A expressão heteróloga e purificação da fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) são desafios significativos e fatores limitantes para o desenvolvimento de drogas terapêuticas para a fibrose cística. Este protocolo descreve dois métodos para o isolamento de quantidades de miligrama de CFTR adequados para estudos funcionais e estruturais.
Defeitos no regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR) proteína causar fibrose cística (FC), uma doença autossômica recessiva que limita actualmente a esperança média de vida de quem sofre a <40 anos de idade. O desenvolvimento de novas moléculas da droga para restaurar a atividade da CFTR é uma meta importante no tratamento CF, eo isolamento de CFTR funcional ativa é um passo importante para atingir este objectivo.
Descrevem-se dois métodos para a purificação de CFTR a partir de um sistema de expressão heterólogo eucariótica, S. cerevisiae. Como os sistemas procariotas, S. cerevisiae pode ser crescido rapidamente no laboratório a um custo baixo, mas também de tráfego e posttranslationally possível modificar as proteínas da membrana de grandes dimensões. A selecção de detergentes para a solubilização e purificação é um passo crítico na purificação de qualquer proteína de membrana. Tendo examinado para a solubilidade do CFTR em vários detergentes, escolhemos dois contrasting detergentes para utilização na purificação que permitem a preparação de CFTR final a ser adaptado para as experiências posteriormente planeadas.
Neste método, nós fornecemos comparação da purificação de CFTR em dodecil-β-D-maltósido (DDM) e de 1-Tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (GLP-14). A proteína purificada no DDM por este método mostra a actividade de ATPase em ensaios funcionais. A proteína purificada de GLP-14 apresenta elevada pureza e rendimento, podem ser empregues para estudar as modificações pós-traducionais, e pode ser usado para os métodos estruturais, tais como pequeno ângulo de dispersão de raios X e por microscopia de electrões. No entanto, apresenta atividade ATPase significativamente menor.
A fibrose cística (FC) é a doença genética mais comum na Europa e América do Norte, com uma incidência de cerca de 1 em 2.500 nascidos vivos. CF ocorre quando as mutações no regulador de condutância transmembranar da fibrose cística (CFTR) proteínas provocam perda da sua função na membrana plasmática das células epiteliais 1. A conseqüência mais grave deste defeito é a lesão pulmonar irreversível, o que reduz a expectativa de vida dos portadores de a <40 anos de idade 2,3.
CFTR é uma cassete (ABC) transportador ATP-binding que evoluiu para se tornar um canal iônico 1,4. Apesar da sua função de muito alterada na membrana plasmática das células, que ainda retém uma homologia de sequência significativa com outros transportadores ABC. Curiosamente, as partes especializadas da CFTR (ou seja, sua região reguladora e sua N-e C-terminais) compartilham nenhuma semelhança seqüência significativa com outros metazoários transportadores ABC, daí não há pistas sobre o the origens destas seqüências em CFTR. Com base na sua estrutura primária, CFTR é classificado como um membro do C-família da família de transportadores ABC, mas não existe qualquer evidência forte para uma ligação funcional residual para esta sub-família. Houve alguns relatos de atividade de transporte de glutationa para CFTR 5-7, o que seria consistente com os papéis de outros membros da família C-8,9, embora outros relatos sugerem que a glutationa reduzida pode inibir a atividade CFTR ATPase, em vez de mostrar o estimulação induzida por substrato, que caracterizam os transportadores ABC 10. Medição da condutância de iões é suficientemente sensível para permitir que a actividade do canal de moléculas individuais de CFTR a ser estudado 1 e propriedades do canal CFTR foram monitorizadas em função do tempo, temperatura, concentração de ATP, potencial de membrana, e estado de fosforilação, bem como na presença de uma série de pequenas moléculas inibidoras, potenciadores, e modificadores. Estesestudos também têm contribuído significativamente para o nosso conhecimento de como transportadores ABC funcionar. No entanto, a expressão do gene CFTR em quantidades significativas, e sua purificação subsequente provou ser particularmente difícil e o sucesso tem sido limitado a alguns laboratórios 10-13.
A necessidade de desenvolver medicamentos mais eficazes está pressionando, mas este processo tem sido dificultada pela falta de CFTR purificado para a triagem de pequenas moléculas. Resolvendo a expressão CFTR e purificação problema permitiria high-throughput screening de drogas destinadas a corrigir o defeito primário na CF e também abrir uma rota para estudos estruturais de alta resolução para informar desenho racional de drogas. Além disso, até mesmo características bioquímicas relativamente básicas da proteína, tal como o seu estado oligomérico funcional, as proteínas que interagem e actividade de ATPase permanecem pouco caracterizados. Em estudo prévio, um protocolo para a expressão em larga escala de GFP-e His-marcado CFTR murinoem S. cerevisiae 14 e agora descrever mais protocolos para a purificação de CFTR. Temos usado esses métodos para purificar cinco ortólogos de CFTR, e dados atuais para a purificação de CFTR frango como exemplo. A selecção de detergentes para a solubilização e purificação é um passo crítico na purificação de qualquer proteína de membrana. Tendo rastreados para a solubilidade de CFTR em vários detergentes, escolhemos dois detergentes de contraste para utilização na purificação. Dodecil-β-D-maltósido (DDM) é um detergente não iónico que tem sido extensivamente utilizado para ambos os estudos estruturais e funcionais de proteínas de membrana 15-21. O detergente iónico 1-tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (GLP-14) é altamente eficaz na solubilização de CFTR e foi previamente utilizado para a purificação de proteínas da membrana funcionais 10, 22,23, incluindo a purificação de CFTR a partir de S. cerevisiae 24. </ P>
Nós já descrito um método para a sobre-expressão de CFTR murino 14. Desde a publicação desse protocolo, temos expressa e purificada vários ortólogos diferentes de CFTR utilizando o mesmo sistema. Todos os ortólogos testadas até agora purificada bem o detergente GPL, enquanto a purificação DDM mostrou mais variações entre diferentes ortólogos (dados não mostrados). Esta flexibilidade ilustra a força da abordagem de levedura: é possível rastrear muitas construções com relativa rapidez, a fim de seleccionar uma para uma finalidade específica.
Lavar os microssomas de levedura com um tampão contendo 1 M de NaCl antes da solubilização com resultados DDM numa preparação de microssoma de pó e reduz os contaminantes em fases posteriores. Este passo não é necessário, no protocolo de GPL como a amostra de CFTR final é> 90% pura sem a lavagem microssoma. Além disso, a purificação em DDM requer várias alterações para os buffers para a solubilização de umnd de purificação, isto é, a adição de glicerol extra e sal. Em conjunto, estas adições aumentou consideravelmente a ligação da proteína de DDM-solubilizado para a coluna.
A metodologia de purificação DDM tem possibilidades de melhoria, em particular, a remoção de um contaminante principal de 40 kDa que, julgado por espectrometria de massa, é devido à subunidade ribossómica levedura L3, que parece ter uma afinidade inerente para a resina de níquel. Não há nenhuma sequência de poliHis óbvio na proteína L3, mas o exame de sua estrutura 3D quando ligado ao ribossoma (APO = 1FFK) mostra que a subunidade L3 dobrado tem um potencial de cluster poliHis. Que esta banda é menos problemática em material purificado por GPL pode ser devido ao detergente GLP mais dura.
Embora a purificação em DDM parece ser mais pobre do que aquela de GLP, detergentes leves, como DDM pode ser mais compatível com as análises funcionais e estruturais e já têm sido utilizados em vários crystall de raios-Xographic estudos de proteínas de membrana 15-21. Além disso, os nossos resultados indicam que o uso do GLP leva à perda de função de ATPase em CFTR em relação à purificação de DDM. Assim, recomendamos o protocolo de purificação com base em GLP para a geração de CFTR quando a pureza é essencial, por exemplo, em aplicações tais como a caracterização de modificações pós-tradução, ou na geração de anticorpos, o protocolo à base de GLP seria escolhido . Por outro lado, em aplicações onde a atividade e estado totalmente nativa da proteína é essencial, sugere-se a protocolo baseado em DDM como uma opção melhor.
Para finalizar, este protocolo descreve um método reprodutível para o isolamento de CFTR no detergente zwitteriónico GLP-14 ou o detergente não iónico DDM. Como tal, ele indica uma maior gama de condições de purificação para CFTR que foram previamente relatados 10-13. Além miligrama quantidades de CFTR pode ser purificadoobtido usando estes procedimentos, quando combinado com um elevado volume do sistema de crescimento de levedura, tais como um fermentador de 20 L e um sistema de colheita de células de elevada capacidade, tal como um 6 L de baixa velocidade de rotor da centrifugadora. O CFTR obtido tem uma marcação GFP clivável que permite a monitorização fácil da proteína em vários ensaios bioquímicos e biofísicos.
O reagente descrito neste manuscrito (galinha contendo CFTR plasmídeo ou as células de levedura congeladas) pode ser obtido através da Cystic Fibrosis Foundation (EUA).
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por os EUA Fundação de Fibrose Cística (CFF), através de seu Consórcio Estrutura CFTR 3D. TR foi financiado por uma bolsa de estudo UK CF Trust, e NC por um studentship Unido BBSRC. Nós reconhecemos os nossos colegas na estrutura consórcio CFF CFTR 3D para a sua ajuda e conselhos e para a concepção da seqüência CFTR frango e purificação marcas otimizado códon.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |