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Biology

标记的细胞核从亲和力为基础的隔离 doi: 10.3791/51418 Published: March 25, 2014

Summary

果蝇组织中往往含有细胞类型的非均相混合物。为了检验从一个特定的组织特异性细胞类型的基因表达,细胞核可遗传标记,随后使用具有亲和力为基础的方法分离出来。分离的细胞核,可用于下游应用,如基因表达分析和染色质免疫沉淀。

Abstract

果蝇胚胎和幼虫组织往往含有细胞类型的一种高度非均质混合物,其可以在这些组织中复杂的基因表达的分析。因此,分析从果蝇组织细胞特异性基因的表达谱,这可能是必要的隔离具有高纯度,并在足以产量为下游应用,如转录谱和染色质免疫沉淀特定的细胞类型。然而,在组织中,如对中枢神经系统的不规则细胞形态,再加上在这些组织中的特定细胞类型的罕见群体,可以构成挑战的细胞分离分拣的传统方法,如激光显微切割和荧光激活细胞分选术(FACS) 。这里,另一种方法使用标记的核的基于亲和力的隔离,而不是整个细胞特征的细胞特异性基因表达图谱进行说明。在特定的C核感兴趣的ELL类型的基因标记使用GAL4/UAS双元表达系统中的核膜本地化EGFP标记。这些EGFP-标记的细胞核可以使用抗GFP被耦合到磁性小珠分离。在这个协议中描述的方法使晶核一致隔离从果蝇幼虫中枢神经系统在高纯度和足够的水平进行表达分析特定类型的细胞,即使这些细胞类型中包括的总的细胞群体的少于2%组织。这种方法可以被用来从各种各样的果蝇胚胎,并采用特定的Gal4驱动幼虫细胞类型的分离的细胞核,并且可以是从那些不适合用于FACS或激光显微切割的细胞类型中分离细胞核有用。

Introduction

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果蝇组织例如中枢神经系统包含的细胞类型组成的复杂混合物。因此,分析从果蝇组织细胞特异性的基因表达图谱,它首先要分离特定细胞的同源性的群体以足够的数量,以使下游应用。方法来分离从完整组织细胞包括激光显微切割和荧光激活细胞的全细胞的分选(FACS)。而FACS已用于分离细胞和细胞核从果蝇胚胎和秀丽隐杆线虫基因表达和染色质分析1-3,流式细胞仪和激光显微切割可能难以在包含高度混杂的细胞类型或包含细胞的组织中成功地执行不规​​则形态,如神经元。为了克服这个困难,核,而不是细胞可以从特定的细胞类型中分离出来,并用于随后根E蛋白表达谱。重要的是,利用核RNA样品微阵列基因表达分析显示,总体比较的结果与使用总RNA 4,5的执行。此外,当使用核RNA的基因表达分析已经成功地用于研究基因表达的多种生物,包括C。线虫拟南芥果蝇和4,5 2,3。

几种方法最近已被描述为从果蝇组织是适合于基因表达分析和/或染色质免疫标记的细胞核的特定人群的隔离。组织特异性染色质免疫沉淀(BITS-CHIP)方法的批次隔离采用流式细胞仪分离固定核细胞类型特异性核本地化的绿色荧光蛋白2表达的基础上。这种做法一直苏ccessfully用于分析的组蛋白修饰和转录因子的使用分离的细胞核的染色质免疫沉淀从果蝇胚胎2的中胚层的分布。然而,基于FACS的方法可能不太适合于分离构成,由于需要获得合适的数量为下游应用的增加排序时间只有一小部分的混合群体的标记的细胞核。为了克服这些限制,几个小组已经利用基于亲和力的分离技术来净化该被标记为在特定细胞类型的特定表位的核。细胞核标记在特定细胞类型(完整)的方法在拟南芥6,7中使用而开发的隔离最近已适于在果蝇 8使用。在该方法中,核膜融合蛋白的底物在体内生物素化是coexpresSED与大肠杆菌生物素连接酶BirA的在特定细胞类型。生物素标记的细胞核可以通过使用链霉亲和亲和隔离混合人群随后纯化。使用这种方法,细胞核被成功标记和分离,其中,核膜融合蛋白,下一个胚层特异性增强子8的控制下表达果蝇胚胎的中胚层。作者还生成可以在任何细胞类型下的Gal4的调控序列,9无人机系统的控制下表达核膜融合蛋白。这种方法能够快速分离由混合种群标记的细胞核的子集,但需要三个独立的转基因构建体,因此可能不适合于特定基因的应用。最近,一个方法已经被描述,其中孙(S AD1和UN C-84),该定位于核膜的内膜结构域的蛋白,具有标记荧光蛋白,并根据GAL4/UAS系统10的控制下表达。细胞核中分离出的非离子型洗涤剂的存在下除去核膜的外膜,并使用连接到抗GFP抗体的磁珠亲和纯化。这种方法被成功用于隔离果蝇 10的成年大脑内特定神经元亚型标记的细胞核的小种群。

这里,一个协议,用于从果蝇幼虫的组织细胞的混合群标记的细胞核的分离进行说明。这种方法是独立开发的,但是类似于由Henry 等人 10首先描述的方法中,细胞核被标记为与表示仅在果蝇特定的细胞类型,以方便标签的原子核的随后分离从混合群体的荧光标记用亲和力为基础的方法。要标记细胞核,该KASH(K larsicht / A NC-1 / S炔ħomology)域名已动用。该KASH域是定位于核膜通过与核周腔11内SUN结构域的蛋白相互作用的外膜,部分的跨膜结构域。蛋白质,例如果蝇 MSP-300和Klarsicht的C-末端KASH结构域锚定这些蛋白质与外核膜,而它们的N-末端结构域与细胞骨架蛋白,如肌动蛋白或微管在细胞质12-14交互。生成构建体,其中果蝇 MSP-300的KASH结构域融合到EGFP的C-末端,在Gal4的调控序列,UAS在pUAST-attB位向量15,16的控制。使用phiC31位点特异性整合,产生的转基因果蝇其中UAS-EGFP :: MSP-300 KASH的基因被插入到染色体上的基因座attP2位3L 17。UAS-EGFP :: MSP-300 KASH苍蝇可越过与果蝇表达Gal4驱动子在特定的细胞类型,产生的绿色荧光蛋白在感兴趣的细胞类型的外核膜的靶向表达。标记的细胞核然后可以从使用​​抗GFP耦合到磁珠混合细胞群纯化。在这种方法中,不需要使用非离子洗涤剂是因为EGFP标记被定位于外核膜的胞质侧,因此接触到的抗体。

下面描述的协议可以被用于分离/从果蝇幼虫组织的特定细胞类型丰富EGFP-标记的细胞核,以量化的纯度和分离的细胞核的产量,并提取核RNA适于定量逆转录聚合酶链反应(实时定量-PCR)的基因表达分析。细胞核的分离和亲和纯化(不含布甲Ë夹层)可以在​​不到一小时内完成。结果列显示,胶质细胞核可以成功地从幼虫视叶和眼成虫盘分离,并用于随后的基因表达分析。可以预料,这种方法将是标记的细胞核的从其中靶细胞构成总人口的5%以内的胚胎和幼虫组织的分离/富集有用。 果蝇的所有股票和在这项研究中产生的质粒可从应要求作者。

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Protocol

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1。绿色荧光蛋白的产生和表征:: KASH 果蝇

  1. 十字Gal4的驱动飞往UAS-EGFP :: MSP-300 KASH苍蝇。可替换地,可以使用标准的基因工程技术来产生重组苍蝇,可以同时携带Gal4驱动子和UAS-EGFP :: MSP-300 KASH转基因。这第二种方法是有利的,如果需要大量的后代。
  2. 表征采用标准的显微技术的EGFP :: KASH标志物的表达。注意:EGFP的表达可以通过标准显微镜技术在解剖,固定果蝇组织中观察到的,或者在整个幼虫,并且不要求使用的抗体。
    1. 确定EGFP的表达模式:: KASH标记在整个生物体的荧光解剖显微镜下(参见材料PDF)。注:很多Gal4的驱动程序,包括图1所示的回购GAL4驱动,展览Ñ在其它幼体组织如唾液腺表达onspecific图案(见结果)。
    2. 分析利益利用共聚焦显微镜解剖组织的EGFP :: KASH的表达模式。
      1. 用甲醛在4%用DAPI为0.1微克/毫升的最终浓度以可视化的EGFP的本地化:: KASH标签相对于DNA的终浓度,并染色的DNA修复所关注的组织。
      2. 使用一个40X / 1.30油浸物镜或20X / 0.75油浸物镜,视所关注的组织的大小获取图像。下面的激发/发射条件,可用于图像采集:408 nm/425-475纳米(DAPI); 488纳米/ 525-550毫微米(GFP)。

2。从果蝇幼虫组织中分离出核

  1. 准备设备的幼虫组织解剖及随后的核隔离。需要注意的是整个dechorionated胚胎也可以用作如果需要的起始原料。它建议使用局部解剖幼虫组织,而不是整个幼虫如果感兴趣的细胞类型是存在于一个特定的组织如成虫盘。这降低了非特异性结合,并且也消除了,可以通过在非靶细胞中某些Gal4的司机的表达而引起的问题。
    1. 准备两对锋利的钳子(参见材料PDF),1硅化9阱玻璃板(参见材料PDF)和PBT(1×PBS,pH 7.4的0.1%的Tween-20)。
    2. 的prebind GFP的抗体的磁珠。这一步应该在开始解剖前启动。加入10μl的磁珠(Invitrogen公司,见材料PDF)和2微克GFP抗体(罗氏公司,见材料PDF),以400微升的洗涤缓冲液(1×PBS,pH为7.4; 2.5毫摩尔MgCl 2)在1.5ml管。使用有孔玻璃珠与抗体的量可以在必要时根据目标的SAM中的量进行优化PLE和抗体与珠的结合亲和力。
    3. 孵育珠和抗体与旋转至少30分钟,在室温下进行。
    4. 放置1.5 ml管包含珠子和抗体的磁性机架中(参见材料PDF),并允许珠结合到磁性为约1-2分钟。除去含有未结合的抗体上清,用1毫升移液管洗涤缓冲液中。珠粒将保持绑定到1.5 ml管上相邻的磁铁的一侧的壁上。
    5. 用1 ml洗漂珠两倍,在2.1.4节中描述的每个时间缓冲。从磁机​​架上卸下1.5 ml管和反转简单地混合珠,并在每个洗涤步骤洗涤缓冲液。
    6. 存储在洗涤缓冲液的抗体结合珠,直到准备继续执行步骤2.7。珠粒不应该被允许干出在协议中的任何阶段。
  2. 解剖幼虫组织中的PBT和解剖组织转移到一井的9井菜。通常情况下,从100三龄幼虫解剖视叶和眼成虫盘提供了足够的材料为下游基因表达分析如下细胞核分离。
  3. 冲洗分离的组织中核提取缓冲液(10mM HEPES-KOH,pH为7.5; 2.5毫摩尔MgCl 2,10 mM的KCl)中在1.5ml管中。传输孤立幼虫组织到1毫升Dounce匀浆(参见材料PDF)在冰上包含1ml新鲜核提取缓冲液。在冰上孵育5分钟。这是没有必要添加蛋白酶抑制剂如RNA是以下核隔离将被提取。
  4. 20笔画与松杵破坏组织,然后在冰上孵育样品10分钟以使细胞溶胀。提取细胞用15招跟紧杵细胞核。需要为不同的组织和细胞类型进行优化冲程的松和紧的杵的数目;过量均质化可导致剪切细胞核,而同质化不足,将无法从组织中提取的所有核。
  5. 过滤匀浆液,其中含有细胞核和细胞碎片,通过一个40微米的孔隙大小的过滤器(参见材料PDF)已预清洗与核匀浆缓冲液。收集在新管的过滤匀浆。
  6. 收集预分离样品以供后续分析,以确定核产量,细胞核完整性,并确定以原子核分离前靶基因的转录水平。
    1. 转移50微升过滤匀浆至新的1.5mL管中,使用移液管。这是预分离样品。加入500μlTrizol试剂(见材料PDF格式,注意事项),倒置混合,并储存在-20℃,随后的RNA分离(步骤3.1)。
    2. 转移20微升过滤匀浆至新的1.5毫升管。
      1. 加DAPI为0.1μg/ ml的终浓度,并且增量在冰上10分钟ubate样品。
      2. 转移DAPI染色细胞核到聚赖氨酸包被的盖玻片上,并放置在显微镜载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片。
      3. 检查细胞核完整性,及权益使用荧光显微镜GFP标记的细胞核的存在。注:这是没有必要修复细胞核,或染色的GFP,如果这些幻灯片进行了分析合理迅速下列准备工作(24小时内)。
    3. 取10μl匀浆过滤到一个新的1.5 ml管中,加入90微升的洗涤缓冲液(1×PBS,pH值7.4; 2.5毫米氯化镁2)。加DAPI为0.1μg/ ml的终浓度,并在冰上孵育10分钟。确定细胞核产量预分离样品中使用血球使用下一个10X的空气客观萤光计数DAPI阳性细胞核。
  7. 放置1.5 ml管包含(在2.1.6节的方法制备)在一个磁架的抗体结合珠,并允许磁珠绑定到磁铁至少2分钟在2.1.4节中描述。使用1毫升移液管的抗体结合珠除去洗涤缓冲液,并且从步骤2.5中添加过滤匀浆至1.5 ml管采用1毫升移液管。
  8. 轻轻颠倒离心管数次以混匀,孵育4℃,30分钟,最终在年底搅动。避免气泡中,如果可能的,因为这些可能会导致核的聚集管。
  9. 放置1.5 ml管含有抗体结合珠和匀浆中的磁架,并允许磁珠结合到磁体至少2分钟在第2.1.4节中描述。除去用1毫升移液管含有未结合的核部分的匀浆。
  10. 洗涤样品3次用1 ml洗,每次缓冲。除去1.5毫升的试管含有珠子,束缚核和从机架洗涤缓冲液和颠倒混合数次,然后如上所述将管内的磁性机架中在步骤2.9,并使用1毫升移液管去除上清。
  11. 加入150μl洗涤缓冲液至珠粒,应结合到靶细胞核。这是后分离样品。制备样品的显微分析和随后的RNA提取。
    1. 转移20μL 后隔离样品到新的1.5 ml管和染色用DAPI和在2.6.2节中描述分析。算的GFP + / DAPI +和GFP-/DAPI +磁珠捕获来确定富集的GFP +核的隔离后样品中的纯度的细胞核。
    2. 加入1 ml Trizol试剂的至后隔离样品的剩余部分,颠倒混合,并储存于-20℃用于后续的RNA分离(步骤3.1)。注意:在Trizol试剂的样品可以储存数周,如果必要,在-20℃下它没有必要从使用Trizol试剂磁珠之前提取RNA洗脱核,的becaus辰珠不干扰随后的RNA分离。

3。确定转录水平的原子核从幼虫组织中分离

  1. 使用Trizol试剂为基于RNA提取所述的标准协议(参见材料PDF)进行了以下修改制备章节2.6.1和2.11.2 预分离隔离后的样品分离RNA:
    1. 以下将RNA沉淀的沉淀,加19.2微升不含RNA酶的水和0.8微升RNASecure试剂(见材料PDF),以沉淀孵育,在60℃20分钟以灭活RNA酶。
  2. 确定RNA浓度用荧光-RNA结合的染料,如量子比特的RNA测定试剂盒(参见材料PDF)使用QubitR 2.0荧光遵循制造商的协议。
  3. 使用扩增逆转录酶如EpiScr合成cDNAIPT逆转录试剂盒和寡聚dT引物,按照生产商的说明进行操作。注意:通常情况下,RNA的50到100纳克产生足够的cDNA进行多重基因表达分析。 预分离隔离后的RNA等量应该被用来生成的cDNA。
  4. 添加180微升不含核酸酶的水至20微升cDNA样品稀释此10倍之前,实时定量PCR(定量PCR)分析。这种稀释是一个重要的步骤,因为未稀释的cDNA样品可以抑制定量PCR。
  5. 准备一个定量PCR主混合物与聚合酶和dNTP,各前进4皮摩尔和反向引物,由用无菌水加至20微升的最终反应体积。
    1. 设计的qPCR引物对目标预期可被表示为感兴趣的细胞类型的基因,并在在该组织被收集的发育阶段。设计引物,以跨越一个内含子,如果可能的话,使基因组和cDNA的PCR产物可以被区分开来。注意:如果靶细胞类型的基因表达模式是未知的,针对绿色荧光蛋白 ,其应在标签的细胞核群特异性表达的引物,可以被用来优化协议为特定的细胞类型和组织( 表1)。
  6. 通过比较以系列稀释的cDNA从整个组织制备确定的预分离隔离后的样品中每个感兴趣的基因的相对转录水平。靶基因的转录水平应该归到参考基因,如RPL32(或几个较好的参考基因)。

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Representative Results

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回购-GAL4驱动程序(布卢明顿库存号7415)在神经胶质细胞在果蝇神经系统在发育18的多个阶段特异性表达。被苍蝇产生稳定表达的UAS-EGFP :: MSP-300 KASH下使用标准的基因工程技术生产的回购GAL4驱动程序的控制权。表征EGFP的这些苍蝇的表达模式:: KASH转基因,绿色荧光蛋白的表达从三龄幼虫的解剖视叶和眼成虫盘的格局是利用共聚焦显微镜观察。解剖组织都经DAPI染色标记的DNA,并用α-chaoptin 19标记光感受器的轴突(mAb24B10, 见材料PDF)。 图1A表明回购GAL4驱动的EGFP :: KASH转基因表达在神经胶质细胞中的视叶和眼成虫盘在预期的表达模式。在更高的放大倍率,EGFP表达在周围的DAPI阳性的DNA,与绿色荧光蛋白的核被膜的定位一致:: KASH标签( 图1B)的圆形图案观察。 EGFP的表达既可以在固定和非固定的组织,而不需要使用抗体针对GFP信号扩增来检测;抗GFP不用于可视化的EGFP :: KASH表现在图1图2中所示的图像。要确定是否EGFP :: KASH转基因非特异性表达在果蝇幼虫的任何其他组织,GFP的表达用荧光解剖显微镜检查在整个三龄幼虫。值得注意的是,该绿色荧光蛋白的非特异性表达:: KASH转基因,观察到高水平的三龄幼虫的唾液腺。这表明回购GAL4驱动器具有活性比一些发展中的幼虫阶段的神经胶质细胞等细胞类型。因此,要明确地隔离GLI人的细胞核,从三龄幼虫视叶和眼成虫盘使用解剖之前,同质化和亲和力隔离分离。

以确认此协议适用于核的果蝇组织中提取,并以估计标签晶核存在于从视叶和眼组织匀浆得到一个给定的组织中, 预分离样品(2.6.2节)的百分比回购-GAL4的成虫盘,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH三龄幼虫进行了检查。 图2A示出了预分离样品的代表性图像使用共聚焦显微镜获得的。在这个图像时,晶核的存在是通过DAPI阳性事件的指示。还观察到少数稀疏散GFP阳性,DAPI阳性的神经胶质细胞核。我们估计,GFP阳性细胞核占总人口的原子核在此低于2%样品( 图2A)。从视叶和从100幼虫进行解剖该眼成虫盘的总细胞核产量如在2.6.3节( 表2)中所述的预分离样品进行测定。从100解剖视叶和眼0.8和1.2×10 7个核之间包含的成虫盘,其中约2%为GFP阳性的典型预分离样品。 图2B示出了在一个限定的区域DAPI阳性细胞核的代表图像血细胞计数仪。注意,这个核是完整的,并且在协议中使用( 图2A2B)的萃取条件下保持一致的圆形形状。

以确定是否该协议可以用于分离和/或高度富集标记的细胞核的特定人群从包含混合细胞群体的组织,α-GFP抗体包被的磁性小珠分别使用d可从视叶和100 回购GAL4,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH三龄幼虫眼盘表现得匀浆隔离标记的细胞核。在图2C2D中 ,可以看出,该绿色荧光蛋白:: KASH标签胶质细胞核结合到α-GFP包被的磁珠和后分离样品(第2.11.1)在下面的磁分离得到遵守。虽然磁珠表现出在GFP通道一些自发荧光,这些可以很容易地从珠粒结合的核通过其较小的尺寸(2.8微米的磁性微球与该核约5微米)和缺乏DAPI染色的鉴别。将GFP + / + DAPI细胞核占95%以上的隔离后样品中DAPI阳性事件。因此,目标标记的细胞核人口高度富集后的隔离相对于预分离的样品样品。多数在隔离后的样品展示强大的核信封本地化的GFP荧光,和核通常是由珠包围。然而,它可能是一个小数目未加标签的晶核也可以存在这样的。因此,尽管结果在图2C图3中的基因表达分析(见下文)表明,该目标标记的神经胶质细胞核人口高度富集的可能性,即从一些其它的非特异性细胞类型的部分细胞核也存在于样品中不能排除。建议用户优化这个协议,用于其特定的细胞类型和组织利益最大化的目标原子核人口的富集,消除非特异性的细胞核具有约束力。特别是,相对于起始材料,以抗体与微珠的比例可能是为靶核的最佳富集重要。由于这个原因,总的范围目前我国典型的预分离样品中的核数见表2。基于总细胞核数存在预分离样品中,和神经胶质细胞中的视叶和眼成虫盘的混合种群的比例估计,最大产量细胞核后分离样品中预计是1.6之间×10 5和2.4×10 5个核。然而,使用血细胞计数器来确定,如步骤2.6.3中描述的晶核产率, 后分离样品中得到的实际晶核产率为原子核之间1.3×10 4和2.7×10 4。这些核收益率代表,因为目前的隔离后样品中珠看上去影响血细胞计数仪精确的载荷非常粗略的估计。一些GFP阳性细胞核中未结合的匀浆观察到,这表明在不是所有的GFP阳性细胞核充分结合,有效地于本协议中使用的条件珠子。增加的结合或执行顺序的分离步骤的时间可能会增加此产量,但这可能出现在两个纯度和RNA完整性的成本。利用该协议中所描述的条件下,足量的RNA,可在隔离后的样品中通过qRT-PCR( 表2)下游的基因表达分析中获得。因此,该协议能够从含有细胞的混合群体组织迅速,严格隔离靶核。此外,它能够特异性隔离构成只有一小部分细胞在特定人群,小于5%,靶核。

为了进一步确认, 隔离后的样品被高度浓缩为我们的目标胶质细胞核人口,转录水平在预隔离 4种不同的基因隔离后的样品进行RT-qPCR的进行了比较。的ELAV,nrv2绿色荧光蛋白的转录物水平在两个样品中被测定,并归一化到参考基因,RPL32,这是表示在同等程度的神经胶质细胞和周围中枢神经系统( 图3)。后分离样品中的倍数差异是显示相对于预分离样品,它被设置为1。在图3中, 后隔离示例显示神经元特异性基因ELAV相对于预分离样品中的显著降低转录水平。这表明,从神经细胞细胞核代表性不足的隔离后样品中。与此相反,无论是胶质富含nrv2基因10绿色荧光蛋白的高转录水平存在于后伊索拉化相对于预分离样品的样品。这一结果表明,该隔离后试样高度富集的靶神经胶质细胞核人口。要注意,在这个协议测量的转录水平代表核成绩单是很重要的,因此很可能表明活跃转录的水平,而不是稳态mRNA的表达。无论是我们预先隔离隔离后样品中未检出回购的可重复的表达,这表明由回购GAL4驱动程序表达Gal4蛋白可内源性回购基因的转录激活后,坚持已停止。这与其它研究结果,其中核使用TWI启动子标记不显示TWI转录物的富集水平,可能是由于在转录与蛋白稳定性8的发育时间差异是一致的。德连接在一起,这些结果表明,所描述的协议可以被成功地用于高度富集靶核从含有细胞的混合群体的组织,并且所述分离的核是适合于基因表达分析。

图1
图1。 回购GAL4的表达模式,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH飞线(A)在三龄幼虫, 回购GAL4驱动器在光纤的UAS-EGFP :: MSP-300 KASH转基因在神经胶质细胞中的表达叶,视柄(OS)和眼成虫盘(ED)。在神经胶质细胞的核膜标记有绿色荧光蛋白:: KASH(绿色)。 R1 - R8感光细胞轴突用于​​比较标记的α-chaoptin(mAB24B10,红色)和DNA是站独立非执行董事用DAPI(紫色)。 GFP标记的神经胶质细胞核沿椎板(Ⅰ)的视叶内(以箭头标出)中可见。比例尺,50微米。 (B),其中包含EGFP :: KASH视叶的叶片神经节的高倍图像标记神经胶质细胞的细胞核。比例尺,50微米。使用一个被收购的共聚焦图像  40X / 1.30油或  20X / 0.75油浸物镜,并利用408 nm/425-475纳米(DAPI)激发/发射波长为488 nm的nm/525-550(GFP); 561 nm/595-620纳米(Alexa的5,6,8 )。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2。原子核的表征在“预隔离”和“后隔离”样本(A)代表图像从回购GAL4,UAS-EGFP ::使用X 20 / 0.75油浸物镜和标准的MSP-300 KASH 预分离样品分析共聚焦显微镜。的DNA用DAPI染色(蓝色),及绿色荧光蛋白:: KASH标签胶质细胞核显示为绿色(标以箭头)。比例尺,50微米。 ( 二)DAPI染色细胞核从利用X 10空中目标和标准落射荧光显微镜血细胞计数器的预分离样品的代表性形象。血球网格显示为浅灰色。仅DAPI阳性细胞核都显示在这个形象,GFP荧光是不可见下上落射荧光显微镜这一目标。 ( 三)回购GAL4,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 隔离后的样品代表形象如对于A组分析,分离EGFP :: KASH标签胶质细胞核(标明的箭头)染色积极为DAPI染色,并通过有孔玻璃珠,包围该autofluoresce在GFP的信道低的水平。比例尺,50微米。一个典型的孤立的绿色荧光蛋白:: KASH(四)高倍图像标记由珠包围胶质细胞核(箭头标记)。比例尺,5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3。从“预隔离”和“后隔离”样本代表性定量RT-PCR数据 。靶基因的转录水平被预先ISOL的定量RT-PCR检测从回购GAL4,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH视叶和眼成虫盘获得的振动性和隔离后的样品。所有的转录水平被归一化到RPL32的转录水平,并且预分离样品的每个基因的靶被设置为1。从一个生物实验代表性的结果示于下列基因:ELAV,nrv2绿色荧光蛋白

基因 引物序列(5'-3') 大小PCR产物(BP)
绿色荧光蛋白 GAGGGATACGTGCAGGAGAG 102
GATCCTGTTGACGAGGGTGT
nrv2 GGCTGGTTGTAGTCGCAGTT 125
GGCACCCAACACGAGAACTA
ELAV GCACCATTCGGAGCAATAAT 153
TGTGCAGCTGGATGGTGTAG
RPL32 GCTAAGCTGTCGCACAAATG 160
CGTTGTGCACCAGGAACTT

表1。用于定量RT-PCR分析的引物。

原子核在预分离样品总数 原子核在隔离后的样品预计总人数 从隔离后的样品RNA的产量(NG)
0.8 - 1.2×10 7 1.3 - 2.7×10 4 160-220纳克

表2。获得代表细胞核和RNA产量。前期的隔离隔离后的样品获得100解剖视叶,并从回购GAL4,UAS-EGFP :: MSP-300 KASH基因型,眼成虫盘原子核和RNA产量的典型范围在神经胶质细胞标记EGFP :: KASH。细胞核被量化为2.6.3中描述和3.1.2中所描述的RNA进行定量。

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Discussion

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这个协议可以用于分离或富集高度从在果蝇胚胎或幼虫组织的混合细胞群特异性标记细胞核。使用此协议,原子核可以从解剖组织中约1小时隔离。分离的核的纯度和产率,必须为每种细胞类型由实验确定。它可以是难以量化,因为在样品中存在的珠的珠结合的原子核在使用血细胞计数协议的隔离后阶段。因此,如果所需的下游应用核的确切数目,这将是必要估计的基础上的另一种方法,如DNA含量细胞核产量。细胞核产量的精确计算是没有必要的用于基因表达分析,如果RNA可以成功地分离和定量。这是推荐使用的基于荧光的方法,定量RNA的产量,因为我们已经发现,分光光度法测定RNA的浓度这些低浓度的样品中是高度可变的。

有协议的两个重要方面,这将影响其成功:磁珠和抗体的选择。可商购自多个不同的源极连接到GFP或蛋白G是磁珠。但是,强烈建议使用G蛋白磁性可自Invitrogen珠在本协议中主要有两个原因说明的程序。第一,Invitrogen公司的珠子在2.8微米的尺寸比核中,我们已经研究了细胞类型的平均粒径,这是约5微米( 图2D)略小。磁珠的体积更小( 例如,50纳米,μMACSα-GFP,美天旎生物技术)不会迅速结合到间歇式洗涤磁体,并且提供了这些珠的列可以与幼体组织提取物堵塞。更大的磁珠( 10微米,PureProteome G蛋白磁性bEADS,Millipore)上并没有很好地结合在我们的初步测试的核,而这些也显示出很强的自发荧光中的相同途径既DAPI和GFP,使其难以通过标准显微镜技术鉴定的珠结合的样品中的细胞核。除了磁珠的选择,它使用绿色荧光蛋白抗体,其可以很好地用于免疫沉淀,但不具有高的非特异性背景是很重要的。为了帮助在这个协议的可重复性,我们采用单克隆抗体鼠抗GFP。对GFP的多克隆兔抗体也试验成功在我们的初步研究,但这些往往有较高的非特异性背景。其它单克隆抗体,也进行( 例如发育研究杂交瘤库),具有不同程度的成功。因此,抗体的选择是在标记的细胞核的成功分离的重要因素。

虽然在这个协议中,我们描述的方法来DET在孤立的原子核貂基因的转录水平,但预计在步骤2.1-2.11描述的方法也将是适合于分离的细胞核,可用于随后的染色质免疫沉淀分析。如果组织是之前的同质化(步骤2.3)固定在1%甲醛,然后解剖组织可以收集在几天和足够的材料隔离,以进行染色质免疫沉淀分析。基于使用血球计数获得的,如上面所讨论的提供只是粗略的估计,我们通常获得1.3×10 4和从眼成虫盘和100的幼虫( 表2)视叶2.7×10 4胶质细胞的细胞核。因此,使用我们的方法中,应该是可行的,获得足够的材料进行染色质免疫沉淀分析,根据靶细胞类型的丰度,并且所关​​注的表位。

这TECHNI的一个有用的基因的应用阙是,它可以用来正标记细胞核中是纯合的隐性致死突变等位基因的胚胎或幼虫的特定细胞类型。要做到这一点,两个独立的飞股票必须生成在其中感兴趣的突变体等位基因的重组与特定的Gal4的驱动程序,或与第三染色体上的UAS-EGFP :: MSP-300 KASH转基因。如果苍蝇携带突变等位基因和Gal4的驱动程序都越过苍蝇携带突变等位基因和UAS-EGFP :: MSP-300 KASH转基因,后代只具有突变等位基因的两个副本中的组织将被贴上绿色荧光蛋白在其中Gal4驱动子被表达。因此,隐性致死等位基因的细胞特异性的效应可以事先向杀伤力的阶段被检查的胚胎或幼虫阶段。这种遗传技术已被以前使用的积极标记细胞在胚胎肌肉是纯合子突变的SAGA亚基,sgf11 1 </ SUP>。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们感谢关颖菲舍尔提供的UAS-EGFP :: MSP-300 KASH质粒。该mAB24B10抗体从NICHD的主持下制定的发展研究杂交瘤细胞银行获得由爱荷华大学生物系维持。该回购GAL4股票(BL7415)从布卢明顿库存中心在美国印第安纳大学获得的。支持美国癌症协会的机构研究资助(IRG#58-006-53)到普渡大学癌症研究中心的感谢。敬群马是由一个农业研究普渡大学助教在粮食和农业普渡大学的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) Roche 11814460001 This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX MidSci BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) Biotium 40011
Dounce Homogenizer (1 ml) VWR 62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm World Precision Instruments 14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10003D This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase Epicentre ERT12910K http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size VWR 21008-949 Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) Millipore LSKMAGS08 
Mini tube rotator Genemate H-6700
Qubit starter kit Life Technologies Q32871 Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion) Life Technologies AM7010 The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler BioRad CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9-well glass plate Hampton Research HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier Nightsea This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand Nikon SMZ 745
Thermal Cycler BioRad T100
Trizol reagent Life Technologies 15596018 CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20 Amresco 0777-1L

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标记的细胞核从亲和力为基础的隔离<em&gt;果蝇</em&gt;组织的基因表达分析
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Ma, J., Weake, V. M. Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (85), e51418, doi:10.3791/51418 (2014).More

Ma, J., Weake, V. M. Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (85), e51418, doi:10.3791/51418 (2014).

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