异源表达和囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)的净化是显著的挑战和制约因素的药物治疗囊性纤维化的发展。这个协议描述了两种方法的CFTR的毫克量适合于功能和结构研究的分离。
在囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)蛋白缺陷导致囊性纤维化(CF),为常染色体隐性遗传病,目前限制了患者的平均寿命为<40岁。新型药物分子的发展,恢复CFTR的活性在治疗CF的一个重要目标,而功能活跃CFTR的隔离是实现这一目标的一个有益的步骤。
我们描述了两种方法的CFTR的纯化来自真核异源表达系统,S.酵母 。像原核系统中,S。酵母可以迅速地生长在实验室以较低的成本,而且还交通和翻译后可以修改大量的膜蛋白。洗涤剂的溶解和纯化的选择是任意的膜蛋白的纯化的关键步骤。有几种洗涤剂筛选CFTR的溶解度,我们选择了两种合作ntrasting洗涤剂中的净化,使最终的CFTR准备进行调整以适应随后计划实验。
在该方法中,我们提供的CFTR的十二烷基-β-D-麦芽糖苷的纯化(DDM)和比较1 -十四烷酰基-sn-甘油基-3 -磷酸-(1'-rac-甘油)(LPG-14)。蛋白质用这种方法在DDM纯化显示功能分析ATP酶的活性。蛋白质在LPG-14纯化,显示出高的纯度和收率,可以用来研究翻译后修饰,并且可用于结构的方法,如小角X-射线散射和电子显微镜。然而,它显示显著低ATP酶活性。
囊性纤维化(CF)是最常见的遗传性疾病在欧洲和北美约1 2,500活产婴儿的发病率。 CF时发生突变的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR),其功能在上皮细胞1的质膜蛋白引起的损失。这种缺陷最严重的后果是不可逆的肺损伤,缩短患者的预期寿命为<40岁年龄2,3。
CFTR是一个ATP结合盒(ABC)转运,已演变成为一种离子通道1,4。尽管它在细胞的质膜相当的功能改变,但仍保留显著的序列同源性和其它的ABC转运。有趣的是,CFTR( 即其监管区域和它的N-和C-末端)的专用零件不共享显著序列相似性与其他后生动物的ABC转运,因此没有线索,TH在CFTR这些序列电子商务的起源。其主要结构的基础上,CFTR被列为ABC转运蛋白家族的一个C-家庭成员,但对于剩余的功能联动,这个子系列没有强有力的证据。已经有谷胱甘肽转运活性的一些报道对CFTR 5-7,这将是与其他C-家族成员8,9的作用相一致,尽管其他报告表明,还原型谷胱甘肽可以抑制CFTR的ATP酶活性,而不是示出了底物诱导的刺激所特有的ABC转运10。离子电导的测量是足够灵敏,以允许单个CFTR分子的通道的活性进行研究1和CFTR通道属性已监测作为时间的函数,温度,ATP浓度,膜电位,磷酸化状态,以及在存在一系列的小分子抑制剂,增强剂和改性剂。这些研究也显著我们的ABC转运蛋白如何工作的知识补充。然而,CFTR的显著金额和其后续的纯化表达已被证明是特别具有挑战性和成功一直局限于几个实验室10-13。
开发更有效的药物,需要紧迫,但这个过程已经阻碍了缺乏CFTR纯化筛选小分子。解决CFTR的表达和纯化的问题将使高通量药物筛选旨在纠正在CF中的主要缺陷,也将打开的高分辨率结构研究路由信息来告知合理的药物设计。此外,蛋白质,例如其功能寡聚状态,相互作用蛋白和ATP酶活性的甚至相对基本的生物化学特性保持差的特点。之前我们已经报道了协议的绿色荧光蛋白和His标签的小鼠CFTR大型表达在S酵母 14,现在进一步描述了CFTR的净化方案。我们使用这些方法来净化5直向同源物CFTR的,并且本数据为鸡CFTR的纯化,例如,洗涤剂的溶解和纯化的选择是任意的膜蛋白的纯化的关键步骤。有几种洗涤剂筛选的CFTR中的溶解度,我们选择使用两种截然不同的洗涤剂中的纯化。十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)是一种非离子型洗涤剂已被广泛地用于膜蛋白15-21的结构和功能的研究。离子型洗涤剂1 -十四烷酰基-sn-甘油基-3 -磷酸-(1'-rac-甘油)(LPG-14)是高效的CFTR的溶解,并在功能性膜蛋白10的纯化以前被使用过, 22,23,其中包括从S中提纯的CFTR 酵母24。</ P>
我们先前已经描述了鼠CFTR 14的过表达的方法。由于该协议的发布,我们已经表达和纯化CFTR几种不同直向同源使用相同的系统。所有测试的直向同源物迄今纯化以及在液化石油气洗涤剂,而DDM纯化表明在不同的直向同源物更多的变化(数据未显示)。这种灵活性说明了酵母的方法的力量:它可以筛选许多结构相对快速性,以选择一个适合某特定用途。
洗涤酵母微粒体用含有1M NaCl的前增溶与DDM结果在吸尘器微粒制剂,并减少污染物在稍后阶段的缓冲区。这一步是不必要的液化石油气协议作为最终的CFTR的样品纯度> 90%无微粒冲洗。此外,净化DDM需要几个改动的缓冲区增溶一次提纯,即增加了额外的甘油和盐。一起,这些添加显着增加了DDM-溶解蛋白质的柱的结合。
DDM的纯化方法有改进的余地,尤其是去除那,判断通过质谱一个40kDa的主要污染物,是由于酵母核糖体亚基的L3,这似乎对镍树脂固有的亲和力。有在L3蛋白无明显polyHis序列,但检查其三维结构时结合到核糖体(PDB = 1FFK)示出了折叠的L3亚基具有潜在polyHis集群。这个乐队是在液化石油气纯化材料问题较少的原因可能是更严厉的液化石油气清洁剂。
虽然纯化DDM似乎是比在液化石油气较差,较温和的清洁剂如DDM可以是具有的功能和结构的分析更加兼容并且已经在几个透视晶的使用膜蛋白15-21的海洋学研究。此外,我们的研究结果显示,使用液化石油气导致了相对CFTR的ATP酶功能丧失,以净化DDM。因此,我们建议石油气为基础的纯化方案CFTR的产生,其中纯度是至关重要的,例如在应用,如翻译后修饰的表征,或在抗体的产生,液化石油气为基础的协议将被选择。在应用中的蛋白质的活性,并完全原生的状态是至关重要的另一方面,我们也提出了DDM的协议是一个更好的选择。
最后,该协议描述了CFTR中的两性离子洗涤剂石油气-14或非离子型洗涤剂DDM隔离一个可重复的方法。因此,它表示一个更大范围的纯化条件为CFTR比以前已报道10-13。此外毫克纯化的CFTR的数量可以是当具有高体积酵母生长系统,如20升发酵罐和一个大容量的细胞收集系统,如6升低速离心机转子组合使用这些方法获得。得到的CFTR具有裂解GFP标记,它允许在不同的生物化学和生物物理实验容易监测的蛋白质。
在这个手稿(含鸡CFTR的质粒或冻结的酵母细胞)中描述的试剂可以通过囊性纤维化基金会(美国)获得。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是通过其CFTR三维结构协会由美国囊性纤维化基金会(CFF)。 TR是由英国的CF信托助学金,并通过数控英国BBSRC助学金。我们承认我们的同事在CFF CFTR三维结构财团的帮助和咨询,并为密码子优化的鸡CFTR序列和纯化标签的设计。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |