Heterologe expressie en zuivering van het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) zijn belangrijke uitdagingen en beperkende factoren in de ontwikkeling van geneesmiddelen therapieën voor cystic fibrosis. Dit protocol beschrijft twee werkwijzen voor de isolatie van milligram hoeveelheden CFTR voor functionele en structurele studies.
Defecten in het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) eiwit veroorzaken cystic fibrosis (CF), een autosomaal recessieve ziekte die momenteel beperkt de gemiddelde levensverwachting van patiënten tot <40 jaar. De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen moleculen om de activiteit van CFTR te herstellen is een belangrijk doel in de behandeling CF, en de isolatie van functioneel actieve CFTR is een nuttige stap naar het bereiken van dit doel.
We beschrijven twee werkwijzen voor de zuivering van CFTR van een eukaryoot heteroloog expressiesysteem, S. cerevisiae. Zoals prokaryotische systemen, S. cerevisiae kan snel worden gekweekt in het laboratorium tegen lage kosten, maar kan ook het verkeer en posttranslationeel grote membraaneiwitten wijzigen. De selectie van wasmiddelen voor solubilisatie en zuivering is een kritische stap bij de zuivering van een membraaneiwit. Na gescreend op de oplosbaarheid van CFTR in verschillende wasmiddelen hebben we twee co gekozenntrasting wasmiddelen voor gebruik bij de zuivering waardoor het uiteindelijke CFTR preparaat worden afgestemd op de later geplande experimenten.
In deze methode geven we vergelijking van de zuivering van CFTR in dodecyl-β-D-maltoside (DDM) en 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Eiwitten gezuiverd DDM deze werkwijze toont ATPase activiteit in functionele assays. Eiwitten gezuiverd LPG-14 blijkt hoge zuiverheid en opbrengst kunnen worden toegepast om post-translationele modificaties te bestuderen, en kan gebruikt worden voor structurele werkwijzen zoals kleine-angle X-ray scattering en elektronenmicroscopie. Toont echter aanzienlijk lager ATPase activiteit.
Cystic fibrosis (CF) is de meest voorkomende erfelijke aandoening in Europa en Noord-Amerika met een incidentie van ongeveer 1 op de 2500 levendgeborenen. CF ontstaat wanneer mutaties in het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) eiwit leiden tot verlies van functionaliteit in het plasmamembraan van epitheelcellen 1. De meest ernstige gevolg van dit gebrek onomkeerbaar longschade, die de levensverwachting van patiënten verkort tot <40 jaar 2,3.
CFTR is een ATP-binding cassette (ABC) transporter die zich heeft ontwikkeld tot een ionkanaal 1,4 geworden. Ondanks de behoorlijk veranderde functie in het plasmamembraan van cellen, behoudt steeds aanzienlijke sequentiehomologie met andere ABC transporters. Intrigerend, de gespecialiseerde onderdelen van CFTR (dwz haar regulerende gebied en zijn N-en C-uiteinden) delen geen significante sequentie-overeenkomst met andere metazoan ABC transporters, dus zijn er geen aanwijzingen naar ee oorsprong van deze sequenties in CFTR. Op basis van de primaire structuur wordt CFTR geclassificeerd als een C-familielid van de ABC transporter familie, maar er is geen sterk bewijs voor een resterende functionele koppeling aan deze sub-familie. Er zijn enkele meldingen van glutathion vervoersactiviteiten al CFTR 5-7, die consistent zijn met de rollen van andere C-familieleden 8,9 zou zijn, hoewel andere rapporten suggereren dat gereduceerd glutathion het CFTR-ATPase activiteit kan remmen, in plaats van met de -substraat geïnduceerde stimulatie dat de ABC transporters karakteriseren 10. Meting van ion geleidbaarheid is voldoende gevoelig om de kanaalactiviteit van CFTR enkele moleculen te bestuderen 1 en CFTR kanaal eigenschappen zijn als functie van de tijd, temperatuur, ATP-concentratie, membraanpotentiaal en fosforylering staat, en in de aanwezigheid van een groot aantal kleine molecule inhibitoren, potentiators en modifiers. Dezestudies hebben ook aanzienlijk toegevoegd aan onze kennis van hoe ABC transporters functioneren. Niettemin expressie van CFTR in significante hoeveelheden en de daaropvolgende zuivering heeft bewezen een bijzondere uitdaging en succes is beperkt tot enkele laboratoria 10-13 zijn.
De noodzaak om meer doeltreffende geneesmiddelen te ontwikkelen is druk, maar dit proces is belemmerd door het gebrek aan gezuiverd CFTR voor het screenen van kleine moleculen. Het oplossen van de CFTR expressie en zuivering probleem zou high-throughput screening van geneesmiddelen gericht op het corrigeren van de primaire defect in CF staat en zou ook open te stellen een route voor structurele studies van hoge-resolutie te rational drug design informeren. Zelfs relatief eenvoudige biochemische eigenschappen van het eiwit, zoals de functionele oligomere toestand interagerende eiwitten en ATPase activiteit blijven slecht gekarakteriseerd. We hebben eerder gemeld een protocol voor de grootschalige expressie van GFP-en His-gelabelde muizen CFTRin S. cerevisiae 14 en nu verder protocollen beschrijven de zuivering van CFTR. Wij hebben deze methoden vijf orthologen van CFTR en presenteren gegevens te zuiveren voor het zuiveren van kip CFTR als voorbeeld. De selectie van wasmiddelen voor solubilisatie en zuivering is een kritische stap bij de zuivering van een membraaneiwit. Na gescreend op de oplosbaarheid van CFTR in verschillende wasmiddelen, kozen we twee contrasterende wasmiddelen voor gebruik bij de zuivering. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) is een niet-ionische detergens dat uitgebreid gebruikt voor zowel structurele en functionele studies van membraaneiwitten 15-21. De ionische detergens 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) is zeer efficiënt in de solubilisatie van CFTR en is eerder toegepast bij de zuivering van functionele membraaneiwitten 10, 22,23, waaronder zuivering van CFTR uit S. cerevisiae 24. </ P>
Wij hebben eerder beschreven een werkwijze voor de overexpressie van muizen CFTR 14. Sinds de publicatie van dat protocol, hebben we expressie gebracht en gezuiverd verschillende orthologen van CFTR met hetzelfde systeem. Alle orthologen getest dusver goed gezuiverd LPG wasmiddel, terwijl de DDM zuivering vertoonden meer variatie tussen verschillende orthologen (gegevens niet getoond). Deze flexibiliteit geeft de sterkte van de gist benadering: het is mogelijk om vele constructen betrekkelijk snelheid screenen teneinde een voor een bepaald doel te selecteren.
Het wassen van de gist microsomen met een buffer met 1 M NaCl voorafgaand aan het oplosbaar met DDM resulteert in een schoner microsoom voorbereiding en vermindert de verontreinigingen in latere stadia. Deze stap is niet nodig in de LPG-protocol als de laatste CFTR monster is> 90% zuiver, zonder de microsoom wassen. Bovendien, zuivering in DDM vereist een aantal aanpassingen aan de buffers voor een oplosbaarnd zuivering, namelijk het toevoegen van extra glycerol en zout. Samen vormen deze toevoegingen aanzienlijke toename binding van de DDM-oplosbaar eiwit aan de kolom.
De DDM zuivering methodologie biedt ruimte voor verbetering, in het bijzonder de verwijdering van een 40 kDa grote verontreinigingen die, beoordeeld door massaspectrometrie, is door de gist ribosomale subeenheid L3, die lijkt een inherente affiniteit voor de nikkel hars. Er is geen duidelijke polyHis sequentie in de L3 eiwit, maar onderzoek van de 3D-structuur wanneer gebonden aan het ribosoom (VOB = 1FFK) blijkt dat de gevouwen L3 subeenheid potentiële polyHis cluster. Dat deze band minder problematisch LPG gezuiverde materiaal kan door het hardere LPG wasmiddel.
Hoewel de zuivering in DDM lijkt slechter dan die in LPG zijn, kan milder detergenten zoals DDM meer compatibel met functionele en structurele analyses en zijn al gebruikt in diverse X-ray crystallographic studies van membraaneiwitten 15-21. Bovendien, onze resultaten aan dat het gebruik van LPG leidt tot verlies van ATPase functie CFTR opzichte zuivering in DDM. Daarom zouden we de LPG-gebaseerde zuiveringsvoorschrift aanbevolen voor het genereren van CFTR waarbij de zuiverheid cruciaal is, bijvoorbeeld in toepassingen zoals de karakterisatie van post-translationele modificaties, of het genereren van antilichamen, de LPG-gebaseerd protocol worden gekozen . Anderzijds in toepassingen waar de activiteit en volledig natieve toestand van het eiwit essentieel is, zouden we de DDM-gebaseerd protocol voorgesteld als een betere optie.
Tot slot, dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor het isoleren van CFTR in zwitterionische detergens LPG-14 of niet-ionisch detergens DDM. Als zodanig geeft een groter bereik van zuiveringsomstandigheden voor CFTR dan eerder gerapporteerd 10-13. Bovendien milligram hoeveelheden gezuiverde CFTR kanverkregen met behulp van deze procedures in combinatie met een hoog volume gistgroei systeem, zoals een 20 L vergister en een hoge capaciteit cel oogsten zoals een 6 L lage snelheid centrifuge rotor. De verkregen CFTR heeft een splitsbaar GFP-tag die eenvoudige controle van het eiwit in verschillende biochemische en biofysische analyses maakt.
De in dit manuscript (kip-CFTR bevattend plasmide of bevroren gistcellen) beschreven reagens kan worden verkregen via de Cystic Fibrosis Foundation (USA).
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Amerikaanse Cystic Fibrosis Foundation (CFF) via haar CFTR 3D Structuur Consortium. TR werd gefinancierd door een Britse CF Trust studententijd, en NC door een Britse BBSRC studententijd. Wij erkennen onze collega's in de CFF CFTR 3D-structuur consortium voor hun hulp en advies en voor het ontwerp van de-codon geoptimaliseerde kip CFTR volgorde en zuivering tags.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |