Leucocyte rekruttering til leveren skjer innenfor spesialiserte kanaler av lever sinusoidene som er foret med unike leversinusformet endotelceller. Fasekontrast mikroskopi av leucocyte rekruttering på tvers av menneskelig leversinusformet endotelet under forhold med fysiologiske skjærspenning kan legge til rette for klarlegging av de molekylære mekanismene som ligger bak denne prosessen.
Leucocyte infiltrasjon i menneskelig levervev er en vanlig prosess i alle voksne inflammatoriske leversykdommer. Kronisk infiltrasjon kan drive utviklingen av fibrose og progresjon til cirrhose. Forstå de molekylære mekanismene som formidler leucocyte rekruttering til leveren kunne identifisere viktige terapeutiske mål for leversykdom. Nøkkelen samhandling under leucocyte rekruttering er at av betennelsesceller med endotelet under forhold med skjærspenning. Rekruttering til leveren skjer innen de lave skjær kanaler av hepatiske sinusformer som er foret med hepatiske sinusoidale endotelceller (HSEC). Forholdene innenfor lever sinusoidene kan recapitulated ved perfusert leukocytter gjennom kanaler omgitt av menneske HSEC monolayers på spesifikke strømningshastigheter. Under disse betingelser leukocytter gjennomgå en kort deling trinn etterfulgt av aktivering og fast adhesjon, etterfulgt av en krypende trinn og påfølgende transmigrasjon på tvers av endoteliallag. Ved hjelp av fasekontrastmikroskopi, kan hvert trinn i denne 'adhesjon kaskade' bli visualisert og registrert fulgt av aktiv analyse. Endoteliale celler eller leukocytter kan være forbehandlet med inhibitorer for å bestemme rollen til spesifikke molekyler i løpet av denne prosessen.
Det er nå godt etablert som leucocyte rekruttering generelt følger paradigmet av multistep vedheft kaskade en. Dette innebærer innsamling av leukocytter fra rennende blod av endotelceller lining åreveggen. Til å begynne med leukocytter gjennomgå en valsetrinnet som er mediert av selektin-reseptorer eller medlemmer av immunglobulin superfamilien. Dette gjør det mulig for G-protein koblede reseptorer (GPCR) uttrykt på leukocytter overflaten som skal aktiveres av kjemokiner som presenteres på endotelial glycocalyx. Dette fører til en endring av integrin bekreftelse til en "høy affinitet" tilstand på leukocytter overflate og gripe og fast adhesjon til endotel. Firm heft blir så fulgt av formen endring og gjennomgang av den leucocyte på fartøyet. Det siste trinnet er sjelevandring gjennom endothelial monolaget, som kan skje via paracellular eller transcellular ruter.
Mens multistep vedheft kaskade beskrives den generelle mekanisme for leukocytter rekruttering i kroppen er det organspesifikke forskjeller. I leveren skjer flertallet av leucocyte rekruttering innenfor lever sinusoidene i motsetning til andre organer hvor rekruttering generelt skjer innen post-kapillær venules to. Hepatiske sinusoids er en lav skjær miljø og leukocytter gjennomgå en kort tethering skritt før firmaet vedheft som selektin uavhengig to. Disse kanaler er foret med hepatisk sinusformet endotelet som er diskontinuerlig og inneholder fenestrae, åpne porer 100-200 nm i diameter, og mangler en basalmembran 3. Belyse de molekylære mekanismene som formidler leucocyte rekruttering på tvers av menneskelig leversinusformet endotelet kunne identifisere organ spesifikke terapeutiske mål for inflammatoriske leversykdommer.
Flow vedheft analyser er viktige verktøy i å studere leucocyte rekruttering. De tillater gjenoppbyggingen av leucocyte farten påitment i nærvær av skjærspenning å analysere vedheft under godt definerte styrker. Den vanligste anvendelse for analysen er studiet leukocytt adhesjon til dyrkede endotelceller monolag eller rensede substrater. Kommersielt tilgjengelige strømningskamrene blir brukt til å gjennomstrømme cellene under betingelser for laminær strømning mellom to flate overflater, og deretter visualisere den dynamiske prosessen med adhesjon på et objekt 4.. Tidligere grupper har vist at visse adhesive interaksjoner foregå under strømning, og kan ikke bli studert i statiske analyser 5,6.
Vi har brukt denne teknikken for å rekapitulere de lever sinusoidene og studere leucocyte rekruttering under forhold med lav skjærspenning. Primær human HSEC dyrkes i microslides og leukocytter kan deretter perfusert i løpet av dette monosjikt ved en strømningshastighet beregnet til å reprodusere den skjærspenning i hepatiske sinusformer. Skjærspenningen er et stress som påføres parallelt eller tangential til en overflate som Opposed til normal belastning, som er vinkelrett. Enhver væske som beveger seg langs en grense vil utøve en skjærspenning på at grensen. Shear stress har vist seg å være en viktig del av lymfocytter sjele 7. Under disse betingelser hvert trinn av adhesjonen kaskade kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi. Denne fremgangsmåte har gjort det mulig viktig innsikt inn i rekruttering av leukocytter i leveren med studiet av konvensjonelle adhesjonsmolekyler 8, rollen av kjemokiner og chemokine reseptorer 9-11, og atypiske adhesjonsmolekyler slik som vaskulære adhesjon protein-1 (VAP-1 ) 8,12 og felles lymfesystemet og vaskulær endotelial reseptor-1 (SMART-1) 13. Mens denne analysen har vært nevnt i flere av våre konsernets publikasjoner har sin beskrivelse vært kort, og vi har benyttet anledningen til å gi en detaljert trinnvis guide for å hjelpe i feilsøking og hindre tekniske feil når forsøking analysen. Videre har vi nylig endret sourcing av microslide kamre som gir nøyaktige endringer i skjærspenning. Vi tror at dette utvider anvendbarheten av analysen til andre endotel-og immunceller. Følgende fremgangsmåte beskriver fremstillingen og teknikk for utførelse av en strømningsbasert adhesjon analysen med humane hepatiske sinusoidale endoteliale celler og perifere blodlymfocytter.
Den mest kritiske trinn for med hell å utføre en strømnings analysen er å sikre at en sunn og sammenvoksende monolag av endotelceller er klar før strømnings adhesjon assay. Primære endotelceller kan være vanskelige å dyrke og følsomme for forandringer i dyrkningsmetoder. Det er viktig at en) strømnings kamrene er tilstrekkelig og jevnt belagt med endotelceller i en monolayer, for HSEC vi bruke rotte hale kollagen type I, men dette kan variere for andre endothelial populasjoner, 2) kultur medium er hensiktsmessig for den celletype, for HSEC vi har beskrevet vår komplett medium i protokollinformasjonen. Andre viktige skritt er å sette sprøytepumpen på riktig sats for å reflektere fysiologiske nivåer av skjærspenning.
Under strømnings assay er det nødvendig å hindre at luftbobler inne i strømningskrets som kan skade endotelial monolag eller strippe immunceller fra endotelial overflate. Dette kan forebygges ved ensuring at alle silikonslanger og adaptere perfundert med vaskebuffer før tilkobling, at alle luftbobler er fjernet og at media er forvarmet før bruk. Ved tilkobling av adaptere til portene på microslide er det svært viktig at det er en væske / væske-grensesnittet under tilkobling, hvis det er noe luft da dette vil danne en luftspalte i systemet som vil forstyrre endothelial monolayer under sprøyten tilbaketrekking trinn. Den leukocytter oppløsning i sprøytesylinderen trenger regelmessig agitering for å sikre at cellene ikke slå seg, og dermed opprettholde en konstant celletetthet gjennom hele eksperimentet.
Under opptaksfremgangsmåten er det viktig å sikre at bildet av den endoteliale lag er tilstrekkelig konsentrert og klar til å tillate nøyaktig analyse frakoblet, og at i løpet av det andre trinnet av strømnings assay (post leukocytter bolus) at tilstrekkelig tid er igjen i løpet av vaskebuffer fasen før opptaket påbegynnes for å sikre atalle ikke-festede leukocytter fjernes. Likeledes er det viktig å bruke endotelceller i et monosjikt av passende tetthet for å hindre tap av celler som kan forstyrre strømningsmønster i trange kapillarer og også kan være vanskelig å skille fra større adherente leukocytter i henhold til fasekontrastmikroskopi. Vi har beskrevet optimal seeding tetthet for humane sinusformet endotelceller, men dette kan variere mellom ulike endothelial populasjoner og arter.
Betydelige framskritt er gjort i å studere leucocyte rekruttering i dyremodeller med intramikroskopi. Den store fordelen med strømnings adhesjon bestemmelsesmetoden er at leukocytter rekrutteringen kan studeres i et binært system med primære humane endotelceller. Videre kan disse interaksjonene studeres under fysiologiske relevante nivåer av skjærspenning. Det er viktig å få bekreftet funn av intra studier i dyr med menneskelige cellulære systemer som det kan være forskjelleres i endothelial egenskaper mellom arter. En av begrensningene i den flyt-analysen er at leukocytter rekruttering blir studert i en encellet miljø av endotelial monolayer. I tillegg når leukocyttene er overholdt, og transmigrated tvers av endotelet kan de ikke være i tilstede i tilstrekkelig antall til å bli isolert og utsatt for nedstrømsprosesser.
Til tross for disse begrensninger, når strømnings adhesjon analyse er blitt mestret det kan utvikles for å utføre videre analyse av leukocytt adhesjon kaskade, og innrettet til å rekapitulere en flercellet miljø. Langvarig opptak av enkelt felt og bruk av sporing kan brukes til å analysere krypende oppførsel av leukocyttene. Videre ved gjennomføring av flyt-test microslides kan bli avhørt ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi og immunofluorescent merking for å studere vedheft og sjelevandring i mer detalj. I tillegg har vi tidligere utviklered en in vitro-modell der strømmer leukocytter kunne interagere med hepatisk endotel betinget av tilstedeværelsen av hepatocytter. Denne analysen kan også bli utviklet for å studere subpopulasjoner av leukocytter: vår gruppe har utført studier med undergrupper som regulatoriske T-celler, B-celler, og lever infiltrere leukocytter.
Disse studiene er bevis for at flyten vedheft analysen er et kraftig verktøy for å studere generell og organspesifikk leucocyte rekruttering i menneskelige systemer.
The authors have nothing to disclose.
SS er finansiert av en Wellcome Trust Intermediate Klinisk Fellowship, CW av en Wellcome Trust Programme Grant.
Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |