret med unikke hepatiske sinusformede endotelceller. Fasekontrastmikroskopi af leukocyt rekruttering på tværs af human hepatisk sinusformet endotel under betingelser med fysiologisk forskydningsspænding kan lette opklaringen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne proces.
Leucocyte infiltration i humant levervæv er en fælles proces i alle voksne inflammatoriske leversygdomme. Kronisk infiltration kan drive udviklingen af fibrose og progression til skrumpelever. Forståelse af de molekylære mekanismer, der medierer leukocyt rekruttering til leveren kunne identificere væsentlige terapeutiske mål for leversygdom. Nøglen interaktion under leukocyt rekruttering er, at af inflammatoriske celler med endotel under forhold med shear stress. Rekruttering til leveren sker inden de lave shear kanaler leverens sinusoider, som er foret med hepatiske sinusformede endotelceller (Hsec). Betingelserne i de hepatiske sinusoider kan sammenfattet ved perfusion leukocytter gennem kanaler foret af menneskelige Hsec monolag på bestemte strømningshastigheder. Under disse betingelser leukocytter underkastes en kort tethering trin efterfulgt af aktivering og fast vedhæftning, efterfulgt af en kravlende trin og efterfølgende transmigrering over endotellag. Brug af fasekontrastmikroskopi, kan hvert trin af denne "vedhæftning kaskade" visualiseres og registreres efterfulgt af offline analyse. Endotelceller eller leukocytter kan forbehandles med inhibitorer for at bestemme betydningen af specifikke molekyler under denne proces.
Det er nu almindeligt anerkendt, at leukocyt rekruttering i almindelighed følger paradigme for den multistep vedhæftning kaskade 1. Dette indebærer opsamling af leukocytterne strømmende blod af endotelceller foring karvæggen. I første omgang, leukocytter gennemgå en rullende skridt, som er medieret af selectin receptorer eller medlemmer af immunoglobulinsuperfamilien. Dette giver G-protein-koblede receptorer (GPCR) udtrykt på leukocyt-overflade, der skal aktiveres af kemokiner præsenteret på endotel glycocalyx. Dette fører til ændring af bekræftelse integrin til en "høj affinitet" stat på leukocyt overflade og arrestere og fast vedhæftning til endotel. Faste adhæsion efterfølges af formændring og gennemgang af leukocyt på fartøjet. Det sidste trin er transmigration gennem endotelmonolaget, som kan ske via paracellulære eller transcellulære ruter.
Mens multistep vedhæftning kaskade beskrives den generelle mekanisme for leukocyt rekruttering i kroppen er der orgel specifikke forskelle. I leveren størstedelen af leukocyt rekruttering sker inden de hepatiske sinusoids i modsætning til andre organer, hvor rekrutteringen sker generelt inden for de post-kapillære venuler 2. De hepatiske sinusoider er lav forskydning miljø og leukocytter underkastes en kort tethering skridt forud for fast adhæsion som selectin uafhængig 2. Disse kanaler er foret med det hepatiske sinusformet endotel som er diskontinuert og indeholder fenestrae, åbne porer 100-200 nm i diameter, og mangler en basalmembran 3. Belyse de molekylære mekanismer, der medierer leukocyt rekruttering på tværs af human lever sinusformet endotel kunne identificere orgel specifikke terapeutiske mål for inflammatoriske leversygdomme.
Flow adhæsionsassays er vigtige redskaber i at studere leukocyt rekruttering. De tillader genopbygningen af leukocyt recruitment i overværelse af forskydningsspænding til at analysere vedhæftning under veldefinerede kræfter. Den hyppigste anvendelse til assayet er studiet leucocyt adhæsion til dyrkede endotelceller monolag eller oprensede substrater. Kommercielt tilgængelige strømningskamre bruges til perfundere celler under forhold med laminar strømning mellem to flade overflader, og derefter visualisere den dynamiske proces af vedhæftning på et mikroskop 4.. Tidligere grupper har vist, at visse klæbende interaktioner kun ske under flow og ikke kan studeres i statiske analyser 5,6.
Vi har brugt denne teknik til at rekapitulere de hepatiske sinusoider og studere leukocyt rekruttering under forhold med lav forskydningsspænding. Primære humane Hsec dyrkes i microslides og leukocytter kan derefter perfunderet i denne monolag ved en strømningshastighed beregnet til at gengive forskydningsspænding inden hepatiske sinusoider. Det shear stress er en stress, der anvendes parallelt eller tangerer en overflade som opposed til normal stress, som er vinkelret. Enhver væske, der bevæger sig langs en grænse, vil udøve en forskydningsspænding på denne grænse. Shear stress har vist sig at være en væsentlig bestanddel af lymfocyt sjælevandring 7. Under disse betingelser hvert trin af vedhæftning kaskade kan visualiseres ved fasekontrast mikroskopi. Denne metode har givet vigtig indsigt i rekruttering af leukocytter i leveren, herunder undersøgelse af konventionelle adhæsionsmolekyler 8, rolle chemokiner og chemokinreceptorer 9-11, og atypiske adhæsionsmolekyler, såsom det vaskulære adhæsionsprotein-1 (VAP-1- ) 8,12 og fælles lymfe-og vaskulær endotel-receptor-1 (CLEVER-1) 13. Mens dette assay er blevet nævnt i flere af vores gruppe publikationer har sin beskrivelse været kort, og vi har benyttet lejligheden til at give en detaljeret trin for trin guide til at hjælpe med fejlfinding og forhindre tekniske fejl, når forsøgning assayet. Desuden har vi for nylig ændret sourcing af mikroobjektglas kamre som tillader præcise ændringer i forskydningsspænding. Vi mener, at dette udvider anvendeligheden af assayet til andre endotheliale og immunceller. Følgende metode beskriver fremstillingen og teknik til at udføre et flow baseret adhæsionsassay med humane hepatiske sinusformede endotelceller og perifere blod-lymfocytter.
Det mest kritiske trin for en vellykket udførelse af en flow-assay er at sikre, at sunde og sammenflydende monolag af endotelceller er parat før strømmen adhæsionsassayet. Primære endotelceller kan være vanskelige at dyrke og følsom over for ændringer i dyrkningsmetoder. Det er vigtigt, at 1) strømningskamre tilstrækkeligt og ensartet overtrukket med endothelceller i et monolag, for Hsec vi bruger rotte hale collagen type I, men dette kan variere for andre endotheliale populationer, 2) dyrkningsmedium er passende for celletypen for Hsec vi har beskrevet vores komplette medium i protokollen afsnit. Andre vigtige skridt omfatter indstilling sprøjtepumpen på den relevante sats for at afspejle fysiologiske niveauer af forskydningsspænding.
I flow-analysen er det nødvendigt at forhindre luftbobler i strømningskredsløbet, som kan beskadige endotelmonolaget eller strimler immunceller fra endoteloverfladen. Dette kan forhindres ved ensuring at alle silikoneslanger og adaptere perfunderet med vaskebuffer før forbindelse, at alle luftbobler er fjernet, og at medierne er forvarmet før brug. Ved tilslutning adapterne til portene på mikroobjektglas er det meget vigtigt, at der er en væske / væske grænseflade under forbindelsen, hvis der er nogen luft, så vil dette udgøre en luftspalte i systemet, som vil forstyrre endotelmonolaget under tilbagetrækning sprøjten trin. Leukocyt opløsning i sprøjtecylinderen kræver regelmæssig omrøring for at sikre, at cellerne ikke sætter sig, således at opretholde en konstant celletæthed hele forsøget.
Under optagelsen trin, er det vigtigt at sikre billedet af endothellaget er tilstrækkeligt fokuseret og klar til at tillade nøjagtig offline analyse, og at der i det andet trin af strømmen assay (post leucocyte bolus), som nok tid der er tilbage i løbet af vaskebuffer fase, før optagelsen genoptages for at sikre,alle adhærerende leukocytter er fjernet. Ligeledes er det vigtigt at anvende endotelceller i et monolag af passende tæthed for at undgå tab af celler, som kan interferere med strømningsmønstre i snævre kapillærer og også kan være svært at skelne fra større adhærente leukocytter under fasekontrastmikroskopi. Vi har beskrevet optimal podningstæthed for humane hepatiske sinusformede endotelceller, men kan variere mellem forskellige endotel bestande og arter.
Der er gjort betydelige fremskridt i at studere leukocyt rekruttering i dyremodeller med intravital mikroskopi. Den største fordel ved flow adhæsionsassayet metode er, at leukocyt rekruttering kan studeres i et binært system med primære humane endotelceller. Desuden kan disse interaktioner undersøges under fysiologiske relevante niveauer af forskydningsspænding. Det er vigtigt at bekræfte resultaterne af intravital studier i dyr med menneskelige cellulære systemer, da der kan være differences i endotel egenskaber mellem arter. En af de begrænsninger af strømmen assayet er, at leukocyt rekruttering bliver undersøgt i en encellet miljø endotelmonolaget. Ud over, når leukocytterne har levet og transmigrated tværs endotelet kan de ikke være i stede i tilstrækkeligt antal til at blive isolerede og underkastet downstream processer.
På trods af disse begrænsninger, når strømmen adhæsionsassayet er styr på det kan udvikles til at udføre yderligere analyse af leukocyt adhæsion kaskade og tilpasset til rekapitulere en flercellede miljø. Langvarig optagelse af enkelte felter og anvendelse af tracking software kan bruges til at analysere gennemsøgning adfærd leukocytterne. Desuden ved afslutningen af flowet assay microslides kan spørges ved hjælp af laser scanning konfokal mikroskopi og immunofluorescent mærkning for at studere vedhæftning og sjælevandring i flere detaljer. Derudover har vi tidligere udvikleed en in vitro-model, hvor der strømmer leukocytter kan interagere med nedsat endotel betinget af tilstedeværelsen af hepatocytter. Denne analyse kan også udvikles til at studere subpopulationer af leukocytter: vores gruppe har udført studier med delmængder såsom regulatoriske T-celler, B-celler og lever infiltrerende leukocytter.
Disse undersøgelser er bevis for, at strømmen adhæsionsassayet er et kraftfuldt værktøj til at studere generel og orgel specifik leukocyt rekruttering i menneskelige systemer.
The authors have nothing to disclose.
SS er finansieret af en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW med en Wellcome Trust program Grant.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |