La expresión heteróloga y purificación del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) son retos importantes y los factores limitantes en el desarrollo de terapias con medicamentos para la fibrosis quística. Este protocolo describe dos métodos para el aislamiento de cantidades de miligramos de CFTR adecuados para los estudios funcionales y estructurales.
Los defectos en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) de proteínas causan la fibrosis quística (FQ), una enfermedad autosómica recesiva que actualmente limita la esperanza media de vida de los enfermos a <40 años de edad. El desarrollo de moléculas de drogas nuevas para restaurar la actividad de CFTR es un objetivo importante en el tratamiento de la FQ, y el aislamiento de CFTR funcionalmente activo es una medida útil para lograr este objetivo.
Se describen dos métodos para la purificación de CFTR de un sistema de expresión heteróloga eucariótica, S. cerevisiae. Al igual que los sistemas procariotas, S. cerevisiae se puede cultivar rápidamente en el laboratorio a bajo costo, sino también el tráfico y después de la traducción puede modificar proteínas de membrana grandes. La selección de los detergentes para la solubilización y purificación es un paso crítico en la purificación de cualquier proteína de membrana. Habiendo proyectado para la solubilidad de CFTR en varios detergentes, hemos elegido dos contrasting detergentes para su uso en la purificación que permiten la preparación de CFTR final para ser adaptado a los experimentos planificados posteriormente.
En este método, proporcionamos comparación de la purificación de CFTR en dodecil-β-D-maltósido (DDM) y 1-tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (GLP-14). La proteína purificada en DDM por este método muestra la actividad ATPasa en ensayos funcionales. Proteína purificada en GLP-14 muestra una alta pureza y rendimiento, se pueden emplear para estudiar las modificaciones post-traduccionales, y se puede utilizar para los métodos estructurales tales como de pequeño ángulo de dispersión de rayos X y microscopía electrónica. Sin embargo, muestra la actividad de la ATPasa significativamente menor.
La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad genética más común en Europa y América del Norte, con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 2.500 nacidos vivos. CF ocurre cuando las mutaciones en el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) causa la proteína pérdida de su función en la membrana plasmática de las células epiteliales 1. La consecuencia más grave de este defecto es el daño pulmonar irreversible, lo cual acorta la esperanza de vida de los enfermos a <40 años de edad 2,3.
CFTR es un ATP vinculante cassette (ABC) transportador que ha evolucionado para convertirse en un 1,4 del canal iónico. A pesar de su función bastante alterado en la membrana plasmática de las células, que aún conserva homología de secuencia significativa con otros transportadores ABC. Curiosamente, las partes especializadas del CFTR (es decir, su región reguladora y su N-y C-terminales) comparten ninguna similitud de secuencia significativa con otros metazoos transportadores ABC, por lo tanto, no hay pistas en cuanto a the orígenes de estas secuencias en CFTR. Sobre la base de su estructura primaria, CFTR está clasificado como un miembro de la familia C-de la familia de transportadores ABC, pero no hay evidencia fuerte para un enlace funcional residual para esta sub-familia. Ha habido algunos informes de la actividad del transporte glutatión para CFTR 5-7, lo que sería coherente con el papel de los otros miembros de la familia C-8,9, aunque otros informes sugieren que el glutatión reducido puede inhibir la actividad CFTR ATPasa, en lugar de mostrar la estimulación inducida por sustrato-que caracterizan a los transportadores ABC 10. La medición de la conductancia de iones es suficientemente sensible para permitir la actividad de los canales de CFTR moléculas individuales que se estudió 1 y las propiedades del canal CFTR han sido controlados como una función de tiempo, temperatura, concentración de ATP, potencial de membrana, y estado de fosforilación, así como en la presencia de una gran cantidad de inhibidores de moléculas pequeñas, potenciadores, y modificadores. Estosestudios también han aumentado considerablemente nuestro conocimiento de cómo funcionan los transportadores ABC. Sin embargo, la expresión de CFTR en cantidades significativas y su posterior purificación ha demostrado ser particularmente difícil y el éxito ha sido limitado a unos pocos laboratorios 10-13.
La necesidad de desarrollar fármacos más eficaces es apremiante, sin embargo, este proceso se ha visto obstaculizado por la falta de CFTR purificada para la detección de moléculas pequeñas. Resolver el problema de la expresión de CFTR y purificación permitiría la detección de drogas de alto rendimiento destinado a corregir el defecto primario en la FQ y podría también abrir una ruta para estudios estructurales de alta resolución para informar el diseño racional de fármacos. Por otra parte, incluso características bioquímicas relativamente básicas de la proteína, tales como su estado oligomérico funcional, las proteínas que interactúan y la actividad ATPasa permanecen pobremente caracterizados. Hemos informado anteriormente de un protocolo para la expresión a gran escala de las buenas prácticas agrarias y CFTR murino marcado con Hisen S. cerevisiae 14 y ahora también describen protocolos para la purificación de CFTR. Hemos utilizado estos métodos para purificar cinco orthologues de CFTR, y los datos presentes para la purificación de CFTR pollo como un ejemplo. La selección de los detergentes para la solubilización y purificación es un paso crítico en la purificación de cualquier proteína de membrana. Después de haber proyectado para la solubilidad de CFTR en varios detergentes, hemos elegido dos detergentes de contraste para uso en la purificación. Dodecil-β-D-maltósido (DDM) es un detergente no iónico que se ha utilizado ampliamente para ambos estudios estructurales y funcionales de las proteínas de membrana 15-21. El detergente iónico 1-tetradecanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (GLP-14) es altamente eficaz en la solubilización de CFTR y se ha utilizado anteriormente en la purificación de proteínas de membrana funcionales 10, 22,23, incluyendo la purificación de CFTR a partir de S. cerevisiae 24. </ P>
Hemos descrito previamente un método para la sobreexpresión de CFTR murino 14. Desde la publicación de ese protocolo, hemos expresado y purificado varias orthologs diferentes de CFTR utilizando el mismo sistema. Todos los ortólogos probado hasta ahora purificaron bien en el detergente de GLP, mientras que la purificación DDM mostró más variación entre diferentes ortólogos (datos no mostrados). Esta flexibilidad ilustra la fortaleza del enfoque de la levadura: es posible seleccionar muchas construcciones con relativa rapidez con el fin de seleccionar uno para un propósito particular.
Lavar los microsomas de levadura con tampón que contenía 1 M de NaCl antes de la solubilización con resultados DDM en una preparación de microsoma más limpio y reduce los contaminantes en las etapas posteriores. Este paso no es necesario en el protocolo GLP como la muestra final de CFTR es> 90% puro sin el lavado de microsomas. Además, la purificación en DDM requiere varias alteraciones a los tampones para la solubilización de unND purificación, a saber, la adición de glicerol y el exceso de sal. En conjunto, estas adiciones aumentaron considerablemente la unión de la proteína-DDM solubilizado a la columna.
La metodología de purificación DDM tiene margen para la mejora, en particular, la eliminación de un contaminante principal 40 kDa que, juzgado por espectrometría de masas, es debido a la subunidad ribosómica de levadura L3, que parece tener una afinidad inherente para la resina de níquel. No hay una secuencia poliHis obvio en la proteína L3, pero el examen de su estructura 3D cuando se une al ribosoma (AP = 1FFK) muestra que la subunidad L3 plegada tiene un clúster poliHis potencial. Que esta banda es menos problemática en materia de GLP-purificado puede ser debido a que el detergente GLP más dura.
Aunque la purificación en DDM parece ser más pobre que en GLP, detergentes más suaves tales como DDM pueden ser más compatible con los análisis funcionales y estructurales y se han utilizado ya en varios crystall de rayos Xestudios radiográficos de las proteínas de membrana 15-21. Además, nuestros resultados indicaron que el uso de GLP conduce a la pérdida de la función ATPasa en CFTR en relación con la purificación en DDM. Por lo tanto le recomendamos el protocolo de purificación a base de GLP para la generación de CFTR donde la pureza es crucial, por ejemplo, en aplicaciones tales como la caracterización de las modificaciones post-traduccionales, o en la generación de anticuerpos, se elegiría el protocolo basado en GLP . Por otro lado, en aplicaciones en las que es esencial la actividad y estado completamente nativa de la proteína, propondríamos el protocolo basado en DDM como una mejor opción.
Para concluir, este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de CFTR en el detergente zwitteriónico GLP-14 o el detergente no iónico DDM. Como tal, indica una mayor gama de condiciones de purificación para CFTR que han sido previamente informado 10-13. En miligramo Además cantidades de CFTR purificados pueden serobtenido utilizando estos procedimientos cuando se combina con un sistema de crecimiento de la levadura de alto volumen tal como un fermentador de 20 L y un sistema de recolección de células de alta capacidad tal como un 6 L de rotor de la centrifugadora de baja velocidad. El CFTR obtenido tiene una etiqueta GFP escindible que permite la monitorización fácil de la proteína en diversos ensayos bioquímicos y biofísicos.
El reactivo se describe en este manuscrito (plásmido que contiene CFTR-pollo o células de levadura congelados) se puede obtener a través de la Fundación de Fibrosis Quística (EE.UU.).
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los EE.UU. Fundación de Fibrosis Quística (CFF) a través de su estructura Consorcio CFTR 3D. TR fue financiado por una beca Unido CF Trust, y Carolina del Norte por una beca Unido BBSRC. Reconocemos a nuestros colegas en la estructura de consorcio CFF CFTR 3D por su ayuda y asesoramiento y para el diseño de las secuencias CFTR pollo y purificación de las etiquetas de codones optimizados.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |