Summary
Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.
Abstract
Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) kusurlar protein kistik fibrozis (CF), şu anda yaş <40 yıl hastalarının ortalama yaşam beklentisi sınırlar otozomal resesif hastalığa neden. CFTR aktivitesini geri yeni ilaç moleküllerinin geliştirilmesi tedavi CF önemli bir hedeftir, ve işlevsel aktif CFTR izolasyon bu hedefe ulaşmada yararlı bir adımdır.
Bir ökariyotik heterolog ifade sisteminde, S'den CFTR saflaştırılması için iki yöntem tarif cerevisiae. Prokaryotik sistemleri gibi, G. cerevisiae hızla düşük maliyetle laboratuvarda yetiştirilen olabilir, ama aynı zamanda trafik ve posttranslationally büyük membran proteinleri değiştirebilirsiniz. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır sonra, iki eş seçtikNihai CFTR preparat, daha sonra planlanan deneyler için uygun hale getirilmesine olanak saflaştırılmasında kullanılmak için deterjanlar ntrasting.
Bu yöntemde, biz dodesil-β-D-maltoside CFTR saflaştırma (DDM) ve karşılaştırma sağlamak 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) (LPG-14). Bu yöntem ile DDM saflaştınlabilir Protein fonksiyonel deneylerde ATPaz aktivitesi gösterir. LPG-14 arıtılmış, Protein verim ve yüksek saflıkta, post-translasyonel modifikasyonlar incelemek için kullanılabilir gösterir ve bu, küçük açı X-ışını dağılımı ve elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemleri için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha düşük ATPaz aktivitesi gösterir.
Introduction
Kistik fibrozis (CF) 2,500 canlı doğumda yaklaşık 1 insidansı ile Avrupa ve Kuzey Amerika'da en sık görülen genetik bir hastalıktır. CF oluştuğunda, kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü (CFTR) epitel hücrelerinin 1 plazma membranında işlevi protein kaybı nedeni mutasyonlar. Bu kusurun en ciddi sonucudur yaşı 2,3 <40 yıl hastalarının ömrü kısaltır dönüşümsüz akciğer hasarı vardır.
CFTR bir iyon kanal 1,4 haline dönüşmüştür bir ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcı olduğunu. Hücrelerin plazma membranında onun oldukça değişmiş fonksiyonu olmasına rağmen, yine de, diğer ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği korur. İlgi çekici, CFTR (yani düzenleyici bölge ve N-ve C-termini) 'nin özel bir parça, diğer metazoan ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği paylaşan, dolayısıyla inci hiçbir ipucu vardırCFTR bu dizilerin e kökeni. Birincil yapısının temelinde, CFTR ABC transportör ailesinin bir C-aile üyesi olarak sınıflandırılır, ancak bu alt-aile için artık fonksiyonel bir bağlantı için güçlü bir kanıt yoktur. Diğer raporlar azalmış glutatyon ziyade gösteren daha, CFTR ATPaz aktivitesini inhibe olabileceğini düşündürmektedir rağmen, diğer C-aile üyelerinin 8,9 rolleri ile tutarlı olurdu, CFTR 5-7 için glutatyon taşımacılık faaliyetlerinin bazı raporlar olmuştur ABC nakliyecilere 10 karakterize tabaka kaynaklı uyarım. Iyon iletkenliği ölçümü bir CFTR moleküllerin kanal aktivitesi 1 incelenecek kanal özellikleri ve CFTR zamanın bir fonksiyonu, sıcaklık, ATP konsantrasyonu, membran potansiyeli ve fosforilasyon durumu yanı sıra olarak takip edilmiştir izin vermek için yeterince hassastır , küçük molekül inhibitörleri, kuvvetlendirici ve modifiye bir ana varlığı. Bunlarçalışmalar da ABC taşıyıcıları nasıl işlediğini bizim bilgilerimize önemli ekledik. Bununla birlikte, önemli miktarda ve daha sonra saflaştırma CFTR ekspresyonu özellikle zor ve başarı birkaç 10-13 laboratuarlar ile sınırlı olmuştur olduğu kanıtlanmıştır.
Daha etkili ilaçların geliştirilmesi için ihtiyaç presleme, henüz bu işlem küçük moleküllerin taranması için arıtılmış, CFTR eksikliği tarafından engellenmiştir. CFTR ifade ve arıtma sorununun çözülmesi CF birincil kusur düzeltme amaçlı yüksek verimli ilaç tarama sağlayacak ve aynı zamanda rasyonel ilaç tasarımı konusunda yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar için bir yol açacaktır. Ayrıca, bu tür fonksiyonel oligomerik durum olarak protein, etkileşen protein ve ATPaz aktivitesi bile nispeten temel biyokimyasal özellikleri zayıf bir şekilde karakterize kalır. Daha önce GFP-ve His-etiketli murin CFTR büyük ölçekli ifadesi için bir protokol bildirmiştirS. cerevisiae 14 ve şimdi daha CFTR saflaştırılması için protokolleri açıklanmıştır. Biz örnek olarak tavuk CFTR saflaştırılması için beş CFTR orthologues ve mevcut veri arındırmak için bu yöntemleri kullandık. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır, biz saflaştırılmasında kullanılmak için iki zıt deterjanlar seçtik. Dodesil-β-D-maltozit (DDM) yaygın zar proteinlerinin 15-21 hem yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir iyonik olmayan deterjandır. Iyonik deterjan 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) (LPG-14), CFTR çözünme son derece etkili olduğunu ve daha önce fonksiyonel membran proteinlerinin 10'un saflaştırılması kullanılmıştır S arasından CFTR saflaştırılması dahil olmak üzere, 22,23, cerevisiae 24. </ P>
Protocol
Tamponlar 1. Hazırlanması
- Proteaz inhibitörünün 100x stok yapmak için (PI) bir kokteyl 96 mg AEBSF, 3.5 mg kimostatin, 10 mg E64, 16.5 mg löpeptin, 16.5 mg Pepstatin 348 mg PMSF, ve 20 ml DMSO içinde 4 mg bestatin çözülür. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza olun Benzamidin bir 100X stok yapmak için, 720, 20 ml ultra saf su içinde mg (GKD 2 O) ve -20 ° C'de 1 ml'lik alikolar içinde çözülür mağaza Bu miktar, bir saflaştırma için yeterlidir. Tüm tampon olarak, PI ve benzamidin stokları 1:100 dilüsyonda kullanılmıştır.
- 'MPIB' (0.3 M Tris, pH 8, 0.3 M sukroz, 2 mM DTT) ve "CFTR 'hazırlayın (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 mM DTT) 4 ° C'ye tamponlar ve soğuk . Kullanmadan önce, proteaz inhibitörü kokteyli 1:100 ekleyin ve mPIB hacmine göre 1:100 benzamidin (örneğin, 350 ml mPIB bir toplam hacim içinde 3.5 ml PI ve 3.5 ml benzamidin kullanın) hücre pelletini için kullanılır.
- S hazırlayınolubilization tamponlar. Lizo-fosfatidil gliserol-14 (LPG) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri (PI) ve% 4 (a / h) LPG) ve dodesil maltozit (DDM) solübilizasyon tampon maddesi (50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, proteaz inhibitörleri,% 4 (a / h) DDM). Bu kabarcıklar oluşturur gibi tampon, deterjan dağılmasına yardımcı olmak, ancak karışımın vorteks önlemek için bir sonikatör banyosuna (35 B, 40 kHz) içerisinde soniklendi edilebilir. Kullanımdan önce 4 ° C'ye soğutun.
- LPG saflaştırılması için CFTR saflaştırma tampon, 50 mM Tris,% 10 (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) LPG-14 ve proteaz inhibitörleri olduğunu. Bu tampon 350 ml ve aynı tamponu artı 1 M imidazol, 150 ml hazırlayın. 8 Her iki tampon pH ayarlayın.
- DDM saflaştırma için tampon, 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM oluşur. Bu tampon 350 ml, ve aynı tampon 150 ml ve 1 M imidazo hazırlanmasıle. 8 Her iki tampon pH ayarlayın.
- LPG ihtiva eden jel nüfuz kromatografisi (GPC) tamponu sağlamak için, 50 mM Tris pH 8, 10% (v / v) gliserol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT,% 0.05 (ağ / hac) LPG-14 hazırlar. DDM kullanılarak GPC 50 mM Tris pH 8, 20% (v / v) gliserol, 1 M NaCl, 1 mM DTT,% 0.1 (ağ / hac) DDM bir tamponu hazırlamak için. GPC kolonu üzerinde kullanılan bütün tampon ve GKD 2 O, süzüldü (0.2 mikron filtre) ve kullanılmadan önce gazı alınmış olmalıdır.
- SDS-PAGE örnek tamponu (çalışma konsantrasyonunun 2): 50 mM Tris-HCl pH 7.6,% 5 (v / v) gliserol, 5 mM EDTA,% 0.02 (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi. -20 ° C'de 700 ul alikotları ve mağaza olun Kullanımdan önce,% 20 200 ul (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ve taze 0.5 M DTT, 100 ul ilave edin. Jeli üzerinde yüklemeden önce, oda sıcaklığında numune ile en az 10 dakika boyunca inkübe edin. Isı etmeyin; Bu GFP denatüre ve CFTR araya neden olabilir.
- Sulandırılacak lipid stok yapmak için E: bir 4:1 (ağ / ağ) karışımı çözülür coli lipidler bird kloroform ve metanol içinde kolesterol (2:1 v / v) ve bir lipid film oluşturmak için 2 saat boyunca N2 gazı altında cam bir şişede kuru. Ml 40 mg / bir lipid konsantrasyonu (no NaCI) ile GPC tamponu ilave edin ve çözeltiyi netleştirmek için tekrar vorteks ve sonikasyon (35 B, 40 kHz) kullanın.
- ATPaz testi için, GKD 2 O 1 M DMSO, NaSCN 1 mM'ye SCH28080 eritilmesi ile ve 100,% 2.5 mM (v / v) etanol ile oligomycin ATPase inhibitörlerinin 100x stokları hazırlamak. -20 ° C 'de parçalar halinde saklayın 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NH4CI, 5 mM MgSO 4 ile% 0.02 (ağırlık / hacim) NaN3 ile ATPase tamponu 100 ml olun. Bu, oda sıcaklığında depolanır ve çeşitli deneyleri için de kullanılabilir. Kullanımı ve buz üzerinde tutmak için hemen önce, 5 mM ATP stok hazırlayın. (NB kullanımlar Na 2 ATP deneyinde fosfattan fazla arka plan sinyalini önlemek için). SDS durdurma çözeltisi (% 12 (ağ / hac) SDS içinde GKD 2 O) hazırlayın.
- Chifflet tespiti için w (A (% 3 tampon hazırlamak/ V) askorbat,% 0.5 (ağ / h) amonyum molibdat, 0.5 M HCI) kullanımdan hemen önce ve tampon B'ye (% 2 (w / v) sodyum sitrat,% 2 (w / v) sodyum meta-arsenit,% 2 (v / v) asetik asit).
Mantar mikrozomları 2. Izolasyonu
- O'Ryan ve diğerleri de tarif edildiği gibi ifade eden tavuk CFTR S. cerevisiae büyütülür. (2012) 14. En fazla 6 ay boyunca -80 ° C 'de iki kısım halinde, bir 20 L fermantasyon malzemeyi saklayın.
- Hızlı bir şekilde hücre, bir kısım buzunu ve hücre gramı başına 3 ml soğuk mPIB içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- 425-600 um çapında cam boncuklar kullanılarak, bir bilyalı değirmen içinde hücreleri bozabilir. 1 dakikalık dinlenme periyotları ile ayrılan hücre bozulması beş 1 dk dönemleri kullanın. (Dinlenme süreleri hücreler kesintileri sırasında ısıtılan emin olmak için gereklidir.)
- Bilyalı değirmen alınan hücre lisatı bir 1 ml numunesinin santrifüjle hücre parçalanmasından sonra izlenmesi. Bir tezgah üstü centr Santrifüj (12.000 xg, 4 ° C, 5 dakika)ifuge. Bir küvet içinde mPIB ile 1:50 seyreltin ve süpernatant A 380 ölçer. A 380> 0.1, ya da birkaç tekrarlanan boncuk yenerek döngüleri rağmen artan durduysa, aşağıdaki adıma geçin. Eğer değilse, 2,3-2,4 tekrarlayın.
- Toplam hücre lizatı (12,000 x santrifüj g, 4 ° C, 20 dak.) Süpernatantı saklayın. (Kırılmamış hücreler ve mitokondri içeren) pelet atın, ama hücre kırılma verimliliği konusunda herhangi bir şüphe (bkz 2.4) varsa, o zaman da pelet korumak.
- Önceki basamakta (200,000 xg, 4 ° C, 1.5 saat) süpernatant santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve CFTR tamponu peletlendi mikrozomal zarları tekrar süspansiyon. Mikrozomlar DDM kullanarak arıtma için tasarlanmıştır, 1 M NaCI ile tampon CFTR tamamlar.
- 100,000 x (yeniden süspansiyon haline getirilmiş membran fraksiyonunun tekrar santrifüj g, 4 ° C, 1 saat) ve süpernatant atın.
- Pelet haline mikrozomlarında süspanseCFTR tamponu minimum hacmi (nihai hacim 5-15 mi, total mikrozomal protein 70-200 mg). A Bradford tahlili mikrozomal proteinlerinin 25 toplam konsantrasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak membran floresans emisyon spektrumu ölçülmelidir (uyarım = 485 nm, emisyon = 500-600 nm) ve ayrı bir GFP floresan tepe (512 nm 'de maksimum) sahip olmalıdır. CFTR özel GFP floresan koşullar altında taranan bir SDS-PAGE jel üzerinde (Şekil 1) üzerine tespit edilebilir.
- Flaş dondurularak sıvı azot içine daldırma ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve mikrozomları -80 ° C'de saklayın, ya da 3 Adım devam edin.
Mikrozomların 3. Çözündürülmesi
- Dondurulmuş, hemen 10 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu içinde kullanılmadan önce mikrozomları defrost
- Membran çözünmesi için, bir nihai deterjan konsantrasyonu vermek üzere, ilgili solübilizasyon tampon maddesi (Aşama 1.3) eşit hacmi ile mikrozomları seyreltik% 2 (a / h) ve bir mikrozomal protein konsantrasyonu 5 mg / ml. Çalkalama ile 4 ° C'de (tüp döndürücü) 1 saat boyunca bu karışımın inkübe edin. Analizi için 200 ul saklayın.
- Karışım (100,000 xg, 4 ° C, 45 dakika) santrifüje. Çözündürülmüş zar proteinleri içeren süpernatantı, 0.45 um'lik bir şırınga filtresinden geçirin ve buz üzerinde saklayın. (Aşama 2.8 'de olduğu gibi) süpernatanın flöresan ölçülür.
- % 1 çözünmeyen fraksiyonu, çözünebilir fraksiyon eşit bir hacme kadar (ağ / hac) SDS çözeltisi yeniden süspanse edin. Bu fraksiyonun bir kısmı olarak floresan ölçülür ve SDS-PAGE analizi için 50 ul bir kısım korur.
CFTR 4. Nikel afinite saflaştırma
- Seri bağlantı, iki 5 ml nikel sefaroz sütunlar. Daha sonra 1 M imidazol içeren, (1,4-1,5 Aşama) çözündürme tamponu 2 CV ile sütun yıkama, GKD 2 O 2 CV ardından (v / v) etanol, 2 kolon hacmi (CV) ile% 20 yıkayın. Solubilizat 2 CV ile tekrarlayıniyon imidazol eksik tampon.
- Çözelti halindeki materyale (Basamak 2.8) ile 5 mM arasında nihai bir konsantrasyona kadar imidazol ilave edin ve otomatik bir sıvı kromatografi cihazı kullanılarak elle kolona veya bir örnek döngüye malzemeyi yüklemek.
- 0.5 ml / dk 'lık bir akış hızında kolona çözündürülmüş malzeme yük, ve bağlanmamış malzemenin bertaraf edilmesi için aynı akış hızında imidazol-eksik tamponu 2 CV ile yıkayın. 50 ml Falcon tüpleri içinde fraksiyonlar toplayın.
- İlk yıkama için, 1 ml / dk 'lık bir akış oranında, 40 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın.
- İkinci yıkama, 100 mM imidazol ile arıtma tamponunun 3 CV kullanın. 2 ml fraksiyonlar toplayın.
- 400 mM imidazol ile arıtma tampon 3 CV ile HisTrap kolondan Elute CFTR. 2 ml fraksiyonlar toplayın.
- Yıkanmış fraksiyonlar (2.8 Aşama) içinde floresan izleyin.
- SDS-PAGE analizi için pik fraksiyonların alikotları saklayın. Flaş dondurma kalan zirve fraction örnekler ve mağaza -80 ° C 'de, ya da bir sonraki saflaştırma aşaması için devam edin.
CFTR 5. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) saflaştırılması
- 1.2 CV GPC tamponu ile ve ardından 1.2 CV GKD 2 O sütunu (Superpose 6 10/300 GL) dengelenmesi.
- Aşama 5.1 sırasında, 4 ° C 'de, bir santrifüj 100,000 bir MWCO filtre kullanılarak, en yüksek GFP floresan olan Ni-afinite ile saflaştırılmış fraksiyonları konsantre DDM içinde temizleme, bu önemli bir örnek kaybına neden olacak şekilde 0.3 mg / ml protein, protein konsantrasyonu Yukarıdaki örnekte konsantre kaçının. 100,000 x de konsantratör ve santrifüjden bakiyenin kaldırma büyük parçacıklar pelet 4 ° C'de 30 dakika boyunca g.
- Kolon üzerine enjekte edilir ve bu örnek 1,2 CV GPC tamponu izokratik gradyanı ile elüte. 0.5 ml fraksiyonları toplayın.
- CFTR ihtiva eden kesirler belirlemek için bölüm 2.8 olarak GFP floresan ölçün. Küçük bir hacim korumak (örneğin </ Em> SDS-PAGE ile analiz için her biri 50 ul).
- -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza fraksiyonlar Freeze
CFTR 6. Sulandırma
- Lipid-to-protein oranı 100:1 (a / a) de saflaştırılmış CFTR için lipitleri (Basamak 1.8) ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Benzer şekilde GPC tamponu aynı hacmi ile saflaştırılmış protein ile ikame, bir lipid tek kontrolünü ayarlayın.
- Hidrofobik yüzerme boncuklar kullanılarak protein / yağ karışımından deterjan çıkarın. 5 CV GKD 2 O, 5 CV% 70 (v / v) etanol, 5 CV GKD 2 O ve deterjan eksik 5 CV GPC tamponu içinde adsorbent boncuk yıkayın. Saflaştırılmış proteinin ml başına yıkandı emen tanelerin 200 mg eklenir ve yavaşça çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ince uçlu bir pipet kullanarak yeni bir tüp içine emen boncuklardan yeniden oluşturma örnek toplamak.
ATPaz aktivitesi 7. Ölçümü
- CFT oranını belirlemek96 oyuklu bir plaka biçiminde bir tadil edilmiş Chifflet 26,27 tahlili kullanılarak R-özgü ATPaz aktivitesi. Sodyum fosfat stok çözeltisi ile (0.65 mM) standartları olarak 50 ul nihai hacim içinde 0-20 nmol fosfat hazırlar. Fosfat stok seyreltilmesi CFTR tampon ve tampon ATPaz bir 1:1 karışımı kullanın.
- 10 dakika boyunca buz üzerinde 1:100 (v / v) ATPase inhibitörleri (Basamak 1.9) ile yeniden CFTR ve boş hem de lipozomlar inkübe edin. Yeniden CFTR en az 5 ug kullanın.
- 2 mM'lik nihai konsantrasyona ATP (Basamak 1.9) ilave edilir ve 1 saat boyunca 25 ° C'de inkübe edin. (Standartlar dahil olmak üzere) her bir (ağırlık / hacim) SDS (1.9 Aşama)% 10, 40 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Tampon A içinde 100 ul (1,10 Aşama) ve 10 dakika boyunca inkübe edilir. Her bir oyuğa 100 ul tampon B (1.10) ilave edin ve 96 oyuklu bir plaka uyumlu bir UV / Vis spektrofotometresinde 800 nm'lik bir dalgaboyunda absorbans ölçümü.
- Kullanarak serbest fosfat miktarında içine 800 nm'de absorbans dönüştürmefosfat standartları. Arka plan sinyalinin (lipozom sadece kuyu) çıkarıldıktan sonra, ATP hidroliz hızını hesaplar.
- Non-yeniden CFTR için plan okumaları için CFTR tampon kullanarak aynı protokolü izleyin.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen protokol ham mikrozomal hücre kopması ve hazırlık (Şekil 1) CFTR hemen hemen tamamen geri kazanımı ile CFTR bakımından zenginleştirilmiş mikrozomlarının izole etmek için etkili bir araçtır. Diğer hücre kopması yöntemler de etkili bir şekilde kullanılabilir. Biz eşit verimlilik ile bir Fransız basınç hücresi ve diğer high-pressure/cavitation cihazlar (aynı zamanda bir yakut hedefe karşı etkileyen ile birlikte) kullanmıştır. Kolaylık ve ekipman düşük başlangıç maliyeti, biz boncuk dayak yöntemini iyi bulmak.
CFTR çözündürülmesi ve saflaştırılması için LPG kullanılarak>% 90 saflık ile (Şekil 2), 80 ug protein / L kültür vermiştir. Yüksek verim nedeniyle LPG (Şekil 2b, kuşak 2 ve 4 ile karşılaştırınız) ile CFTR etkili çözündürülmesi amaçlanmıştır. Buna ek olarak, etkili ve kolona sıkı bağlanma minimal bağlanmamış fraksiyon CFTR kaybı ve yıkama fraksiyonları CFTR yokluğunda (Şekil 2, bölmeler 3, 5 sonuçlandı ve6). Elüt edilen protein, Coomassie-lekelenmiş SDS-PAGE jelleri tarafından tahmin edilir ve CFTR ve kirletici bantların densitometrisi kullanılarak,>% 90 bir saflığa sahip olmuştur. Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC), düşük molekül ağırlıklı kirletici maddeler LPG ile saflaştırılmış CFTR (Şekil 4, alt panel) ayrıldı.
DDM kullanarak CFTR arıtma için protokol, yaklaşık% 60 ve yaklaşık 50 ug / L verimle (Şekil 3) saflık verir. Yaklaşık 10 ml (Şekil 4) en elüsyon GPC olumsuz lekeli fraksiyonlarının elektron mikroskopisi (EM) DDM-arıtıldı CFTR 20-30 nm çaplı agrega hem de 10 nm çapında (veriler gösterilmemiştir) daha küçük parçacıklar içerdiğini göstermiştir. Bu küçük agregalar tersine çevrilerek EM-tespit birikimlerin çıkması için başarısız ilişkilendirmek ve bir 1 MDa kesme filtresi ile ultrafiltrasyon ayırmak için mümkündür. LPG ile saflaştırılmış malzeme dolayısıyla boyanmamış fraksiyonların Krio-EM ile incelenmiştir, bir parıltı deşarjı kılavuza adsorbe değildi. Bu gösterdinispeten küçük, çok homojen bir partikül popülasyonu (6-8 nm çap, veriler gösterilmemiştir).
Son olarak, saflaştırılmış proteinlerin ATPaz aktivitesi (Şekil 5) ölçülmüştür. ABC protein ailesinin bir üyesi olarak, CFTR ATP bağlanması ve / veya hidrolize edebilen iki nükleotid-bağlayıcı etki (NBDs) sahiptir. Veriler, saflaştırılmış protein, LPG-çözündürülmüş halde ATP hidrolize etmek mümkün değildi ve DDM mevcudiyetinde (Şekil 5, dolgusuz bar) zayıf ATPase aktivitesi göstermiştir göstermektedir. Lipidler ve deterjan kaldırma ilave edildikten sonra ATPaz aktivitesi DDM (13 nmol ATP / dakika / mg protein) saflaştınlabilir edilmiş numuneler için 4 kat daha yüksekti. Lipidler ve LPG kullanılarak izole edilmiştir CFTR LPG için benzer şekilde geri aktivitesi çıkarılması, ancak ek DDM-saflaştırılmış ve yeniden malzemeden daha düşük bir oranda bir son (1.5 nmol ATP / dakika / mg protein).
Şekil 1. Hücre lizatı tavuk CFTR (CL) izlenmesi düzeyi, yüzer (S) ve mikrozom izolasyon ve yıkama için kullanılan çeşitli santrifüj adımları sırasında peletleri (P). SDS-PAGE jelleri, GFP-jel floresan kullanılarak görselleştirilmiştir tag. 14,000 xg hücre kopması ve santrifüjlemeden sonra süpernatan (bozunma ürünleri de dahil olmak üzere) hemen hemen tüm CFTR içerir. Tüm tam uzunluklu CFTR yüzer bazı parçalarını bırakarak 200,000 xg sediment ultrasantrifugasyon. Tuz-yıkanmış mikrozomlar pelet bazı ilave parçalarının kaldırılması ile neredeyse tüm CFTR 100.000 xg'de Ultrasantrifügasyon.
Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile LPG tavuk CFTR Şekil 2.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi (üst panel) ve GFP etiketi (alt panel) flüoresanla tespiti ile takip edilen SDS-PAGE ile analiz edildi. Tracks: (1) Mikrozomlar. (2) LPG-çözünür mikrozomlar. (3) bağlı olmayan bir malzeme. (4) Çözünmeyen materyal. (5) ve (6) 40 ve 100 mM imidazol yıkama. (7) malzeme 400 mM imidazol ile elüt edilmiştir.
Hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi ile DDM tavuk CFTR Şekil 3.. Saflaştırılması. Fraksiyonlar Coomassie lekelemesi ile SDS-PAGE ile analiz edildi. Sol taraftaki panel elüsyondan önce kesirler gösterir. Birkaç ardışık yıkama fraksiyonlar CFTR ile sağ panelinde gösterilirok ile endikedir. Daha sonra parçacıklar ribozomal protein L3 olarak kütle spektrometresi ile tespit edilmiş olan bir 40 kDa kirletici içinde zenginleştirilmiştir.
Jel geçirim kromatografisiyle tavuk CFTR Şekil 4,. Saflaştırma Ni afiniteli kromatografi ile saflaştırılmıştır. CFTR konsantre edildi ve bir GPC sütununa uygulanmıştır. CFTR (üst panel) için bir elusyon profili LPG-14 (katı hat) ya da DDM (kesik çizgi) üst üste ihtiva eden tampon içinde saflandırıldı. SDS-PAGE (alt panel) CFTR 8 ve 11 ml arasında elüt olduğunu ortaya koydu.
Şekil 5. ATPaz faaliyeteDDM veya LPG saflaştınlabilir y arıtıldı tavuk CFTR fraksiyonların. Protein F-, P-ve V tipi ATPaz (dolgusuz bar herhangi bir arka plan ATPaz aktivitesini ortadan kaldırmak için ATPase inhibitörleri kokteylinin mevcudiyetinde bir tadil edilmiş 26 Chifflet tahlili kullanılarak tahlil edilmiştir .) ATP hidrolizinin oranı, aynı zamanda deterjan ilave kaldırma ve lipid (dolu çubuklar) sonra ölçülmüştür. Arsa ortalama ve standart sapma gösterir (n = 3). Ortalama varlığı ve lipidin yokluğunda ATPase aktivitesi için değerleri ve DDM ve LPG olarak aktivitesi arasındaki fark arasındaki farklar p <0.05 için önemlidir.
Discussion
Daha önce sıçangil CFTR 14'ün aşırı ifadesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yayınlanmasından bu yana, aynı sistemi kullanarak CFTR birkaç farklı ortologlarını ifade ve saflaştırılmış var. DDM arıtma farklı ortologlar karşısında daha fazla varyasyon (veriler gösterilmemiştir) gösterdi iken, test edilen tüm ortologlar kadar, LPG deterjan iyi arıtılmış. Bu esneklik, maya yaklaşımın gücünü gösterir: belirli bir amaç için bir seçmek için göreli bir hızla çok yapıları taranması mümkündür.
1 M NaCl önce temiz bir mikrozom preparatında DDM sonuçlar, çözünürleştirme ve daha sonraki aşamada kirletici azaltır ihtiva eden tampon ile maya mikrozomları yıkama. Nihai CFTR örnek mikrozom yıkaması olmaksızın>% 90 saf olduğu için bu adım, LPG protokolünde gereksizdir. Ayrıca, DDM saflaştırma çözündürme a için tamponlar için çeşitli değişiklikler gerektirirnd saflaştırılması, gliserol ve ilave tuzu yani eklenmesi. Hep birlikte, bu ilave önemli kolona DDM-çözündürülmüş proteinin bağlanma artmıştır.
DDM saflaştırma metodolojisi iyileştirilmesi için, özellikle de kütle spektrometresi ile karar, bir 40 kDa ana kirleticinin kaldırılması, nikel reçinesi için doğal bir afiniteye sahip görünen maya ribozomal alt birimine L3, kaynaklanmaktadır bir kapsama sahiptir. Orada L3 protein içinde belirgin bir polyHis sekansıdır, ancak ribozom bağlandığmda da 3 boyutlu yapısının incelenmesi (PDB = 1FFK) katlanmış alt birim L3 potansiyel polyHis küme sahip olduğunu göstermektedir. Bu bant LPG-saflaştırılmış malzeme daha az sorunlu olduğu sert LPG deterjan nedeniyle olabilir.
DDM yılında arıtma LPG daha fakir gibi görünüyor olsa da, bu tür DDM gibi hafif deterjanlar fonksiyonel ve yapısal analizler ile daha uyumlu olabilir ve zaten birkaç X-ışını crystall kullanılmıştırMembran proteinlerinin 15-21 arasında ographic çalışmaları. Ayrıca, sonuçlar LPG kullanımı DDM in saflaştırmaya CFTR nispetle ATPase fonksiyon kaybına yol açtığını göstermiştir. Bu nedenle bu tür post-translasyonel modifikasyonlar karakterizasyonunda gibi uygulamalarda örneğin, ya da antikorların üretilmesine de, LPG tabanlı bir protokol seçilecektir, saflık önemlidir CFTR üretilmesi için LPG-bazlı saflaştırma protokolü tavsiye . Proteinin aktivitesi, ve tam olarak yerel durum gerekli olduğu uygulamalarda Öte yandan, daha iyi bir seçenek olarak DDM tabanlı bir protokol önerecek olacaktır.
Sonuç olarak, bu protokol zitteriyonik deterjan LPG-14 ya da non-iyonik deterjan DDM CFTR izolasyonu için tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Gibi daha önce 10-13 bildirilmiştir daha CFTR için arıtma koşullarının daha geniş bir yelpazede gösterir. Ilave miligram arıtılmış CFTR miktarları olabilirBöyle bir 20 L'lik fermente edici ve bir 6 L düşük hızlı santrifüj rotoru olarak yüksek kapasiteli bir hücre toplama sistemi olarak, bir yüksek hacimli maya büyüme sistemi ile bir araya getirildiğinde, bu prosedürler kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen CFTR çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel tahlillerinde protein kolayca izlenmesini sağlayan bir bölünebilir GFP etiketi vardır.
Bu makalede (tavuk CFTR ihtiva eden plasmid veya dondurulmuş maya hücreleri) de tarif edilen reaktif Kistik Fibroz Vakfı (USA) ile elde edilebilir.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ne de bu işe ilişkin diğer çelişkili çıkarları var.
Acknowledgments
Bu çalışma onun KFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu aracılığıyla ABD Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) tarafından finanse edildi. TR İngiltere'de BBSRC öğrencilikle tarafından İngiltere CF Güven öğrencilik ve NC tarafından finanse edildi. Biz onların yardım ve tavsiye için ve kodon-optimize edilmiş tavuk KFTR dizisi ve arıtma etiketleri tasarımı için CFF CFTR 3D yapısı konsorsiyum meslektaşlarımızı kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| 100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 | |
| 2 ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 | |
| 50 ml sterile Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| Gel imaging system | BioRad | 170-808 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| E. coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Fisher | 65017 | |
| HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 | |
| Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| SCH28080 | Sigma-Aldrich | S4443 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 | |
| Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 | |
| Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 | |
| Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 | |
| Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |
References
- Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel. Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).
- Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003. EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).
- O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D.
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245, 1059-1065 (1989).
- Kariya, C., et al. A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).
- Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung. Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).
- Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates. Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).
- Cole, S. P., et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line. Science. 258, 1650-1654 (1992).
- Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters. Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).
- Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).
- Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).
- O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. , (2012).
- Oldham, M. L., Chen, J. Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).
- Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter. Science. 315, 373-377 (2007).
- Dawson, R. J. P., Locher, K. P. Structure of a bacterial multidrug ABC transporter. Nature. 443, 180-185 (2006).
- Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter. Science. 321, 246-250 (2008).
- Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).
- Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation. Science. 321, 250-253 (2008).
- Aller, S. G., et al. Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding. Science. 323, 1718-1722 (2009).
- Koehler, J., et al. Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids. Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).
- Tian, C., et al. Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome. Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases. Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).
- Rothnie, A., et al. The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence. Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).
