Affinity basert Isolering av Tagged Nuclei fra<em> Drosophila</em> Vev for Gene Expression Analysis

Summary

Drosophila vev inneholder ofte en heterogen blanding av celletyper. For å undersøke genekspresjon i spesifikke celletyper fra et bestemt vev, kan kjerner bli genetisk kodet og deretter isolert ved hjelp av en affinitets-baserte metode. Isolerte cellekjerner kan brukes til nedstrøms applikasjoner som genekspresjonsanalyse og kromatin immunoutfelling.

Abstract

Drosophila melanogaster embryonale og larve vev inneholder ofte en svært heterogen blanding av celletyper, noe som kan vanskeliggjøre analyse av genekspresjon i disse vev. Således, for å analysere cellespesifikk genekspresjonsprofiler fra Drosophila vev, kan det være nødvendig å isolere spesifikke celletyper med høy renhet og i tilstrekkelige utbytter for nedstrøms applikasjoner som transcriptional profilering og kromatin immunoutfelling. Imidlertid kan de irregulært cellulær morfologi i vev som det sentrale nervesystemet, kombinert med den sjeldne populasjon av spesifikke celletyper i disse vev, by på utfordringer for tradisjonelle metoder for celleisolasjon som laser mikrodisseksjon og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) . Her er en alternativ tilnærming for å karakterisere celle-spesifikk genekspresjon profiler ved hjelp av affinitets-baserte isolering av merkede kjerner, i stedet for hele celler, er beskrevet. Kjerner i den spesifikke cell type interesse er genetisk merket med et kjernefysisk konvolutt-lokaliserte EGFP tag bruker Gal4/UAS binære uttrykk system. Disse EGFP-merkede kjerner kan bli isolert ved hjelp av antistoffer mot GFP som er koplet til magnetiske kuler. Fremgangsmåten som beskrives i denne protokollen muliggjør jevn isolering av kjerner fra spesifikke celletyper i Drosophila larvesentralnervesystemet ved høy renhet og i tilstrekkelige nivåer for ekspresjon analyse, selv når disse celletypene utgjør mindre enn 2% av den totale cellepopulasjon i vev. Denne tilnærmingen kan brukes for å isolere kjernen fra et bredt utvalg av Drosophila embryo-og larvecelletyper ved å bruke spesifikke Gal4-drivere, og kan være nyttig for å isolere kjernen av celletyper som ikke er egnet for FACS eller laser mikrodisseksjon.

Introduction

Drosophila vev slik som sentralnerve-systemet inneholder en kompleks blanding av celletyper. Således, for å analysere cellespesifikk genekspresjonsprofiler fra Drosophila vev, er det først nødvendig å isolere en homogen populasjon av bestemte celler i tilstrekkelige mengder til å muliggjøre nedstrøms applikasjoner. Metoder for å isolere celler fra intakt vev omfatter laser mikrodisseksjon, og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) av hele celler. Mens FACS har blitt brukt for å isolere celler og kjerner fra Drosophila embryo og fra Caenorhabditis elegans for genekspresjon og kromatin profilering ^1-3, kan FACS og laser mikrodisseksjon være vanskelig å utføre med hell i vev som inneholder svært blandede celletyper eller som inneholder celler med uregelmessig morfologi, slik som nerveceller. For å overvinne denne vanskelighet, kan kjerner i stedet for cellene blir isolert fra bestemte celletyper, og som brukes for etterfølgende gene uttrykk profilering. Viktigere, microarray-baserte mRNA uttrykk analyse ved hjelp av kjernefysiske RNA prøver viser generelt sammenlignbare resultater med det utføres ved hjelp av total RNA ^{fire, fem.} Videre har genekspresjonsanalyser bruker atom RNA blitt brukt til å studere genuttrykk i flere organismer inkludert C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, og mennesker ^{4, 5 2, 3.}

En rekke angrepsmåter har nylig blitt beskrevet for isolering av spesifikke populasjoner av merkede kjerner fra Drosophila vev som er egnet genekspresjonsanalyse og / eller kromatin immunoutfelling for. Batchen isolering av vev-spesifikk kromatin for immunoutfelling (bits-chip)-metoden benytter FACS for å isolere faste kjerner på grunnlag av celletype spesifikk ekspresjon av atom lokalisert GFP ^2. Denne tilnærmingen har vært successfully brukt for å analysere fordelingen av histon modifikasjoner og transkripsjonsfaktorer ved hjelp av kromatin immunoutfelling av isolerte kjerner fra mesoderm of Drosophila embryo ^2. Imidlertid kan FACS-baserte metoder være mindre egnet til å isolere merkede kjerner som utgjør bare en liten andel av en blandet befolkning på grunn av økt sorterings tiden som er nødvendig for å oppnå passende tall for nedstrøms-anvendelser. For å overvinne disse begrensninger har flere grupper benyttet affinitets-baserte isolasjonsteknikker for å rense kjerner som er merket med en spesifikk epitop i et bestemt celletype. Isoleringen av atomkjerner merket i spesifikke celletyper (INTACT)-metoden som er utviklet for bruk i Arabidopsis thaliana ^{6, 7} har nylig blitt tilpasset for bruk i Drosophila ^8.. I denne metode blir et atom konvolutt fusjonsprotein som et substrat for in vivo biotinylering er coexpressed med Escherichia coli biotin ligase Bira i bestemte celletyper. Biotin-merkede kjerner kan deretter renses fra blandede populasjoner ved hjelp av streptavidin-baserte affinitet isolasjon. Ved hjelp av denne metode, ble det atomkjerner med hell merket og isolert fra mesoderm of Drosophila embryo i hvilken en kjernefysisk konvolutt fusjonsprotein som ble uttrykt under kontroll av en mesoderm-spesifikk forsterknings ^8.. Forfatterne har også generert atom konvolutt fusjonsproteiner som kan uttrykkes i en hvilken som helst celletype under kontroll av Gal4 regulatorisk sekvens, UAS ^9.. Denne tilnærmingen er i stand til raskt å isolere undergrupper av merket kjerner fra blandede bestander, men krever tre separate transgene konstruksjoner og kan derfor være uegnet for spesielle genetiske programmer. Nylig har en tilnærming blitt beskrevet som SUN (S ad1 og FN-C-84) domene inneholder proteiner som lokalisere til den indre membran av kjernefysiske konvolutten ble merket medfluorescerende proteiner og uttrykkes under kontroll av Gal4/UAS systemet ^10. Nuclei ble isolert i nærvær av ikke-ionisk tensid for å fjerne den ytre membran av atom konvolutten, og affinitets-renset ved anvendelse av magnetiske kuler koblet til anti-GFP antistoffer. Denne tilnærmingen ble brukt til å isolere små populasjoner av merket kjerner fra spesifikke nevronale undergrupper innenfor den voksne hjernen av Drosophila ^10.

Her er en protokoll for isolering av merkede kjerner fra en blandet populasjon av celler fra Drosophila larve vev er beskrevet. Denne metoden ble utviklet uavhengig av hverandre, men er lik den metode som er beskrevet av Henry et al. ^10. Først ble kjerner som er merket med et fluorescent merke som er uttrykt i spesielle celletyper i Drosophila melanogaster for å lette den etterfølgende isolering av merkede kjerner fra blandede populasjoner ved hjelp av en affinitets-baserte metode. Slik merker kjerner,den KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domenet ble benyttet. Den KASH domenet er en transmembrane domene som lokaliserer til den ytre membran av kjernefysiske konvolutten, blant annet gjennom samhandling med søn domene inneholder proteiner innenfor oppklaring rundt kjernen plass ^11. Den C-terminale domene KASH av proteiner slik som Drosophila MSP-300 og Klarsicht forankrer disse proteinene i den ytre kjernemembranen, mens de N-terminale domener samhandle med cytoskjelett proteiner som aktin eller mikrotubuli i cytoplasma ^12-14. Konstrukter ble samlet hvori KASH domenet til Drosophila MSP-300 ble fusjonert til C-terminalen av EGFP, under kontroll av Gal4 regulatorisk sekvens, UAS i pUAST-attB vektor ^{15, 16.} Bruke phiC31 stedsspesifikke integrasjon, ble transgene fluer generert der UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgenet ble satt inn i attP2 loci på kromosom3L ^17. Den UAS-EGFP :: MSP-300 ^KASH fluer kan krysses med fluer som uttrykker Gal4 driver i en bestemt celletype, noe som resulterer i målrettet ekspresjon av EGFP på den ytre kjernemembranen i celletype av interesse. Merkede kjerner kan deretter bli renset fra blandede cellepopulasjoner ved å bruke antistoffer mot GFP koplet til magnetiske kuler. I denne fremgangsmåten, er bruken av ikke-ionisk tensid er ikke nødvendig fordi EGFP-koden er lokalisert til den cytoplasmatiske side av den ytre kjernemembranen, og er derfor tilgjengelig for antistoffer.

Den protokoll som er beskrevet nedenfor, kan brukes til å isolere / berike EGFP-merkede kjerner fra spesifikke celletyper i Drosophila larve vev, for å kvantifisere renhet og utbytte av isolerte kjerner, og for å trekke ut kjerne RNA egnet for kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT genekspresjonsanalyser-PCR). Isoleringen og affinitets-rensing av kjerner (unntatt tissue disseksjon) kan utføres i mindre enn én time. Resultatene er presentert som viser at glial kjerner kan med hell isolert fra larveoptiske lobe og øye imaginal plate, og som brukes for etterfølgende genekspresjon analyse. Det er forventet at denne tilnærmingen er nyttig for isolering / anrikning av merkede kjerner fra embryoniske-og larve vev hvori målcellene utgjør mindre enn 5% av den totale populasjonen. Alle Drosophila aksjer og plasmider som genereres i denne studien er tilgjengelige fra forfatterne på forespørsel.

Protocol

En. Generasjon og karakterisering av EGFP :: KASH Drosophila Cross Gal4 driver flyr til UAS-EGFP :: Msp-300 KASH flyr. Alternativt kan rekombinante fluer som bærer både Gal4 driver og UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgenet bli generert ved hjelp av standard genetiske teknikker. Denne andre fremgangsmåten er fordelaktig hvis et stort antall avkom er nødvendig. Karakter uttrykk for EGFP :: KASH markør ved hjelp av standard mikroskopi …

Representative Results

Repo-Gal4 driver (Bloomington lager nummer 7415) er spesielt uttrykt i gliacellene i Drosophila nervesystemet på flere stadier av utviklingen 18. Fluer ble generert som stabilt uttrykke UAS-EGFP :: Msp-300 KASH under kontroll av repo-Gal4 driveren ved hjelp av standard genetiske teknikker. Å karakterisere uttrykket mønster av EGFP :: KASH transgenet i disse fluene, ble mønsteret av GFP uttrykk i dissekert optisk lapp og øyet imaginal plate fra tredje stadium…

Discussion

Denne protokollen kan brukes til å isolere eller svært berike spesielt merket kjerner fra blandede cellepopulasjoner i Drosophila embryonale eller larve vev. Ved hjelp av denne protokollen, kan atomkjerner isoleres fra dissekert vev i ca 1 time. Den renhet og utbytte av de isolerte kjerner må være eksperimentelt bestemt for hver celletype. Det kan være vanskelig å kvantifisere bead bundne kjerner ved etterisoleringstrinn av protokollen ved bruk av et hemocytometer på grunn av vulstene som er tilstede i p…

Materials

Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9 well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L