Affinity-baserede Isolering af Tagged Kerner fra<em> Drosophila</em> væv til genekspressionsanalyse
Summary
Drosophila væv ofte indeholder en heterogen blanding af celletyper. For at undersøge genekspression i specifikke celletyper fra et bestemt væv, kan kerner genetisk mærkede og efterfølgende isoleret ved anvendelse af en affinitet tilgang. Isolerede kerner kan anvendes til efterfølgende anvendelser, såsom genekspression analyse og kromatin immunofældning.
Abstract
Drosophila melanogaster embryoner og larvernes væv indeholder ofte en stærkt heterogen blanding af celletyper, som kan komplicere analyse af gen-ekspression i disse væv. Således at analysere cellespecifikke genekspressionsprofiler fra Drosophila væv, kan det være nødvendigt at isolere specifikke celletyper med høj renhed og i tilstrækkelige udbytter for efterfølgende anvendelser såsom transkriptionelle profilering og kromatin immunofældning. Den uregelmæssige cellemorfologi i væv, såsom det centrale nervesystem, kombineret med den sjældne population af specifikke celletyper i disse væv, kan imidlertid være en udfordring for traditionelle celleisolering såsom laser mikrodissektion og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) . Her er en alternativ metode til at karakterisere cellespecifikke genekspressionsprofiler hjælp affinitet baseret isolation af mærkede kerner snarere end hele celler, er beskrevet. Kerner i specifikke cell type interesse er genetisk mærket med en nuklear kuvert lokaliseret EGFP tag ved hjælp af Gal4/UAS binære udtryk system. Disse EGFP-mærkede kerner kan isoleres ved anvendelse af antistoffer mod GFP, der er koblet til magnetiske perler. Beskrevet i denne protokol fremgangsmåde giver ensartet isolering af kerner fra specifikke celletyper i Drosophila larvestadiet centralnervesystemet ved høj renhed og i tilstrækkelige niveauer til ekspression analyse, selv når disse celletyper omfatter mindre end 2% af den totale cellepopulation i væv. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at isolere kerner fra en bred vifte af Drosophila embryo-og larvernes celletyper ved hjælp af særlige Gal4 drivere og kan være anvendelige til isolering af kerner fra celletyper, der ikke er egnet til FACS eller laser mikrodissektion.
Introduction
Drosophila væv, såsom det centrale nervesystem indeholder en kompleks blanding af celletyper. Således at analysere cellespecifikke genekspressionsprofiler fra Drosophila væv, er det først nødvendigt at isolere en homogen population af specifikke celler i tilstrækkelige mængder til at muliggøre efterfølgende anvendelser. Metoder til at isolere celler fra intakte væv omfatter laser mikrodissektion og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af hele celler. Mens FACS er blevet anvendt til at isolere celler og kerner fra Drosophila embryoner og fra Caenorhabditis elegans til genekspression og kromatin profilering 1-3 kan FACS og laser mikrodissektion være vanskeligt at udføre med succes i væv, der indeholder stærkt blandede celletyper eller indeholder celler med uregelmæssig morfologi, såsom neuroner. For at overvinde denne vanskelighed kan kerner snarere end celler isoleres fra specifikke celletyper og anvendes til senere gene udtryk profilering. Vigtigere er det, microarray-baserede mRNA-ekspression analyse ved hjælp af stikprøver nukleare RNA generelt viser sammenlignelige resultater med at udføres ved hjælp af total RNA 4, 5. Desuden har genekspressionsanalyse ved hjælp af kerne-RNA med held blevet anvendt til at undersøge genekspression i flere organismer, herunder C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, og mennesker 4, 5 2, 3.
Adskillige fremgangsmåder er for nylig blevet beskrevet til isolering af specifikke populationer af mærkede kerner fra Drosophila væv, der er egnet til genekspression analyse og / eller kromatin immunofældning. Det parti isolering af vævsspecifikke kromatin for immunudfældning (BITS-chip) metode udnytter FACS at isolere faste kerner på grundlag af celle-specifikke udtryk for nuklear-lokaliseret GFP 2. Denne fremgangsmåde har været successfully anvendt til at analysere fordelingen af histon modifikationer og transkriptionsfaktorer hjælp kromatin immunofældning af isolerede kerner fra mesoderm af Drosophila-embryoner 2. Dog kan FACS tilgange være mindre egnede til at isolere mærkede kerner, der kun udgør en lille del af en blandet population på grund af den øgede sortere nødvendige tid til at få passende tal for efterfølgende anvendelser. For at overvinde disse begrænsninger har flere grupper udnyttet affinitetsbaserede isoleringsmetoder at oprense kerner, der er mærket med en specifik epitop i en bestemt celletype. Isoleringen af kerner opmærket i specifikke celletyper (INTACT), der er udviklet til brug i Arabidopsis thaliana 6, 7 er for nylig blevet tilpasset til anvendelse i Drosophila 8. I denne metode, en fusion kernemembranen protein, der er et substrat for in vivo biotinylering er coexpressed med Escherichia coli biotin ligase BirA i bestemte celletyper. Biotin-mærkede kerner efterfølgende kan oprenses fra blandede populationer ved hjælp af streptavidin-baserede affinitet isolation. Med denne fremgangsmåde blev kerner held mærkes og isoleret fra mesoderm Drosophila embryoer, hvor en fusion kernemembranen protein blev udtrykt under kontrol af en mesoderm-specifik forstærker 8. Forfatterne genererede proteiner cellekernekappen fusionsproteiner, der kan udtrykkes i en hvilken som helst celletype under kontrol af Gal4 regulatorisk sekvens, UAS 9. Denne fremgangsmåde er i stand til hurtigt at isolere undergrupper af mærkede kerner fra blandede populationer, men kræver tre separate transgene konstruktioner og kan derfor være uegnet til bestemte genetiske anvendelser. For nylig er en tilgang blevet beskrevet, hvor SUN (S AD1 og FN C-84) domæne-holdige proteiner, der lokaliserer til den indre membran af det nukleare kuvert blev mærket medfluorescerende proteiner og udtrykkes under kontrol af Gal4/UAS systemet 10. Kerner blev isoleret i nærværelse af ikke-ionisk detergent for at fjerne den ydre membran af kernemembranen og affinitetsrenset under anvendelse af magnetiske perler koblet til anti-GFP-antistoffer. Denne fremgangsmåde blev anvendt med succes til at isolere små populationer af mærkede kerner fra specifikke neuronale undertyper inden den voksne hjerne Drosophila 10..
Her er en protokol til isolering af mærkede kerner fra en blandet population af celler fra Drosophila larve væv beskrevet. Denne metode blev udviklet uafhængigt, men svarer til den fremgangsmåde, der er beskrevet af Henry et al. 10. Først blev kerner mærket med en fluorescerende tag, der kun udtrykkes i specifikke celletyper i Drosophila melanogaster at lette den efterfølgende isolering af mærkede kerner fra blandede populationer ved hjælp af en affinitet tilgang. For at markere kerner,Den Kash (K larsicht / NC-1 / S yn h omology) Domænet blev udnyttet. Den Kash domæne er et transmembrandomæne som lokaliseres til den ydre membran af nukleare kuvert, dels gennem interaktioner med SUN domæne-holdige proteiner i den perinukleære rum 11.. Den C-terminale kash domæne af proteiner, såsom Drosophila Msp-300 og Klarsicht forankrer disse proteiner til den ydre kernemembranen, medens deres N-terminale domæner interagerer med cytoskeleton proteiner såsom actin eller mikrotubuli i cytoplasmaet 12-14. Konstruktioner blev genereret, hvor Kash domæne af Drosophila Msp-300 blev fusioneret til den C-terminale ende af EGFP under kontrol af Gal4 regulatorisk sekvens, UAS i pUAST-attB vektor 15, 16. Brug phiC31 stedspecifik integration, blev transgene fluer genereret hvori UAS-EGFP :: Msp-300 Kash transgen blev indsat i attP2 loci på kromosom3L 17.. UAS-EGFP :: Msp-300 Kash fluer kan krydses med fluer, der udtrykker Gal4 chauffør i en særlig celletype, hvilket resulterer i den målrettede ekspression af EGFP på den ydre kernemembranen i celletypen af interesse. Mærkede kerner kan derefter oprenses fra blandede cellepopulationer under anvendelse af antistoffer mod GFP koblet til magnetiske perler. I denne fremgangsmåde er anvendelsen af ikke-ioniske detergent ikke påkrævet, fordi EGFP tag er lokaliseret til den cytoplasmatiske side af den ydre kernemembranen og er derfor tilgængelige for antistoffer.
Den nedenfor beskrevne protokol kan anvendes til at isolere / berige EGFP-mærkede kerner fra specifikke celletyper i Drosophila larve væv at kvantificere renhed og udbytte af isolerede kerner, og at udvinde nukleart RNA egnet til kvantitativ revers-transkription-polymerase-kædereaktion (QRT -PCR) genekspressionsanalyse. Isoleringen og affinitet-oprensning af kerner (undtagen tissue dissektion) kan udføres i mindre end en time. Resultaterne er vist viser, at glial kerner held kan isoleres fra larve optik lap og øjne imaginal disc, og anvendes til senere genekspressionsanalyse. Det forventes, at denne tilgang vil være nyttig for isolering / berigelse af mærkede kerner fra embryonale og larvernes væv, hvor målcellerne udgør mindre end 5% af den samlede befolkning. Alle Drosophila aktier og plasmider genereres i denne undersøgelse er tilgængelige fra forfatterne efter anmodning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol kan bruges til at isolere eller meget berige specifikt mærkede kerner fra blandede cellepopulationer i Drosophila embryonale eller larvernes væv. Ved hjælp af denne protokol, kan kerner isoleres fra dissekerede væv i cirka 1 time. Renheden og udbyttet af de isolerede kerner skal bestemmes eksperimentelt for hver celletype. Det kan være svært at kvantificere perle-bundne kerner på post-isolation etape af protokollen ved hjælp af en hemocytometer grund af perlerne er til stede i prøven. S?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Janice Fischer for at levere UAS-EGFP :: MSP-300 Kash plasmid. Den mAB24B10 antistof blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank udviklet i regi af NICHD og vedligeholdes af University of Iowa, Biologisk Institut. Repo-GAL4 lager (BL7415) blev opnået fra Bloomington Stock Center på Indiana University. Støtte fra American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) til Purdue University Center for Cancer Research er taknemmeligt anerkendt. Jingqun Ma er understøttet af en Agricultural Research ved Purdue undervisningsopholdet i Fødevarer og Landbrug fra Purdue University.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
