Espressione eterologa e purificazione del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) sono sfide importanti e fattori limitanti per lo sviluppo di terapie farmacologiche per la fibrosi cistica. Questo protocollo descrive due metodi per l'isolamento di quantitativi milligrammo di CFTR adatti per studi funzionali e strutturali.
Difetti nel regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) proteine causano fibrosi cistica (CF), una malattia autosomica recessiva che limita l'aspettativa media di vita dei malati a <40 anni di età. Lo sviluppo di molecole di farmaci innovativi per ripristinare l'attività di CFTR è un obiettivo importante nel CF trattamento, e l'isolamento di CFTR funzionalmente attivo è un utile passo verso il raggiungimento di questo obiettivo.
Descriviamo due metodi per la purificazione di CFTR da un sistema di espressione eterologo eucariotico, S. cerevisiae. Come sistemi procariotici, S. cerevisiae può essere rapidamente coltivata in laboratorio a basso costo, ma può anche traffico e posttranslationally modificare grandi proteine di membrana. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Dopo aver proiettato per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrasting detergenti per uso nella purificazione che permette la preparazione finale CFTR venga adattata agli esperimenti successivamente pianificati.
In questo metodo, forniamo confronto della purificazione di CFTR in dodecil-β-D-maltoside (DDM) e 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (LPG-14). Proteina purificata in DDM con questo metodo mostra ATPasi in saggi funzionali. Proteina purificata in GPL-14 mostra elevata purezza e resa, possono essere utilizzati per studiare le modificazioni post-traduzionali, e può essere utilizzato per i metodi strutturali come piccolo angolo X-ray scattering e microscopia elettronica. Tuttavia visualizza ATPasi notevolmente inferiore.
La fibrosi cistica (FC) è la malattia genetica più diffusa in Europa e Nord America, con un'incidenza di circa 1 su 2.500 nati vivi. CF si verifica quando le mutazioni del regolatore transmembrana della fibrosi cistica conduttanza (CFTR) perdita di proteine causa della sua funzione a livello della membrana plasmatica delle cellule epiteliali 1. La conseguenza più grave di questo difetto è un danno polmonare irreversibile, che riduce l'aspettativa di vita dei malati a <40 anni di 2,3 anni.
CFTR è un ATP-binding cassette (ABC) trasportatore che si è evoluto per diventare un 1,4 canale ionico. Nonostante la sua funzione abbastanza alterato nella membrana plasmatica delle cellule, mantiene ancora una significativa omologia di sequenza con altri trasportatori ABC. Curiosamente, le parti specializzate di CFTR (cioè la sua regione regolatrice e il suo N-e C-terminali) non condividono rilevante somiglianza di sequenza con altri metazoi ABC trasportatori, quindi non ci sono indizi al secoloe le origini di queste sequenze in CFTR. Sulla base della sua struttura primaria, CFTR è classificato come un membro C-famiglia della famiglia trasportatore ABC, ma non vi è una forte evidenza di un legame funzionale residua a questa sottofamiglia. Ci sono state alcune segnalazioni di attività di trasporto glutatione per CFTR 5-7, che sarebbe coerente con i ruoli degli altri membri della famiglia C-8,9, anche se altri rapporti suggeriscono che il glutatione ridotto può inibire l'attività di CFTR ATPasi, piuttosto che mostrare l' substrato indotta da stimoli che caratterizzano i trasportatori ABC 10. Misurazione della conduttanza ionica è sufficientemente sensibile per consentire l'attività del canale di singole molecole CFTR da studiare 1 e proprietà del canale CFTR è stata monitorata in funzione del tempo, temperatura, concentrazione di ATP, potenziale di membrana, e stato di fosforilazione, nonché nella presenza di una miriade di piccoli inibitori della molecola, potenziatori e modificatori. QuesteGli studi hanno anche aggiunto in modo significativo alla nostra conoscenza di come funzionano trasportatori ABC. Tuttavia, l'espressione di CFTR in quantità significativa e la sua successiva purificazione ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo e successo limitato a pochi laboratori 10-13.
La necessità di sviluppare farmaci più efficaci è pressante, ma questo processo è stato ostacolato dalla mancanza di CFTR purificato per lo screening di piccole molecole. Risolvere il problema espressione CFTR e purificazione consentirebbe high-throughput screening di farmaci volti a correggere il difetto primario nella FC e sarebbe anche aprire un percorso per studi strutturali ad alta risoluzione per informare la progettazione razionale di farmaci. Inoltre, anche relativamente caratteristiche biochimiche fondamentali della proteina, come lo stato oligomerico funzionale, proteine interagenti e ATPasi rimangono poco caratterizzati. Abbiamo precedentemente riportato un protocollo per l'espressione su larga scala di GFP-e His-tag CFTR murinoin S. cerevisiae 14 e ora descrivere ulteriormente i protocolli per la purificazione della proteina CFTR. Abbiamo usato questi metodi per purificare cinque ortologhi di CFTR e dati presenti per la purificazione di CFTR pollo come esempio. La selezione di detergenti per solubilizzazione e purificazione è un passaggio fondamentale nella purificazione di qualsiasi proteina di membrana. Avendo a screening per la solubilità di CFTR in diversi detergenti, abbiamo scelto due contrastanti detergenti per uso nella purificazione. Dodecil-β-D-maltoside (DDM) è un detergente non ionico che è stato ampiamente utilizzato per entrambi gli studi strutturali e funzionali delle proteine di membrana 15-21. Il detergente ionico 1-tetradecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (LPG-14) è molto efficace nella solubilizzazione di CFTR ed è stato precedentemente utilizzato nella purificazione di proteine di membrana funzionali 10, 22,23, compreso purificazione della CFTR da S. cerevisiae 24. </ P>
Abbiamo precedentemente descritto un metodo per la sovraespressione di CFTR murino 14. Dopo la pubblicazione di tale protocollo, abbiamo espresso e purificato diversi ortologhi diversi di CFTR utilizzando lo stesso sistema. Tutti gli ortologhi testati finora purificati bene il detersivo GPL, mentre la purificazione DDM mostrato più variazione tra differenti ortologhi (dati non mostrati). Questa flessibilità illustra la forza dell'approccio lievito: è possibile schermare molti costrutti con relativa rapidità al fine di selezionare uno per uno scopo particolare.
Lavare i microsomi lievito con tampone contenente 1 M NaCl prima di solubilizzazione con i risultati DDM in una preparazione microsome più pulita e riduce gli agenti inquinanti in fasi successive. Questo passo è necessario nel protocollo GPL come campione CFTR finale è> 90% puro senza lavaggio microsome. Inoltre, purificazione nel DDM richiede alcune modifiche ai buffer di solubilizzazione unnd purificazione, cioè l'aggiunta di glicerolo oliva e sale. Insieme, queste aggiunte notevolmente aumentato il legame della proteina DDM-solubilizzato alla colonna.
La metodologia purificazione DDM ha margini di miglioramento, in particolare alla rimozione di un importante contaminante 40 kDa che, giudicato mediante spettrometria di massa, è dovuto alla subunità ribosomiale L3 lievito, che sembra avere un'affinità intrinseca per la resina nichel. Non c'è polyHis evidente sequenza nella proteina L3, ma l'esame della sua struttura 3D quando si lega al ribosoma (PDB = 1FFK) mostra che la subunità L3 piegato ha un potenziale polyHis cluster. Che questa band è meno problematica in materia GPL-purificato potrebbe essere dovuto al più duro detersivo GPL.
Sebbene la purificazione nel DDM sembra essere più povera di quella a GPL, detergenti lievi come DDM può essere più compatibile con analisi funzionali e strutturali e sono già stati utilizzati in vari crystall X-raystudi radiografico delle proteine di membrana 15-21. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che l'uso del GPL porta alla perdita della funzione ATPasi in CFTR relativo alla purificazione in DDM. Quindi si consiglia il protocollo di purificazione a base di GPL per la generazione di CFTR dove la purezza è cruciale, per esempio in applicazioni come la caratterizzazione di modificazioni post-traduzionali, o nella generazione di anticorpi, il protocollo basato GPL-verrebbe scelto . D'altra parte in applicazioni dove è essenziale l'attività e stato completamente nativo della proteina, proponiamo il protocollo basato DDM-come una scelta migliore.
Per concludere, questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l'isolamento di CFTR nella zwitterionici detersivo GPL-14 o il detergente non ionico DDM. Come tale indica una più ampia gamma di condizioni di depurazione per CFTR che precedentemente sono stati segnalati 10-13. Inoltre milligrammi quantità di CFTR purificata possono essereottenuti mediante questi procedimenti quando combinato con un sistema di crescita del lievito alto volume come un fermentatore 20 L e un sistema di raccolta di cellule di capacità elevata come una L 6 bassa velocità del rotore della centrifuga. Il CFTR ottenuto ha un tag GFP scindibile, che consente un facile monitoraggio della proteina in vari saggi biochimici e biofisici.
Il reagente descritto in questo manoscritto (pollo plasmide-CFTR contenenti o cellule di lievito congelate) può essere ottenuto attraverso la Cystic Fibrosis Foundation (USA).
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla US Cystic Fibrosis Foundation (CFF), attraverso la sua struttura consortile CFTR 3D. TR è stato finanziato da una borsa di studio nel Regno Unito CF Trust, e NC da una borsa di studio nel Regno Unito BBSRC. Noi riconosciamo i nostri colleghi della struttura consortile CFF CFTR 3D per il loro aiuto e consigli e per la progettazione dei polli sequenza CFTR e di depurazione tag codone ottimizzato.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |