Heterologous अभिव्यक्ति और सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) की शुद्धि महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं और सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए दवा के उपचारों के विकास में सीमित कारकों. इस प्रोटोकॉल कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त CFTR की मिलीग्राम मात्रा के अलगाव के लिए दो विधियों का वर्णन.
सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) में दोष प्रोटीन सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), वर्तमान में उम्र के <40 वर्षों से ग्रस्त मरीजों की औसत जीवन प्रत्याशा है कि सीमा एक autosomal पीछे हटने का रोग का कारण. CFTR की गतिविधि को बहाल करने के लिए उपन्यास दवा अणुओं का विकास उपचार CF में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है, और कार्यात्मक सक्रिय CFTR के अलगाव के इस लक्ष्य को प्राप्त करने की दिशा में एक उपयोगी कदम है.
हम एक यूकेरियोटिक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली, एस से CFTR की शुद्धि के लिए दो विधियों का वर्णन cerevisiae. प्रोकार्योटिक सिस्टम की तरह, एस cerevisiae तेजी से कम कीमत पर प्रयोगशाला में विकसित किया जा सकता है, लेकिन यह भी यातायात और posttranslationally बड़ी झिल्ली प्रोटीन संशोधित कर सकते हैं. solubilization और शोधन के लिए डिटर्जेंट का चयन किसी भी झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि में एक महत्वपूर्ण कदम है. कई डिटर्जेंट में CFTR की घुलनशीलता के लिए जांच करने के बाद, हम दो सह चुना हैअंतिम CFTR तैयारी बाद में योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर किया जा करने की अनुमति है कि शुद्धि के लिए उपयोग में डिटर्जेंट ntrasting.
इस विधि में, हम dodecyl-β-D-maltoside में CFTR की शुद्धि (DDM) और की तुलना प्रदान 1-tetradecanoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phospho-(1'-आरएसी-ग्लिसरॉल) (एलपीजी-14). इस विधि द्वारा DDM में शुद्ध प्रोटीन कार्यात्मक assays में ATPase गतिविधि को दर्शाता है. रसोई गैस के 14 में शुद्ध प्रोटीन उच्च शुद्धता और उपज, बाद translational संशोधनों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है पता चलता है, और इस तरह के छोटे कोण एक्स – रे बिखरने और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में संरचनात्मक तरीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि यह काफी कम ATPase गतिविधि प्रदर्शित करता है.
सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) 2500 जीवित जन्मों में लगभग 1 की एक घटना के साथ यूरोप और उत्तरी अमेरिका में सबसे आम आनुवंशिक विकार है. सीएफ तब होता है जब सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR) उपकला कोशिकाओं 1 के प्लाज्मा झिल्ली में अपने कार्य के प्रोटीन कारण नुकसान में उत्परिवर्तन. इस दोष के सबसे गंभीर परिणाम उम्र 2,3 की <40 वर्षों से ग्रस्त मरीजों की जीवन प्रत्याशा shortens जो अपरिवर्तनीय फेफड़ों को नुकसान होता है.
CFTR एक आयन चैनल 1,4 बनने के लिए विकसित किया गया है कि एक एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर है. कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में इसकी काफी बदल समारोह के बावजूद, यह अभी भी अन्य एबीसी ट्रांसपोर्टरों के साथ महत्वपूर्ण अनुक्रम अनुरूपता बरकरार रखती है. दिलचस्प, CFTR (यानी इसकी नियामक क्षेत्र और उसके एन और सी टर्मिनी) की विशेष भागों अन्य metazoan एबीसी ट्रांसपोर्टरों के साथ कोई महत्वपूर्ण अनुक्रम समानता, इसलिए वें के रूप में कोई सुराग हैंCFTR में इन दृश्यों की ई मूल. इसका प्राथमिक संरचना के आधार पर, CFTR एबीसी ट्रांसपोर्टर परिवार की एक सी परिवार के सदस्य के रूप में वर्गीकृत है, लेकिन इस उप परिवार के लिए एक अवशिष्ट कार्यात्मक संबंध के लिए कोई पुख्ता सबूत नहीं है. अन्य रिपोर्टों कम glutathione बल्कि दिखाने से, CFTR ATPase गतिविधि को बाधित कर सकता है, हालांकि, अन्य सी परिवार के सदस्यों 8,9 की भूमिकाओं के अनुरूप होगा, जो CFTR 5-7 के लिए glutathione परिवहन गतिविधि के कुछ रिपोर्टों गया है एबीसी ट्रांसपोर्टरों 10 विशेषताएँ कि सब्सट्रेट प्रेरित उत्तेजना. आयन प्रवाहकत्त्व के मापन एकल CFTR अणुओं का चैनल गतिविधि 1 अध्ययन किया जाना और CFTR चैनल गुण एक समय के समारोह, तापमान, एटीपी एकाग्रता, झिल्ली क्षमता, और phosphorylation राज्य है, साथ ही में निगरानी के रूप में किया गया है की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है छोटे अणु inhibitors, potentiators, और संशोधक के एक मेजबान की उपस्थिति. इनअध्ययनों से यह भी एबीसी ट्रांसपोर्टरों समारोह का हमारे ज्ञान करने के लिए काफी जोड़ लिया है. फिर भी, काफी मात्रा में और इसके बाद के शोधन में CFTR की अभिव्यक्ति विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण और सफलता कुछ प्रयोगशालाओं 10-13 तक सीमित कर दिया गया है साबित हो गया है.
अधिक प्रभावी दवाओं को विकसित करने की आवश्यकता पर दबाव डाल रहा है, अभी तक यह प्रक्रिया छोटे अणुओं स्क्रीनिंग के लिए शुद्ध CFTR की कमी से बाधा कर दिया गया है. CFTR अभिव्यक्ति और शुद्धि समस्या को सुलझाने CF में प्राथमिक दोष को सही करने के उद्देश्य से उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए सक्षम होगा और भी तर्कसंगत दवा डिजाइन को सूचित करने के लिए उच्च संकल्प संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक मार्ग खुलेंगे. इसके अलावा, इस तरह अपने कार्य oligomeric राज्य के रूप में प्रोटीन, बातचीत प्रोटीन और ATPase गतिविधि की भी अपेक्षाकृत बुनियादी जैव रासायनिक गुणों खराब होती रहते हैं. हम पहले से GFP और उनकी टैग murine CFTR की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल को सूचित किया हैएस में cerevisiae 14 और अब आगे CFTR की शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. हम एक उदाहरण के रूप में चिकन CFTR की शुद्धि के लिए पांच CFTR की orthologues, और वर्तमान डेटा को शुद्ध करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया है. solubilization और शोधन के लिए डिटर्जेंट का चयन किसी भी झिल्ली प्रोटीन की शुद्धि में एक महत्वपूर्ण कदम है. कई डिटर्जेंट में CFTR की घुलनशीलता के लिए जांच करने के बाद, हम शोधन में इस्तेमाल के लिए दो परस्पर विरोधी डिटर्जेंट चुना है. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) बड़े पैमाने पर झिल्ली प्रोटीन 15-21 के दोनों संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक nonionic डिटर्जेंट है. ईओण डिटर्जेंट 1-tetradecanoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phospho-(1'-आरएसी-ग्लिसरॉल) (एलपीजी-14), CFTR की solubilization में अत्यधिक कुशल है और पहले से कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन 10 की शुद्धि में इस्तेमाल किया गया है एस से CFTR की शुद्धि सहित 22,23, cerevisiae 24. </ P>
हम पहले से murine CFTR 14 की overexpression के लिए एक विधि का वर्णन किया है. कि प्रोटोकॉल के प्रकाशन के बाद से, हम एक ही प्रणाली का उपयोग CFTR के कई अलग orthologs व्यक्त किया है और शुद्ध है. DDM शुद्धि अलग orthologs भर में अधिक भिन्नता (नहीं दिखाया डेटा) से पता चला है whilst के सभी परीक्षण orthologs अब तक, रसोई गैस डिटर्जेंट में अच्छी तरह से शुद्ध किया. यह लचीलापन खमीर दृष्टिकोण की ताकत को दिखाता है: यह एक विशेष उद्देश्य के लिए एक का चयन करने के क्रम में रिश्तेदार तेज़ी के साथ कई निर्माणों स्क्रीन करने के लिए संभव है.
1 एम NaCl पिछले एक क्लीनर microsome तैयारी में DDM परिणामों के साथ solubilization और बाद के चरणों में contaminants कम कर देता है के लिए युक्त बफर के साथ खमीर microsomes वॉशिंग. अंतिम CFTR नमूना microsome धोने के बिना> 90% शुद्ध रूप में यह कदम एलपीजी प्रोटोकॉल में अनावश्यक है. इसके अलावा, DDM में शुद्धि solubilization एक के लिए बफ़र्स के लिए कई परिवर्तन की आवश्यकता हैएन डी शुद्धि, अतिरिक्त ग्लिसरॉल और नमक की अर्थात् अलावा. साथ में, इन अतिरिक्त काफी स्तंभ को DDM-solubilized प्रोटीन के बंधन में वृद्धि हुई.
DDM शुद्धि कार्यप्रणाली में सुधार के लिए, विशेष रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा न्याय है कि एक 40 केडीए प्रमुख संदूषक को हटाने, निकल राल के लिए एक अंतर्निहित समानता है प्रकट होता है जो खमीर ribosomal सबयूनिट L3, की वजह से है गुंजाइश है. वहाँ L3 प्रोटीन में कोई स्पष्ट polyHis अनुक्रम है, लेकिन राइबोसोम के लिए बाध्य जब अपने 3 डी संरचना की परीक्षा (पीडीबी = 1FFK) मुड़ा L3 सबयूनिट एक संभावित polyHis क्लस्टर है कि दिखाता है. इस बैंड एलपीजी शुद्ध सामग्री में कम समस्याग्रस्त है कि कठोर एलपीजी डिटर्जेंट के कारण हो सकता है.
DDM में शुद्धि रसोई गैस में है कि अधिक से अधिक गरीब हो गया लगता है हालांकि, इस तरह के DDM के रूप में मामूली डिटर्जेंट कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण के साथ संगत हो सकता है और पहले से ही कई एक्स – रे crystall में इस्तेमाल किया गया हैझिल्ली प्रोटीन 15-21 की ographic पढ़ाई. इसके अलावा, हमारे परिणाम रसोई गैस का उपयोग DDM में शुद्धि के लिए CFTR सापेक्ष में ATPase समारोह के नुकसान की ओर जाता है कि संकेत दिया. इसलिए हम इस तरह के बाद translational संशोधनों के लक्षण वर्णन के रूप में आवेदन में उदाहरण के लिए, या एंटीबॉडी की पीढ़ी में, रसोई गैस आधारित प्रोटोकॉल चुना जाएगा, पवित्रता महत्वपूर्ण है जहां CFTR की पीढ़ी के लिए रसोई गैस आधारित शुद्धि प्रोटोकॉल की सिफारिश करेंगे . प्रोटीन की गतिविधि और पूरी तरह से देशी राज्य आवश्यक है अनुप्रयोगों में जहां दूसरी ओर, हम एक बेहतर विकल्प के रूप में DDM आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव होगा.
समाप्त करने के लिए, इस प्रोटोकॉल zwitterionic डिटर्जेंट एलपीजी-14 या गैर ईओण डिटर्जेंट DDM में CFTR के अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है. ऐसे में यह पहले से 10-13 सूचित किया गया है से CFTR के लिए शोधन की स्थिति की एक बड़ी रेंज इंगित करता है. इसके अलावा मिलीग्राम में शुद्ध CFTR की मात्रा हो सकती हैइस तरह के एक 20 एल किण्वक और इस तरह एक 6 एल कम गति अपकेंद्रित्र रोटर के रूप में एक उच्च क्षमता सेल संचयन प्रणाली के रूप में एक उच्च मात्रा खमीर विकास प्रणाली के साथ संयुक्त जब इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त की. प्राप्त CFTR विभिन्न जैव रासायनिक और biophysical assays में प्रोटीन का आसान निगरानी की अनुमति देता है जो एक cleavable GFP टैग है.
इस पांडुलिपि (चिकन CFTR युक्त प्लाज्मिड या फ्रोजन खमीर कोशिकाओं) में वर्णित अभिकर्मक सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (यूएसए) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम अपने CFTR 3 डी संरचना कंसोर्टियम के माध्यम से अमेरिका सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF) द्वारा वित्त पोषित किया गया. टी.आर. ब्रिटेन के एक बीबीएसआरसी छात्रावस्था द्वारा ब्रिटेन के एक सीएफ ट्रस्ट छात्रवृत्ति, और नेकां द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम उनकी मदद और सलाह के लिए और कोडोन अनुकूलित चिकन CFTR अनुक्रम और शुद्धि टैग की डिजाइन के लिए CFF CFTR 3 डी संरचना संघ में हमारे सहयोगियों को स्वीकार करते हैं.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |