Heterolog uttrykk og rensing av cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) er betydelige utfordringer og begrensende faktorer i utviklingen av medisinsk behandling for cystisk fibrose. Denne protokollen beskriver to fremgangsmåter for isolering av milligram mengder av CFTR egnet for funksjonelle og strukturelle studier.
Defekter i cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) protein forårsaker cystisk fibrose (CF), en autosomal recessiv sykdom som i dag begrenser den gjennomsnittlige levealder for lider å <40 år. Utviklingen av nye stoffet molekyler å gjenopprette aktiviteten til CFTR er et viktig mål i behandlingen CF, og isolering av funksjonelt aktive CFTR er et nyttig skritt mot å oppnå dette målet.
Vi beskriver to fremgangsmåter for rensing av CFTR fra et eukaryot heterologt ekspresjonssystem, S. cerevisiae. Som prokaryote systemer, S. cerevisiae kan raskt vokst i laboratoriet til lave kostnader, men kan også trafikk og posttranslationally modifisere store membran proteiner. Valget av vaskemidler for solubilisering og rensing er et kritisk trinn i rensingen av en hvilken som helst membran-protein. Etter å ha undersøkt for løseligheten av CFTR i flere vaskemidler, er det valgt to contrasting vaskemidler for anvendelse ved rensing som gjør at det endelige CFTR forberedelse til å være tilpasset til de etterfølgende planlagte eksperimenter.
I denne fremgangsmåten, gir vi sammenligning av rensingen av CFTR i dodecyl-β-D-maltoside (DDM) og 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein ble renset i DDM ved denne metode viser ATPase-aktivitet i funksjonelle analyser. Protein ble renset i LPG-14 ser med høy renhet og utbytte, kan anvendes for å studere post-translasjonelle modifikasjoner, og kan brukes til konstruksjonsmetoder som for eksempel små vinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi. Men det viser betydelig lavere ATPase aktivitet.
Cystisk fibrose (CF) er den vanligste genetiske lidelse i Europa og Nord-Amerika med en forekomst på ca 1 i 2500 levendefødte. CF oppstår når mutasjoner i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) protein forårsake tap av dens funksjon ved plasmamembranen av epitelceller en. Den mest alvorlige konsekvensen av denne defekten er irreversibel lungeskade, som forkorter forventet levealder for lider å <40 år 2,3.
CFTR er en ATP-bindende kassett (ABC) transporter som har utviklet seg til å bli en ionekanal 1,4. Til tross for sin ganske forandret funksjon i plasma membran av celler, har den beholdt betydelige sekvens homologi med andre ABC transportører. Forbløffende nok, de spesialiserte deler av CFTR (dvs. regulerings regionen og dens N-og C-termini) dele ingen signifikant sekvenslikhet med andre metazoan ABC transportører, dermed er det ingen ledetråder til the opprinnelsen av disse sekvensene i CFTR. På basis av dens primære struktur skjer CFTR klassifisert som en C-familiemedlem på ABC-transportør-familien, men det er ikke noe bevis for en gjenværende funksjonell kopling til dette sub-familien. Det har vært noen rapporter om glutation transport aktivitet for CFTR 5-7, noe som ville være i samsvar med de rollene som andre C-familiemedlemmer 8,9, selv om andre rapporter tyder på at redusert glutation kan hemme CFTR ATPase aktivitet, snarere enn å vise det substrat-indusert stimulering som preger ABC transportører 10. Måling av ion ledningsevne er tilstrekkelig følsom til å tillate kanal aktivitet av enkelt CFTR-molekyler som skal studeres og en CFTR kanalegenskaper har vært overvåket som en funksjon av tid, temperatur, konsentrasjon ATP, membranpotensial og fosforylering tilstand, så vel som i nærvær av en mengde små molekyl-inhibitorer, potentiators og modifiseringsmidler. Dissestudier har også lagt betydelig til vår kunnskap om hvordan ABC transportører fungere. Ikke desto mindre, har ekspresjonen av CFTR i betydelige mengder og dets påfølgende rensing vist seg å være en særlig utfordring og suksess har vært begrenset til noen få laboratorier 10-13.
Behovet for å utvikle mer effektive legemidler er pressing, men denne prosess har blitt hindret av mangel på renset CFTR for screening av små molekyler. Løse CFTR uttrykk og rensing problemet ville muliggjøre høy gjennomstrømming narkotika screening sikte på å korrigere den primære defekten i CF og vil også åpne opp en rute for høyoppløselige strukturelle studier for å informere rasjonell drug design. Dessuten, selv relativt enkle biokjemiske egenskaper av proteinet, slik som funksjonell oligomere tilstand, interagerende proteiner og ATPase-aktivitet forbli dårlig karakterisert. Vi har tidligere rapportert en protokoll for storskala uttrykk for GFP-og Hans-merket murine CFTRi S. cerevisiae 14 og nå videre beskrive protokoller for rensing av CFTR. Vi har brukt disse metodene for å rense fem orthologues av CFTR, og presentere data for rensing av kylling CFTR som et eksempel. Valget av vaskemidler for solubilisering og rensing er et kritisk trinn i rensingen av en hvilken som helst membran-protein. Etter å ha undersøkt for løseligheten av CFTR i flere vaskemidler, er det valgt to kontrasterende vaskemidler for anvendelse ved rensing. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) er et ikke-ionisk vaskemiddel som har blitt brukt i stor utstrekning for både strukturelle og funksjonelle studier av membranproteiner 15-21. Den ioniske vaskemiddel 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) er svært effektiv i oppløseliggjøring av CFTR, og har tidligere vært benyttet i rensingen av funksjonelle membranproteiner 10, 22,23, inkludert rensing av CFTR fra S. cerevisiae 24. </ P>
Vi har tidligere beskrevet en fremgangsmåte for overekspresjon av murine CFTR 14.. Etter offentliggjøringen av at protokollen, har vi uttrykt og renset flere forskjellige orthologs av CFTR bruker samme system. Alle orthologs testet så langt renset godt i LPG vaskemiddel, mens DDM rensing viste mer variasjon på tvers av ulike orthologs (data ikke vist). Denne fleksibiliteten illustrerer styrken av gjær-metoden: det er mulig å screene mange konstruksjoner med relative hurtighet for å velge en for et bestemt formål.
Vasking gjær mikrosomer med buffer inneholdende 1 M NaCl før solubilisering med DDM resulterer i en renere micro fremstilling og reduserer forurensninger på senere stadier. Dette trinnet er unødvendig i LPG-protokoll som den endelige CFTR prøven er> 90% ren, uten at micro vask. Videre rensing i DDM krever flere endringer til buffere for solubilization ennd rensing, nemlig tilsetningen av ekstra glycerol og salt. Sammen utgjør disse tilsetninger betydelig økt binding av DDM-løseliggjort protein til kolonnen.
Den DDM rensing metodikk har rom for forbedring, spesielt for fjerning av en 40 kDa stor forurensning som, bedømt ved massespektrometri, er på grunn av gjær ribosomal-underenheten L3, som synes å ha en iboende affinitet for nikkel harpiks. Det finnes ingen åpenbar polyHis sekvens i L3 protein, men undersøkelse av sin 3D struktur når bundet til ribosomet (PDB = 1FFK) viser at den brettede L3 subenhet har et potensial polyHis klynge. At dette båndet er mindre problematisk i LPG-rensede materiale kan være på grunn av det hardere LPG vaskemiddel.
Selv om rensing i DDM ser ut til å være dårligere enn den i LPG, kan mildere vaskemidler som DDM være mer forenlig med funksjonelle og strukturelle analyser, og har allerede blitt brukt i flere røntgen crystallfisk metode studier av membran proteiner 15-21. Videre viser våre resultater indikerte at bruk av LPG fører til tap av ATPase-funksjonen i CFTR relativt til rensing i DDM. Derfor vil vi anbefale LPG-baserte rensing protokoll for generering av CFTR der renhet er viktig, for eksempel i anvendelser slik som karakterisering av posttranslasjonelle modifiseringer, eller i produksjon av antistoffer, LPG-basert protokoll vil velges . På den annen side i anvendelser hvor aktiviteten og fullt opprinnelige tilstand av proteinet er avgjørende, ville man foreslår derfor DDM-basert protokoll som et bedre alternativ.
For å konkludere, beskriver denne protokollen en reproduserbar metode for isolering av CFTR i zwitterionisk vaskemiddel LPG-14 eller ikke-ionisk detergent DDM. Som sådan er det indikerer et større spekter av rensebetingelser for CFTR enn tidligere har blitt rapportert 10-13. I tillegg milligram mengder av renset CFTR kan blioppnås ved hjelp av disse fremgangsmåter når det kombineres med et høyt volum gjærvekst-system slik som en 20 l fermentor og en høy kapasitet for cellehøstesystem som for eksempel en 6 L lav hastighet sentrifugerotor. Den oppnådde CFTR har en spaltbar GFP signal som tillater enkel overvåking av proteinet i en rekke biokjemiske og biofysiske assays.
Reagenset beskrevet i dette manuskriptet (kylling CFTR holdig plasmid eller frosne gjærceller) kan fås gjennom Cystisk fibrose Foundation (USA).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av den amerikanske Cystisk fibrose Foundation (CFF) gjennom sin CFTR 3D Structure Consortium. TR ble finansiert av en britisk CF Trust studieplass, og NC ved en britisk BBSRC studieplass. Vi erkjenner våre kolleger i CFF CFTR 3D struktur konsortium for deres hjelp og råd, og for utformingen av kodonoptimalisert kylling CFTR sekvens og rense tags.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |