Гетерологичная экспрессия и очистка муковисцидозный трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) значительные проблемы и ограничивающие факторы в развитии лекарственной терапии для муковисцидоза. Этот протокол описывает два способа выделения миллиграмм количества CFTR, пригодных для функциональных и структурных исследований.
Дефекты в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) белок вызывает кистозный фиброз (CF), аутосомно-рецессивные заболевания, что в настоящее время ограничивает среднюю продолжительность жизни больных до <40 лет. Разработка новых лекарственных молекул восстановить активность CFTR является важной целью в CF лечения, а также изоляция функционально активной CFTR является полезным шагом на пути к достижению этой цели.
Опишем два способа очистки CFTR от эукариотической гетерологического системы экспрессии, S. CEREVISIAE. Как прокариотических системах, С. CEREVISIAE можно быстро растет в лаборатории при низких затратах, но может также трафик и посттрансляционно изменить большие мембранные белки. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали двух соntrasting моющие средства для использования в очистке, которые позволяют заключительная подготовка CFTR, чтобы быть адаптированы к впоследствии запланированных экспериментов.
В этом методе, мы предлагаем сравнение очистки CFTR в додецил-β-D-мальтозид (DDM) и 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (LPG-14). Белок очищали в DDM этим методом показывает АТФазы в функциональных анализах. Белок очищают LPG-14 показывает высокую чистоту и выход, может быть использован для изучения посттрансляционных модификаций, и может быть использован для структурных методов, таких как малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Однако он отображает значительно ниже АТФазы.
Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным генетическим заболеванием, в Европе и Северной Америке с частотой около 1 в 2500 живорожденных. CF происходит, когда мутации в муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) привести к потере белка своей функции на плазматической мембране эпителиальных клеток 1. Наиболее серьезным последствием этого дефекта является необратимое повреждение легких, что сокращает продолжительность жизни больных до <40 лет 2,3.
CFTR является АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортер, что превратилась ионный канал 1,4. Несмотря на довольно измененной функции в плазматической мембране клеток, он все еще сохраняет значительную гомологию последовательностей с другими транспортеров АВС. Интересно, что специализированные части CFTR (т.е. его регуляторной области и его N-и С-концы) не поделиться значительного сходства последовательности с другой многоклеточных ABC транспортеров, следовательно, нет никаких улик, как в гое истоки этих последовательностей в CFTR. На основе его первичной структуры, CFTR классифицируется в качестве члена C-семьи транспортера семьи ABC, но нет никаких убедительных доказательств для остаточной функциональной привязки к этой суб-семьи. Там было несколько сообщений о глутатион транспортной деятельности для CFTR 5-7, который будет соответствовать роли других членов С-семейных 8,9, хотя другие источники предполагают, что восстановленный глутатион может ингибировать активность CFTR АТФазную, а не показывая субстрат-индуцированного стимуляции, которые характеризуют перевозчиков ABC 10. Измерение ионной проводимости является достаточно чувствительным, чтобы позволить канал активность одиночных молекул CFTR быть изучены 1 и свойства канала CFTR были регистрируют как функцию времени, температуры, концентрации АТФ, мембранного потенциала и состояния фосфорилирования, а также в Наличие множества низкомолекулярные ингибиторы, усилителей и модификаторами. Этиисследования также добавил значительно к нашему знанию о том, как функционируют ABC транспортеры. Тем не менее, выражение CFTR в значительных количествах и его последующей очистки оказалась особенно сложной и успех был ограничен несколькими лабораториями 10-13.
Необходимость разработки более эффективных препаратов давит, но этот процесс был сдерживается отсутствием очищенного CFTR для скрининга малых молекул. Решение проблемы экспрессии CFTR и очистки позволит высокопроизводительного скрининга наркотиков, направленных на исправление основной дефект в CF, а также будет открыть маршрут для структурных исследований с высоким разрешением, чтобы сообщить рациональную конструкцию наркотиков. Более того, даже относительно основные биохимические характеристики белка, например, его функциональной олигомерного состояния, взаимодействующих белков и АТФазы остаются плохо охарактеризованы. Ранее мы уже сообщали протокол для крупномасштабной экспрессии GFP и его-меченых мышиных CFTRв S. CEREVISIAE 14 и теперь дополнительно описывают протоколы для очистки CFTR. Мы использовали эти методы, чтобы очистить пять ортологи CFTR и представления данных для очистки куриного CFTR в качестве примера. Выбор моющих средств для растворения и очистки является важным шагом в очистке любого мембранного белка. После скринингу на растворимости CFTR в нескольких моющих средств, мы выбрали два противоположных моющие средства для использования в очистке. Додецил-β-D-мальтозид (DDM) представляет собой неионный детергент, который широко используется как для структурных и функциональных исследований мембранных белков 15-21. Ионный детергент 1-тетрадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рац-глицерин) (LPG-14) является высокоэффективным в солюбилизации CFTR и ранее был использован в очищении функциональных мембранных белков 10, 22,23, в том числе очистки CFTR от S. CEREVISIAE 24. </ Р>
Ранее мы описали метод сверхэкспрессией мышиного CFTR 14. С момента публикации этого протокола, мы выразили и очищенный несколько различных Ортологи CFTR используя ту же систему. Все испытанные ортологи так далеко очищают хорошо в LPG моющего средства, в то время как очистка DDM показали больший разброс между различными ортологи (данные не показаны). Эта гибкость иллюстрирует прочность подход дрожжей: можно экранировать много конструкций с относительной скоростью, чтобы выбрать один для определенной цели.
Стиральная дрожжевых микросом с буфером, содержащим 1 М NaCl до солюбилизации с результатами DDM в более чистой подготовки микросомной и снижает загрязняющих веществ на более поздних стадиях. Этот шаг не является необходимым в протоколе СНГ как окончательная проба CFTR является> 90% чистоты без микросомной стирки. Кроме того, очистка в DDM требует нескольких изменений в буферов для солюбилизации аочистка й, а именно добавление дополнительной глицерин и соли. Вместе эти добавки значительно увеличилось связывание DDM-солюбилизированного белка в колонку.
Методика очистки DDM имеет возможности для совершенствования, в частности удаление 40 кДа основной примеси, которые, если судить по масс-спектрометрии, связано с дрожжи рибосомной субъединицы L3, который появляется иметь характеристическую сродство к смоле никеля. Там нет очевидного polyHis последовательность в белке L3, но экспертиза его 3D структуры при связывании с рибосомой (PDB = 1FFK) показывает, что сложил L3 субъединицы имеет потенциальную polyHis кластер. То, что это группа менее проблематично в СНГ очищенный материал может быть связано с более жесткой СНГ моющего средства.
Хотя очистка в DDM-видимому, беднее, чем в СНГ, более мягкие детергенты, такие как DDM может быть более совместимым с функциональной и структурной анализов и уже используется в нескольких рентгеновских Кристаллographic исследования мембранных белков 15-21. Кроме того, наши результаты показывают, что использование сжиженного газа приводит к потере функции АТФазы в CFTR относительно очистки в DDM. Поэтому мы рекомендуем протокол очистки LPG основе для генерации CFTR, где чистота имеет решающее значение, например, в таких приложениях, как характеристике пост-трансляционных модификаций, или в генерации антител, протокол СНГ на основе будет выбран . С другой стороны в случаях, когда деятельность и полностью родное государство белка имеет важное значение, мы бы предложить протокол DDM основе в качестве лучшего варианта.
В заключение, этот протокол описывает воспроизводимый метод для изоляции CFTR в цвиттерионного моющего средства LPG-14 или неионные моющего DDM. Как таковой, он указывает на более широкий спектр очистных условий для CFTR чем уже сообщалось ранее 10-13. В дополнение миллиграмм количеств очищенного CFTR может бытьполученные с использованием этих процедур в сочетании с высокой объемной системы рост дрожжей, таких как 20-литровом ферментере и системой сбора клеток с высокой пропускной способностью, такой как 6 л низкой скорости ротора центрифуги с. CFTR получены имеет отщепляемую GFP тег, который позволяет легко контролировать белка в различных биохимических и биофизических анализов.
Реагента, описанного в этой рукописи (CFTR курица, содержащие плазмиды или замороженные дрожжевые клетки) могут быть получены путем кистозного фиброза Foundation (США).
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась американским Муковисцидоз Фонда (CFF) через свою CFTR 3D Consortium структуры. TR финансировалось за счет Великобритании CF Целевой студенчества и NC на студенчества Великобритании BBSRC. Мы признаем, наших коллег в структуре консорциума CFF CFTR 3D для их помощью и советом, и для конструкции курица последовательности CFTR и очистки тегов кодон-оптимизированный.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |