이종 발현 및 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 조정기 (CFTR)의 정제는 중요한 과제이며, 낭성 섬유증을위한 약물 요법의 개발에 제한 요소. 이 프로토콜은 구조와 기능 연구에 적합 CFTR의 밀리그램 수량의 분리를위한 두 가지 방법을 설명합니다.
낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)의 결함 단백질 낭성 섬유증 (CF), 현재 시대의 <사십년에 환자의 평균 수명을 제한하는 상 염색체 열성 질환의 원인이됩니다. CFTR의 활성을 복원하는 새로운 약물 분자의 개발은 CF 치료에 중요한 목표이고, 기능적으로 활성 CFTR의 격리는 이러한 목표를 달성하는 방향 유용한 공정이다.
우리는 진핵 이종 발현 시스템, S.에서 CFTR의 정화하는 두 가지 방법을 설명 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 원핵 생물 시스템과 마찬가지로, S. cerevisiae의 급속 저비용으로 실험실에서 성장 될 수 있고, 또한 트래픽 및 posttranslationally 대형 막 단백질을 수정할 수있다. 가용화 및 정제를위한 세제의 선택은 임의의 세포막 단백질의 정제에 중요한 단계이다. 여러 세제에 CFTR의 용해도에 대한 검사를하는 데, 우리는 두 개의 공동 선택한최종 CFTR 준비가 이후에 계획된 실험에 맞게 할 수 있도록 정화에 사용하기 위해 세제를 ntrasting.
이 방법에서는, 우리는 도데 실-β-D-말토에서 CFTR의 정화 (DDM)과의 비교를 제공하는 1-테트라 데카 노일-SN-글리세로 -3 – 포스 포 – (1,1 – 라 세미 글리세롤) (LPG-14). 이 방법으로 DDM 정제 단백질 기능 분석에 ATPase의 활동을 보여줍니다. LPG-14에서 정제 된 단백질은 순도 및 수율은, 번역 후 변형을 연구하기 위해 이용 될 수있는 도시하고, 그러한 소각 X-선 산란 및 전자 현미경과 같은 구조의 방법에 사용될 수있다. 그러나 그것은 상당히 낮은 ATPase의 활동을 표시합니다.
낭포 성 섬유증 (CF)은 2,500 명당 약 1의 부각과 함께 유럽과 북미에서 가장 흔한 유전 질환이다. CF가 발생할 때 낭포 성 섬유증 막 관통 전도 레귤레이터 (CFTR) 상피 세포 하나의 원형질막에 그 기능의 단백질 유실 돌연변이. 이 결함의 가장 심각한 결과는 연령 2,3 <사십년에 환자의 수명을 단축 돌이킬 수없는 폐 손상입니다.
CFTR은 이온 채널 1,4되기 위해 진화하고있다 ATP 결합 카세트 (ABC) 트랜스입니다. 세포의 세포막에있는 그것 상당히 변경 기능에도 불구하고, 그것은 여전히 다른 ABC 수송차와 상당한 서열 상 동성을 보유한다. 흥미롭게도, CFTR (즉, 규제 지역과 N-및 C-말단)의 전문적인 부분은 다른 후생 동물 ABC 트랜스 포터와 유의 한 서열의 유사성을 공유하지, 따라서 일까지로 아무런 단서가 없다CFTR에서 이러한 시퀀스의 전자 기원. 그 기본 구조에 기초하여, CFTR은 ABC 트랜스 포터 가족의 C-가족으로 분류하지만,이 하위 제품군에 잔류 기능 연계에 대한 강력한 증거가되지 않습니다. 다른 보고서가 감소 된 글루타티온 오히려 보여주는 것보다, CFTR ATPase의 활성을 억제 수 있다는 것을 제안하지만, 다른 C-가족 8,9의 역할과 일치 할, CFTR 5-7 글루타티온 수송 활동의 몇몇보고가 있었다 ABC 트랜스 포터 10의 특성을 기판에 의한 자극. 이온 전도도의 측정은 단일 CFTR 분자의 채널 활동이 하나를 공부하고 CFTR 채널 특성은 시간의 함수, 온도, ATP 농도, 막 전위 및 인산화 상태뿐만 아니라 같이 모니터링 된 허용하기에 충분히 민감 작은 분자 억제제, 강화제, 그리고 수정의 호스트의 존재. 이들연구는 또한 ABC 트랜스 포터가 작동하는 방법에 대한 우리의 지식에 크게 추가했습니다. 그럼에도 불구하고, 상당한 양 및 그 이후의 정화 CFTR의 표현은 특히 도전과 성공은 몇 실험실 10-13로 제한 한 것으로 입증되었습니다.
보다 효과적인 약물을 개발하기위한 필요성이 가압되어, 아직이 프로세스는 작은 분자를 스크리닝 정제 CFTR의 부족에 의해 방해되었다. CFTR 발현과 정제 문제를 해결하는 것은 CF의 기본 결함을 수정하기위한 높은 처리량 약물 검사를 활성화 것 또한 합리적 약물 설계를 알려주는 고해상도 구조 연구를위한 길을 열 것입니다. 또한, 이러한 기능적 올리고머 상태와 단백질, 상호 작용하는 단백질과 ATPase의 활동도 상대적으로 기본적인 생화학 적 특성이 제대로 특징으로 남아있다. 우리는 이전에 GFP – 그의 – 태그 쥐 CFTR의 대규모 발현을위한 프로토콜을보고있다S.에 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (14)는 이제 더 CFTR의 정화를위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 예를 들어 닭 CFTR의 정화를위한 다섯 CFTR의 orthologues,와 현재의 데이터를 정화하기 위해 이러한 방법을 사용했습니다. 가용화 및 정제를위한 세제의 선택은 임의의 세포막 단백질의 정제에 중요한 단계이다. 여러 세제에 CFTR의 용해도에 대한 검사를하는 데, 우리는 정화에 사용하기위한 두 가지 대조적 인 세제를 선택했습니다. 도데 실-β-D-말토 (DDM)을 광범위하게 막 단백질 15-21 모두 구조 및 기능 연구에 사용 된 비이 온성 세제입니다. 온성 세제 일-테트라 데카 노일-SN-글리세로 -3 – 포스 포 – (1'-RAC-글리세롤) (LPG-14), CFTR의 가용화에 매우 효율적이며, 이전에 기능적 막 단백질 (10)의 정제에 사용되고 S.에서 CFTR의 정화를 포함하여 22, 23, 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (24). </ P>
우리는 이전 뮤린 CFTR (14)의 과잉 발현을위한 방법을 설명 하였다. 해당 프로토콜의 출판 이후, 우리는 동일한 시스템을 사용하여 CFTR의 여러 가지 orthologs을 표현하고 정제했다. DDM 정화 다른 orthologs에서 더 많은 변화 (데이터가 표시되지 않음)을 보여 주었다 동안 테스트 한 모든 orthologs 지금까지, LPG 세제에서 잘 정제. 이러한 유연성은 효모 접근의 힘을 예시한다 : 그것은 특정 목적의 하나를 선택하기 위해 상대적으로 많은 구조 인텔리 스크린 할 수있다.
1 M의 NaCl 전에 청소기 미크로 준비 DDM 결과와 가용화 및 이후 단계에서 오염 물질을 감소하기 위해 포함 된 버퍼와 효모의 소포체를 세척. 최종 CFTR 샘플 미크로 세척없이> 90 % 순수로이 단계는 LPG 프로토콜에 필요하지 않습니다. 또한, DDM에있는 정화는 가용화를위한 버퍼에 몇 가지 변화가 필요합니다차 정화, 여분의 글리세롤과 소금, 즉 추가. 함께, 이러한 추가는 상당히 열에 DDM – 용해 단백질의 결합을 증가 시켰습니다.
DDM 정화 방법은 개선을 위해, 특히 질량 분석에 의해 판단, 40 kDa의 주요 오염 물질의 제거, 니켈 수지 고유의 선호도가 나타납니다 효모 리보솜 소단위 L3에 의한 범위를 가지고 있습니다. 이 L3 단백질에서 명백한 polyHis 서열은 없지만, 리보솜에 결합 할 때의 3 차원 구조의 검사 (PDB = 1FFK)이 절첩 L3 소단위는 잠재적 polyHis 클러스터 있음을 보여준다. 이 밴드는 LPG-정제 된 물질에 덜 문제가되는 가혹한 LPG 세제에 기인 할 수있다.
DDM의 정화가 LPG에 비해 나쁜 것으로 보인다 있지만, 이러한 DDM 같은 온화한 세제 구조와 기능 분석에 더 잘 호환 될 수 있으며, 이미 여러 X-선 crystall에 사용되었습니다막 단백질 15-21의 ographic 연구. 또한, 우리의 결과는 LPG의 사용은 DDM의 정화에 CFTR 상대적으로 ATPase의 기능의 손실로 연결 것으로 나타났다. 따라서 우리는 번역 후 변형의 특성과 같은 응용 프로그램의 예를 들어, 또는 항체의 생성에, LPG 기반의 프로토콜이 선택 될 것, 순도가 매우 중요합니다 CFTR의 생성에 LPG 기반의 정화 프로토콜을 추천 할 것입니다 . 단백질의 활동을 완전히 네이티브 상태가 필수적인 응용 프로그램에서 다른 한편으로, 우리는 더 나은 옵션으로 DDM 기반 프로토콜을 제안한다.
결론적으로,이 프로토콜은 양쪽이 온성 세제 LPG-14 또는 비 이온 세제 DDM에서 CFTR의 분리를위한 재생 가능한 방법을 설명합니다. 따라서 그 이전에 10-13을보고 한 것보다 CFTR에 대한 정화 조건의 큰 범위를 나타냅니다. 부가 밀리그램의 정제 CFTR의 수량이 될 수 있습니다이러한 20 L 발효조 등 6 L 저속 원심 분리기 회 전자로 고용량 전지 수확 시스템으로 높은 볼륨 효모의 성장 시스템과 결합 할 때이 절차를 사용하여 얻을. 얻어진 CFTR은 다양한 생화학 및 생물 물리학 적 분석에서 단백질을 쉽게 모니터링 할 수있는 분해 가능한 GFP 태그가 있습니다.
이 원고 (닭 CFTR 함유 플라스미드 또는 냉동 효모 세포)에 설명 된 시약은 낭포 성 섬유증 재단 (USA)를 통해 얻을 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 그 CFTR 3D 구조의 컨소시엄을 통해 미국 낭포 성 섬유증 재단 (CFF)에 의해 투자되었다. TR은 영국 BBSRC 학생이기 의해 UK CF 신뢰 재학 및 NC에 의해 투자되었다. 우리는 그들의 도움과 조언 및 코돈 최적화 된 닭 CFTR 순서 및 정화 태그의 디자인에 대한 CFF CFTR 3 차원 구조 컨소시엄에서 우리의 동료를 인정합니다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |