Heterolog expression och rening av den cystisk fibros transmembran-(CFTR) är en betydande utmaning och begränsande faktorer vid utvecklingen av drogterapier för cystisk fibros. Detta protokoll beskriver två metoder för isolering av milligrammängder av CFTR lämpliga för funktionella och strukturella studier.
Defekter i cystisk fibros transmembran (CFTR) protein orsakar cystisk fibros (CF), en autosomal recessiv sjukdom som för närvarande begränsar den genomsnittliga förväntade livslängden för de drabbade att <40 år. Utvecklingen av nya läkemedelsmolekyler för att återställa aktiviteten av CFTR är ett viktigt mål i behandlingen CF, och isoleringen av funktionellt aktiva CFTR är ett viktigt steg mot att uppnå detta mål.
Vi beskriver två metoder för rening av CFTR från en eukaryot heterolog expressionssystem, S. cerevisiae. Liksom prokaryota system, S. cerevisiae kan snabbt vuxit i labbet till en låg kostnad, men kan också trafik-och posttranslationellt modifiera stora membranproteiner. Valet av tvättmedel för solubilisering och rening är ett kritiskt steg i reningen av varje membranprotein. Efter att ha screenas för lösligheten av CFTR i flera rengöringsmedel, har vi valt två contrasting rengöringsmedel för användning vid rening som gör att det slutliga CFTR preparat som skall anpassas till den senare planerade experiment.
I denna metod tillhandahåller vi jämförelse av reningen av CFTR i dodecyl-β-D-maltosid (DDM) och 1-tetradekanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein renas i DDM med denna metod visar ATPas aktivitet i funktionella analyser. Protein renades i gasol-14 visar hög renhet och utbyte, kan användas för att studera posttranslationella modifieringar, och kan användas för strukturella metoder såsom små vinklar röntgenspridning och elektronmikroskopi. Den visar dock betydligt lägre ATPas aktivitet.
Cystisk fibros (CF) är den vanligaste genetiska sjukdomen i Europa och Nordamerika med en incidens av cirka 1 i 2.500 levande födda. CF uppträder när mutationer i cystisk fibros transmembran-(CFTR)-proteinet orsaka förlust av dess funktion vid plasmamembranet av epitelceller 1. Den allvarligaste konsekvensen av detta fel är irreversibel lungskador, vilket förkortar den förväntade livslängden för de drabbade att <40 år 2,3.
CFTR är ett ATP-bindande kassett (ABC) transportör som har utvecklats till att bli en jonkanal 1,4. Trots sin ganska förändrad funktion i plasmamembranet av celler, behåller det fortfarande signifikant sekvenshomologi med andra ABC-transportörer. Fängslande, de specialiserade delarna av CFTR (dvs. dess reglerande regionen och dess N-och C-terminaler) delar ingen signifikant sekvenslikhet med andra flercelliga ABC transportörer, varför det inte finns några ledtrådar till the ursprunget till dessa sekvenser i CFTR. På grundval av dess primära struktur, är CFTR klassificeras som en C-familjemedlem ABC-transport familjen, men det finns inga starka bevis för en återstående funktionell koppling till denna undergrupp. Det har förekommit några rapporter om glutation transport aktivitet för CFTR 5-7, vilket skulle vara i linje med de roller som andra C-familjemedlemmar 8,9, även om andra rapporter tyder på att reducerad glutation kan hämma CFTR ATPas-aktivitet, snarare än att visa den substrat-inducerad stimulering som karakteriserar ABC-transportörer 10. Mätning av jon konduktans är tillräckligt känslig för att tillåta kanalaktiviteten av enstaka CFTR molekyler som ska studeras en och CFTR kanalegenskaperna har övervakas som en funktion av tid, temperatur, ATP-koncentration, membranpotential och fosforylering tillstånd, såväl som i den närvaron av en mängd små molekyler hämmare, potentiatorer och modifierare. Dessastudier har också lagt avsevärt till vår kunskap om hur ABC transportörer fungerar. Ändå har uttryck av CFTR i betydande mängder och dess efterföljande rening visat sig vara särskilt utmanande och framgångarna har varit begränsade till ett fåtal laboratorier 10-13.
Behovet av att utveckla mer effektiva läkemedel är knapp, men denna process har hindrats av bristen på renat CFTR för screening av små molekyler. Lösa CFTR uttryck och rening problemet skulle möjliggöra hög genomströmning drog screening som syftar till att rätta till den primära defekten i CF och skulle också öppna upp en väg för högupplösta strukturstudier för att informera rationell läkemedelsdesign. Dessutom är även relativt grundläggande biokemiska egenskaperna hos proteinet, såsom dess funktionella oligomera tillståndet, interagerande proteiner och ATPas-aktivitet förblir dåligt karaktäriserade. Vi har tidigare rapporterat ett protokoll för storskalig uttryck av GFP-och His-märkt mus CFTRi S. cerevisiae 14 och nu ytterligare beskriva protokoll för rening av CFTR. Vi har använt dessa metoder för att rena fem ortologer av CFTR, och presentera data för rening av kyckling CFTR som exempel. Valet av tvättmedel för solubilisering och rening är ett kritiskt steg i reningen av varje membranprotein. Efter screening med avseende på lösligheten av CFTR i flera detergenter, har vi valt två kontrasterande detergenter för användning vid reningen. Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) är en icke-jonisk detergent som har i stor utsträckning använts för både strukturella och funktionella studier av membranproteiner 15-21. Den joniska detergent 1-tetradekanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) är mycket effektiva i solubilisering av CFTR och har tidigare använts vid rening av funktionella membranproteiner 10, 22,23, inklusive rening av CFTR från S. cerevisiae 24. </ P>
Vi har tidigare beskrivit ett förfarande för överexpression av murint CFTR 14. Sedan publiceringen av detta protokoll, har vi uttryckt och renat flera olika ortologer av CFTR med samma system. Alla ortologer testats hittills renas väl i gasol tvättmedel, medan DDM reningen visade mer variation mellan olika ortologer (data visas ej). Denna flexibilitet illustrerar styrkan i jäst strategi: det är möjligt att screena många konstruktioner med relativa snabbhet för att välja en för ett särskilt ändamål.
Att tvätta jästen mikrosomer med buffert innehållande 1 M NaCl före lösningsgörande med DDM ger en renare mikrosomfraktion förberedelse och minskar föroreningar i senare skeden. Detta steg är onödigt i gasolprotokollet som sista CFTR provet är> 90% ren utan mikrosom tvätt. Vidare rening i DDM kräver flera ändringar till buffertarna för görande and rening, nämligen tillsatsen av extra glycerol och salt. Tillsammans ger dessa tillsatser kraftigt ökade bindningen av DDM-solubiliserade proteinet till kolonnen.
Den DDM reningsmetod har utrymme för förbättringar, särskilt avlägsnande av en 40 kDa stor förorening som, bedöms av masspektrometri, beror på jästen subenheten L3, som tycks ha en inneboende affinitet för nickel harts. Det finns ingen uppenbar polyHis sekvens i L3-proteinet, men undersökning av dess 3D-struktur när bundet till ribosomen (PDB = 1FFK) visar att den vikta L3 subenheten har en potential polyHis kluster. Det här bandet är mindre problematiskt i LPG-renade materialet kan bero på den hårdare gasol tvättmedel.
Även om reningen i DDM tycks vara sämre än i gasol, får mildare rengöringsmedel såsom DDM vara mer kompatibel med funktionella och strukturella analyser och har redan använts i flera röntgen crystallographic studier av membranproteiner 15-21. Dessutom är våra resultat visade att användningen av gasol leder till förlust av ATPas funktion i CFTR förhållande till rening i DDM. Hence vi rekommenderar gasolbaserade reningsprotokoll för generering av CFTR där renheten är viktig, till exempel i applikationer såsom karakterisering av posttranslationella modifieringar, eller vid alstring av antikroppar, gasolbaserat protokoll skulle väljas . Å andra sidan är i applikationer där aktiviteten och fullständigt nativa tillstånd av proteinet är nödvändigt, skulle vi föreslå DDM-baserat protokoll som ett bättre alternativ.
Avslutningsvis beskriver detta protokoll en reproducerbar metod för isolering av CFTR i zwitterjoniska tvättmedels LPG-14 eller den icke-joniska tvättmedel DDM. Som sådan visar ett större utbud av reningsvillkor för CFTR än tidigare har rapporterats 10-13. Dessutom milligram kvantiteter av renat CFTR kan varaerhållas med användning av dessa förfaranden när de kombineras med en hög volym jästtillväxt system, såsom en 20 L fermentor och en hög kapacitet cellskörd system, såsom en 6 L låg hastighet centrifugrotor. CFTR erhålles har en klyvbar GFP tagg som möjliggör enkel övervakning av proteinet i olika biokemiska och biofysiska analyser.
Det reagens som beskrivs i detta manuskript (kyckling CFTR-innehållande plasmid eller frysta jästceller) kan erhållas genom cystisk fibros Foundation (USA).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av den amerikanska Cystisk Fibros Foundation (CFF) genom dess CFTR 3D Structure Consortium. TR har finansierats av en brittisk CF Lita studentship, och NC av en brittisk BBSRC anställning. Vi erkänner våra kollegor i CFF CFTR 3D struktur konsortium för deras hjälp och råd och för utformningen av kodonoptimerade kyckling CFTR sekvens och renings taggar.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |