L'isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em> Drosophila</em> tessuti per Gene Expression Analysis
Summary
Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.
Abstract
Tessuti embrionali e larvali Drosophila melanogaster spesso contengono una miscela altamente eterogeneo di tipi di cellule, che può complicare l'analisi di espressione genica in questi tessuti. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, potrebbe essere necessario isolare specifici tipi cellulari con elevata purezza e con rese sufficienti per applicazioni a valle come profiling trascrizionale e cromatina immunoprecipitazione. Tuttavia, la morfologia cellulare irregolare in tessuti come il sistema nervoso centrale, insieme con la rara popolazione di specifici tipi cellulari in questi tessuti, può porre problemi per i metodi tradizionali di isolamento cellulare come microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) . Qui, un approccio alternativo alla caratterizzazione dei profili di espressione genica specifica delle cellule utilizzando a base di affinità isolamento dei nuclei con tag, piuttosto che cellule intere, è descritto. Nuclei in c specificatipo ell di interesse sono geneticamente etichettati con un tag EGFP busta localizzato nucleare utilizzando il sistema di espressione binario Gal4/UAS. Questi nuclei EGFP-tag possono essere isolate utilizzando anticorpi contro GFP che sono accoppiati a biglie magnetiche. L'approccio descritto in questo protocollo consente un isolamento uniforme di nuclei di specifici tipi cellulari nel sistema nervoso centrale larvale Drosophila ad elevata purezza ed a livelli sufficienti per l'analisi di espressione, anche quando questi tipi cellulari rappresentano meno del 2% della popolazione totale di cellule nella tessuto. Questo approccio può essere utilizzato per isolare i nuclei da un'ampia varietà di Drosophila embrionale e tipi cellulari larvali utilizzando specifici driver di GAL4, e può essere utile per isolare i nuclei da tipi di cellule che non sono adatti per FACS o microdissezione laser.
Introduction
Tessuti Drosophila come il sistema nervoso centrale contengono una miscela complessa di tipi cellulari. Così, per analizzare profili di espressione genica specifica-cellulari da tessuti di Drosophila, è prima necessario isolare una popolazione omogenea di cellule specifiche in quantità sufficienti per consentire applicazioni a valle. Metodi per isolare cellule da tessuti intatti includono microdissezione laser e cella fluorescenza-attivato (FACS) di cellule intere. Mentre FACS è stato usato per isolare cellule e nuclei da embrioni di Drosophila e da Caenorhabditis elegans per l'espressione genica e cromatina profiling 1-3, FACS e microdissezione laser possono essere difficili da eseguire con successo nei tessuti che contengono tipi cellulari altamente mescolati tra loro o che le cellule contengono con morfologia irregolare, come i neuroni. Per superare questa difficoltà, nuclei piuttosto che cellule possono essere isolate da specifici tipi cellulari e utilizzati per la successiva generazionee profili di espressione. È importante sottolineare che, in base microarray-mRNA analisi di espressione utilizzando campioni di RNA nucleari mostra i risultati generalmente comparabili con quelli eseguiti utilizzando RNA totale 4, 5. Inoltre, l'analisi di espressione genica utilizzando RNA nucleare è stato usato con successo per studiare l'espressione genica in organismi multipli compresi C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, e gli esseri umani 4, 5 2, 3.
Diversi approcci sono stati recentemente descritto per l'isolamento di specifiche popolazioni di nuclei etichettati da tessuti di Drosophila che sono adatti per l'analisi di espressione genica e / o immunoprecipitazione della cromatina. L'isolamento lotto di cromatina tessuto-specifico per il metodo di immunoprecipitazione (bit-Chip) utilizza FACS per isolare nuclei fissati sulla base di cellula-tipo particolare espressione di GFP nucleare localizzata 2. Questo approccio è stato successfully utilizzato per analizzare la distribuzione delle modificazioni degli istoni e fattori di trascrizione con cromatina immunoprecipitazione di nuclei isolati dal mesoderma di Drosophila embrioni 2. Tuttavia, gli approcci basati FACS possono essere meno adatti per isolare nuclei etichettati che costituiscono solo una piccola parte di una popolazione mista a causa della maggiore tempo liste necessario avere numeri adatti per applicazioni a valle. Per superare queste limitazioni, diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di isolamento a base di affinità per purificare nuclei che sono etichettati con un epitopo specifico in un particolare tipo di cellula. L'isolamento dei nuclei contrassegnati in tipi cellulari specifici metodi (intatto) sviluppati per l'utilizzo in Arabidopsis thaliana 6, 7 è stato recentemente adattato per l'uso in Drosophila 8. In questo metodo, una proteina dell'involucro fusione nucleare che è un substrato per in vivo biotinylation è coexpressed con l'Escherichia coli biotina ligasi Bira in tipi cellulari specifici. Nuclei marcati con biotina possono essere successivamente purificati da popolazioni miste che utilizzano basato streptavidina-isolamento affinità. Usando questo approccio, i nuclei sono stati etichettati con successo e isolato dal mesoderma di embrioni di Drosophila in cui una proteina dell'involucro fusione nucleare è stato espresso sotto il controllo di un potenziatore specifico mesoderma 8. Gli autori hanno anche generate proteine dell'involucro di fusione nucleare che possono essere espressi in qualsiasi tipo di cellula sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS 9. Questo approccio è in grado di isolare rapidamente sottoinsiemi di nuclei etichettati da popolazioni miste, ma richiede tre costrutti transgenici separati e può quindi essere inadatto per applicazioni particolari genetici. Recentemente, un approccio è stato descritto in cui SUN (S AD1 e C-84 ONU)-dominio contenente proteine che localizzano alla membrana interna dell'involucro nucleare sono stati contrassegnati conproteine fluorescenti ed espresso sotto il controllo del sistema Gal4/UAS 10. I nuclei sono stati isolati in presenza di detergente non ionico per rimuovere la membrana esterna della membrana nucleare, e purificati per affinità utilizzando biglie magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP. Questo approccio è stato utilizzato con successo per isolare piccole popolazioni di nuclei etichettati da specifici sottotipi neuronali all'interno del cervello adulto di Drosophila 10.
Qui, un protocollo per l'isolamento di nuclei etichettati da una popolazione mista di cellule di Drosophila tessuto larvale è descritto. Questo metodo è stato sviluppato in modo indipendente, ma è simile a quello descritto da Henry et al. 10 In primo luogo, i nuclei sono stati etichettati con un tag fluorescente che viene espresso solo in specifici tipi cellulari in Drosophila melanogaster per facilitare il successivo isolamento di nuclei contrassegnate da popolazioni miste utilizzando un approccio basato affinità. Per etichettare nuclei,il dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omologia) è stato utilizzato. Il dominio KASH è un dominio transmembrana che localizza alla membrana esterna della busta nucleare, in parte attraverso le interazioni con SUN-dominio contenenti proteine all'interno dello spazio perinucleare 11. Il dominio KASH C-terminale delle proteine come Drosophila Msp-300 e Klarsicht ancore queste proteine alla membrana nucleare esterno, mentre i loro domini N-terminale interagiscono con proteine del citoscheletro actina o come microtubuli nel citoplasma 12-14. Costrutti sono stati generati in cui il dominio KASH di Drosophila Msp-300 è stata fusa al C-terminale della EGFP, sotto il controllo della sequenza regolatrice GAL4, UAS nel vettore pUAST-attB 15, 16. Utilizzando integrazione sito-specifica phiC31, sono stati generati moscerini transgenici in cui le UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgene è stato inserito nel attP2 loci sul cromosoma3L 17. Il UAS-EGFP :: Msp-300 KASH aria può essere attraversato con le mosche che esprimono il conducente GAL4 in un particolare tipo di cellula, con conseguente espressione mirata di EGFP sulla membrana nucleare esterno nel tipo cellulare di interesse. Nuclei etichetta possono essere purificati da popolazioni di cellule miste che utilizzano anticorpi contro GFP accoppiati a sfere magnetiche. In questo approccio, l'uso di detergente non ionico non è necessaria perché il tag EGFP è localizzato sul lato citoplasmatico della membrana nucleare esterno, ed è quindi accessibile agli anticorpi.
Il protocollo descritto di seguito può essere utilizzata per isolare / arricchire nuclei EGFP-etichettata specifici tipi cellulari in Drosophila tessuti larvali, per quantificare la purezza e resa di nuclei isolati, e per estrarre RNA nucleare adatto per trascrizione inversa reazione polimerasica a catena quantitativa (qRT -PCR) analisi di espressione genica. L'isolamento e l'affinità purificazione dei nuclei (esclusi Tissue dissezione) può essere eseguito in meno di un'ora. I risultati sono presentati mostrando che i nuclei gliali possono essere isolati con successo dal lobo ottica larvale e occhio disco immaginale, e utilizzati per la successiva analisi di espressione genica. Si prevede che questo approccio possa essere utile per l'isolamento / arricchimento di nuclei etichettati da tessuti embrionali e larvali in cui le cellule bersaglio costituiscono meno del 5% della popolazione totale. Tutte le scorte Drosophila e plasmidi ottenuti da questo studio sono disponibili su richiesta degli autori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo può essere utilizzato per isolare o altamente arricchire specificamente nuclei contrassegnati da popolazioni di cellule miste in Drosophila embrionale o tessuti larvali. Usando questo protocollo, i nuclei possono essere isolate dai tessuti sezionati in circa 1 ora. La purezza e resa dei nuclei isolati devono essere determinati sperimentalmente per ogni tipo di cellula. Può essere difficile quantificare i nuclei del tallone con associazione nella fase post-isolamento del protocollo utilizzand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Janice Fischer per la fornitura del plasmide UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. L'anticorpo mAB24B10 è stato ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Banca sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Biologia. Lo stock repo-GAL4 (BL7415) è stato ottenuto dal Bloomington Stock Center presso l'Indiana University. Supporto dalla American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) alla Purdue University Center for Cancer Research è riconosciuto con gratitudine. Jingqun Ma è supportato da una ricerca agricola presso la Purdue assistentato in alimentazione e l'agricoltura presso la Purdue University.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
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