Heterolog ekspression og oprensning af cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) er betydelige udfordringer og begrænsende faktorer i udviklingen af lægemiddelbehandlinger for cystisk fibrose. Denne protokol beskriver to metoder til isolering af milligram mængder af CFTR egnet til funktionelle og strukturelle studier.
Fejl i cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator (CFTR) protein forårsager cystisk fibrose (CF), en autosomal recessiv sygdom, der i øjeblikket begrænser den gennemsnitlige levealder for syge til <40 år. Udviklingen af nye narkotika molekyler til at genoprette aktiviteten af CFTR er et vigtigt mål i behandlingen CF, og isolering af funktionelt aktivt CFTR er et nyttigt skridt i retning af at nå dette mål.
Vi beskriver to fremgangsmåder til oprensning af CFTR fra en eukaryot heterologt ekspressionssystem S. cerevisiae. Ligesom prokaryote systemer, S. cerevisiae hurtigt kan dyrkes i laboratoriet til en lav pris, men kan også trafik og posttranslationelt ændre store membranproteiner. Udvælgelsen af vaskemidler til solubilisering og rensning er et afgørende skridt i oprensningen af enhver membran protein. Efter at have screenet for opløseligheden af CFTR i flere vaskemidler, har vi valgt to contrasting detergenter til anvendelse i oprensning, der tillader den endelige CFTR præparat skal skræddersys til de efterfølgende planlagte eksperimenter.
I denne fremgangsmåde giver vi sammenligning af oprensningen af CFTR i dodecyl-β-D-maltoside (DDM) og 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (LPG-14). Protein renset i DDM ved denne metode viser ATPase aktivitet i funktionelle assays. Protein oprenset i LPG-14 viser høj renhed og udbytte, kan anvendes til at studere post-translationelle modifikationer, og kan anvendes til strukturelle metoder såsom små-vinkel røntgenspredning og elektronmikroskopi. Det udviser imidlertid betydeligt lavere ATPase-aktivitet.
Cystisk fibrose (CF) er den mest almindelige genetiske lidelse i Europa og Nordamerika med en incidens på omkring 1 i 2.500 levendefødte. CF forekommer, når mutationer i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) protein forårsage tab af dets funktion på plasmamembranen af epitelceller 1. Den mest alvorlige konsekvens af denne defekt er irreversibel lungeskade, hvilket forkorter den forventede levetid for syge til <40 år 2,3.
CFTR er en ATP-bindende kassette (ABC) transporter, der har udviklet sig til en ionkanal 1,4. Trods sin helt ændret funktion i plasmamembranen i celler, er det stadig bevarer signifikant sekvenshomologi med andre ABC transportører. Interessant de specialiserede dele af CFTR (dvs. dets regulatoriske region og dets N-og C-terminalerne) deler ingen signifikant sekvens lighed med andre metazoan ABC transportører, og derfor er der ingen fingerpeg til the oprindelsen af disse sekvenser i CFTR. På grundlag af sin primære struktur er CFTR klassificeret som en C-familie medlem af ABC transportør familien, men der er ingen stærke beviser for en residual funktionel kobling til denne sub-familie. Der har været nogle rapporter om glutathion transport aktivitet for CFTR 5-7, hvilket ville være i overensstemmelse med de roller, andre C-familiemedlemmer 8,9, selv om andre rapporter tyder på, at reduceret glutathion kan hæmme CFTR ATPaseaktivitet, snarere end at vise den substrat-induceret stimulering, der kendetegner ABC transportører 10. Måling af ion-ledningsevne er tilstrækkelig følsom til at muliggøre kanalen aktivitet af CFTR-molekyler at blive undersøgt 1 og CFTR kanal egenskaber er blevet overvåget som en funktion af tid, temperatur, ATP-koncentration, membranpotentiale og phosphorylering tilstand, såvel som i tilstedeværelsen af et væld af små molekyle inhibitorer, potentiatorer, og modifikatorer. Disseundersøgelser har også tilføjet betydeligt til vores viden om, hvordan ABC transportører fungere. Ikke desto mindre har udtryk af CFTR i betydelige mængder og dens efterfølgende oprensning vist sig at være særligt udfordrende og succes har været begrænset til nogle få laboratorier 10-13.
Behovet for at udvikle mere effektive lægemidler er knap, men denne proces er blevet hæmmet af manglen på renset CFTR til screening små molekyler. Løsning CFTR ekspression og oprensning problem ville gøre det muligt for high-throughput medikamentscreeningsanalyse sigte mod at korrigere den primære defekt i CF og vil også åbne op for en rute til høj opløsning strukturelle studier til at informere rationelt drug design. Desuden forbliver selv relativt basale biokemiske egenskaber af proteinet, såsom dens funktionelle oligomere tilstand interagerende proteiner og ATPase-aktivitet dårligt karakteriseret. Vi har tidligere rapporteret om en protokol for storstilet udtryk for GFP-og His-mærkede murine CFTRi S. cerevisiae 14 og nu yderligere beskrive protokoller til rensning af CFTR. Vi har brugt disse metoder til at rense fem orthologues af CFTR og præsentere data til rensning af kylling CFTR som et eksempel. Udvælgelsen af vaskemidler til solubilisering og rensning er et afgørende skridt i oprensningen af enhver membran protein. Have screenet for opløseligheden af CFTR i flere detergenter, har vi valgt to modsatrettede rengøringsmidler til anvendelse i oprensning. Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) er en ikke-ionisk detergent, der har været flittigt brugt til både strukturelle og funktionelle studier af membranproteiner 15-21. Den ionisk detergent 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (LPG-14) er yderst effektive i solubilisering af CFTR og er tidligere blevet anvendt i oprensningen af funktionelle membranproteiner 10, 22,23, herunder oprensning af CFTR fra S. cerevisiae 24. </ P>
Vi har tidligere beskrevet en fremgangsmåde til overekspression af murine CFTR 14. Siden offentliggørelsen af denne protokol, har vi udtrykt og oprenset flere forskellige orthologer af CFTR bruger det samme system. Alle testede orthologer hidtil renses godt i LPG detergent, mens DDM oprensning viste mere variation på tværs af forskellige ortologer (data ikke vist). Denne fleksibilitet illustrerer styrken af gær tilgang: Det er muligt at screene mange konstruktioner med relativ hurtighed med henblik på at vælge en til et bestemt formål.
Vask gæren mikrosomer med buffer indeholdende 1 M NaCl før solubilization med DDM resulterer i en renere mikrosom forberedelse og reducerer forurenende stoffer på et senere tidspunkt. Dette trin er unødvendigt i LPG-protokollen som det endelige CFTR prøven er> 90% ren uden mikrosom vask. Endvidere oprensning i DDM kræver flere ændringer i bufferne for solubilisering ennd oprensning, nemlig tilsætning af ekstra glycerol og salt. Sammen disse tilføjelser steget betydeligt binding af DDM-opløseliggjorte protein til søjlen.
DDM oprensningsmetodik har mulighed for forbedringer, navnlig fjernelse af en 40 kDa store forurenende, at bedømt af massespektrometri, skyldes gær ribosomale subunit L3, som synes at have en forkærlighed for nikkel harpiks. Der er ikke nogen indlysende polyHis sekvens i L3 protein, men en undersøgelse af dens 3D-struktur når det er bundet til ribosomet (PDB = 1FFK) viser, at den foldede L3 underenheden har et potentiale polyHis klynge. At dette band er mindre problematisk i LPG-renset materiale kan skyldes den barskere LPG vaskemiddel.
Selvom rensning i DDM synes at være dårligere end i LPG, kan mildere rengøringsmidler såsom DDM være mere kompatible med funktionelle og strukturelle analyser og har allerede været brugt i flere røntgen crystallographic studier af membranproteiner 15-21. Desuden er vores resultater viste, at brugen af LPG fører til tab af ATPase funktion i CFTR i forhold til oprensning i DDM. Derfor vil vi anbefale LPG-baserede oprensningsprotokol til generering af CFTR hvor renhed er afgørende, for eksempel i applikationer såsom karakterisering af post-translationelle modifikationer, eller i genereringen af antistoffer, LPG-baseret protokol ville blive valgt . På den anden side i applikationer, hvor aktiviteten og fuldt native tilstand af proteinet er afgørende, foreslår vi DDM-baseret protokol som en bedre løsning.
Til slut, denne protokol beskriver en reproducerbar metode til isolering af CFTR i zwitterioniske detergent LPG-14 eller det ikke-ioniske detergent DDM. Som sådan er det indikerer en større vifte af rensning betingelser for CFTR end der tidligere har været rapporteret 10-13. Desuden milligram mængder af oprenset CFTR kan væreopnået ved anvendelse af disse procedurer, når det kombineres med en høj volumen gærvækst, såsom en 20 L fermentor og en høj kapacitet cellehøst, såsom en 6 L lav hastighed centrifugerotoren. CFTR opnås, har en spaltelig GFP tag som muliggør en nem overvågning af proteinet i forskellige biokemiske og biofysiske assays.
Beskrevet i dette manuskript (kylling CFTR-holdige plasmid eller frosne gærceller) reagens kan fås gennem cystisk fibrose Foundation (USA).
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af den amerikanske cystisk fibrose Foundation (CFF) gennem sin CFTR 3D Structure Consortium. TR blev finansieret af en britisk CF Trust studentship, og NC af en britisk BBSRC studentship. Vi anerkender vores kolleger i CFF CFTR 3D struktur konsortium for deres hjælp og rådgivning og for udformningen af codon-optimeret kylling CFTR sekvens og rensning tags.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |