Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.
Kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) kusurlar protein kistik fibrozis (CF), şu anda yaş <40 yıl hastalarının ortalama yaşam beklentisi sınırlar otozomal resesif hastalığa neden. CFTR aktivitesini geri yeni ilaç moleküllerinin geliştirilmesi tedavi CF önemli bir hedeftir, ve işlevsel aktif CFTR izolasyon bu hedefe ulaşmada yararlı bir adımdır.
Bir ökariyotik heterolog ifade sisteminde, S'den CFTR saflaştırılması için iki yöntem tarif cerevisiae. Prokaryotik sistemleri gibi, G. cerevisiae hızla düşük maliyetle laboratuvarda yetiştirilen olabilir, ama aynı zamanda trafik ve posttranslationally büyük membran proteinleri değiştirebilirsiniz. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır sonra, iki eş seçtikNihai CFTR preparat, daha sonra planlanan deneyler için uygun hale getirilmesine olanak saflaştırılmasında kullanılmak için deterjanlar ntrasting.
Bu yöntemde, biz dodesil-β-D-maltoside CFTR saflaştırma (DDM) ve karşılaştırma sağlamak 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) (LPG-14). Bu yöntem ile DDM saflaştınlabilir Protein fonksiyonel deneylerde ATPaz aktivitesi gösterir. LPG-14 arıtılmış, Protein verim ve yüksek saflıkta, post-translasyonel modifikasyonlar incelemek için kullanılabilir gösterir ve bu, küçük açı X-ışını dağılımı ve elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemleri için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha düşük ATPaz aktivitesi gösterir.
Kistik fibrozis (CF) 2,500 canlı doğumda yaklaşık 1 insidansı ile Avrupa ve Kuzey Amerika'da en sık görülen genetik bir hastalıktır. CF oluştuğunda, kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü (CFTR) epitel hücrelerinin 1 plazma membranında işlevi protein kaybı nedeni mutasyonlar. Bu kusurun en ciddi sonucudur yaşı 2,3 <40 yıl hastalarının ömrü kısaltır dönüşümsüz akciğer hasarı vardır.
CFTR bir iyon kanal 1,4 haline dönüşmüştür bir ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcı olduğunu. Hücrelerin plazma membranında onun oldukça değişmiş fonksiyonu olmasına rağmen, yine de, diğer ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği korur. İlgi çekici, CFTR (yani düzenleyici bölge ve N-ve C-termini) 'nin özel bir parça, diğer metazoan ABC taşıyıcıları ile anlamlı bir sekans benzerliği paylaşan, dolayısıyla inci hiçbir ipucu vardırCFTR bu dizilerin e kökeni. Birincil yapısının temelinde, CFTR ABC transportör ailesinin bir C-aile üyesi olarak sınıflandırılır, ancak bu alt-aile için artık fonksiyonel bir bağlantı için güçlü bir kanıt yoktur. Diğer raporlar azalmış glutatyon ziyade gösteren daha, CFTR ATPaz aktivitesini inhibe olabileceğini düşündürmektedir rağmen, diğer C-aile üyelerinin 8,9 rolleri ile tutarlı olurdu, CFTR 5-7 için glutatyon taşımacılık faaliyetlerinin bazı raporlar olmuştur ABC nakliyecilere 10 karakterize tabaka kaynaklı uyarım. Iyon iletkenliği ölçümü bir CFTR moleküllerin kanal aktivitesi 1 incelenecek kanal özellikleri ve CFTR zamanın bir fonksiyonu, sıcaklık, ATP konsantrasyonu, membran potansiyeli ve fosforilasyon durumu yanı sıra olarak takip edilmiştir izin vermek için yeterince hassastır , küçük molekül inhibitörleri, kuvvetlendirici ve modifiye bir ana varlığı. Bunlarçalışmalar da ABC taşıyıcıları nasıl işlediğini bizim bilgilerimize önemli ekledik. Bununla birlikte, önemli miktarda ve daha sonra saflaştırma CFTR ekspresyonu özellikle zor ve başarı birkaç 10-13 laboratuarlar ile sınırlı olmuştur olduğu kanıtlanmıştır.
Daha etkili ilaçların geliştirilmesi için ihtiyaç presleme, henüz bu işlem küçük moleküllerin taranması için arıtılmış, CFTR eksikliği tarafından engellenmiştir. CFTR ifade ve arıtma sorununun çözülmesi CF birincil kusur düzeltme amaçlı yüksek verimli ilaç tarama sağlayacak ve aynı zamanda rasyonel ilaç tasarımı konusunda yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar için bir yol açacaktır. Ayrıca, bu tür fonksiyonel oligomerik durum olarak protein, etkileşen protein ve ATPaz aktivitesi bile nispeten temel biyokimyasal özellikleri zayıf bir şekilde karakterize kalır. Daha önce GFP-ve His-etiketli murin CFTR büyük ölçekli ifadesi için bir protokol bildirmiştirS. cerevisiae 14 ve şimdi daha CFTR saflaştırılması için protokolleri açıklanmıştır. Biz örnek olarak tavuk CFTR saflaştırılması için beş CFTR orthologues ve mevcut veri arındırmak için bu yöntemleri kullandık. Çözünme ve arıtma için deterjan seçimi herhangi bir zar proteininin arıtılmasında önemli bir adımdır. Birkaç deterjan CFTR çözünürlüğüne için taranmıştır, biz saflaştırılmasında kullanılmak için iki zıt deterjanlar seçtik. Dodesil-β-D-maltozit (DDM) yaygın zar proteinlerinin 15-21 hem yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için kullanılan bir iyonik olmayan deterjandır. Iyonik deterjan 1-tetradekanoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rac-gliserol) (LPG-14), CFTR çözünme son derece etkili olduğunu ve daha önce fonksiyonel membran proteinlerinin 10'un saflaştırılması kullanılmıştır S arasından CFTR saflaştırılması dahil olmak üzere, 22,23, cerevisiae 24. </ P>
Daha önce sıçangil CFTR 14'ün aşırı ifadesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yayınlanmasından bu yana, aynı sistemi kullanarak CFTR birkaç farklı ortologlarını ifade ve saflaştırılmış var. DDM arıtma farklı ortologlar karşısında daha fazla varyasyon (veriler gösterilmemiştir) gösterdi iken, test edilen tüm ortologlar kadar, LPG deterjan iyi arıtılmış. Bu esneklik, maya yaklaşımın gücünü gösterir: belirli bir amaç için bir seçmek için göreli bir hızla çok yapıları taranması mümkündür.
1 M NaCl önce temiz bir mikrozom preparatında DDM sonuçlar, çözünürleştirme ve daha sonraki aşamada kirletici azaltır ihtiva eden tampon ile maya mikrozomları yıkama. Nihai CFTR örnek mikrozom yıkaması olmaksızın>% 90 saf olduğu için bu adım, LPG protokolünde gereksizdir. Ayrıca, DDM saflaştırma çözündürme a için tamponlar için çeşitli değişiklikler gerektirirnd saflaştırılması, gliserol ve ilave tuzu yani eklenmesi. Hep birlikte, bu ilave önemli kolona DDM-çözündürülmüş proteinin bağlanma artmıştır.
DDM saflaştırma metodolojisi iyileştirilmesi için, özellikle de kütle spektrometresi ile karar, bir 40 kDa ana kirleticinin kaldırılması, nikel reçinesi için doğal bir afiniteye sahip görünen maya ribozomal alt birimine L3, kaynaklanmaktadır bir kapsama sahiptir. Orada L3 protein içinde belirgin bir polyHis sekansıdır, ancak ribozom bağlandığmda da 3 boyutlu yapısının incelenmesi (PDB = 1FFK) katlanmış alt birim L3 potansiyel polyHis küme sahip olduğunu göstermektedir. Bu bant LPG-saflaştırılmış malzeme daha az sorunlu olduğu sert LPG deterjan nedeniyle olabilir.
DDM yılında arıtma LPG daha fakir gibi görünüyor olsa da, bu tür DDM gibi hafif deterjanlar fonksiyonel ve yapısal analizler ile daha uyumlu olabilir ve zaten birkaç X-ışını crystall kullanılmıştırMembran proteinlerinin 15-21 arasında ographic çalışmaları. Ayrıca, sonuçlar LPG kullanımı DDM in saflaştırmaya CFTR nispetle ATPase fonksiyon kaybına yol açtığını göstermiştir. Bu nedenle bu tür post-translasyonel modifikasyonlar karakterizasyonunda gibi uygulamalarda örneğin, ya da antikorların üretilmesine de, LPG tabanlı bir protokol seçilecektir, saflık önemlidir CFTR üretilmesi için LPG-bazlı saflaştırma protokolü tavsiye . Proteinin aktivitesi, ve tam olarak yerel durum gerekli olduğu uygulamalarda Öte yandan, daha iyi bir seçenek olarak DDM tabanlı bir protokol önerecek olacaktır.
Sonuç olarak, bu protokol zitteriyonik deterjan LPG-14 ya da non-iyonik deterjan DDM CFTR izolasyonu için tekrarlanabilir bir yöntem tarif eder. Gibi daha önce 10-13 bildirilmiştir daha CFTR için arıtma koşullarının daha geniş bir yelpazede gösterir. Ilave miligram arıtılmış CFTR miktarları olabilirBöyle bir 20 L'lik fermente edici ve bir 6 L düşük hızlı santrifüj rotoru olarak yüksek kapasiteli bir hücre toplama sistemi olarak, bir yüksek hacimli maya büyüme sistemi ile bir araya getirildiğinde, bu prosedürler kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen CFTR çeşitli biyokimyasal ve biyofiziksel tahlillerinde protein kolayca izlenmesini sağlayan bir bölünebilir GFP etiketi vardır.
Bu makalede (tavuk CFTR ihtiva eden plasmid veya dondurulmuş maya hücreleri) de tarif edilen reaktif Kistik Fibroz Vakfı (USA) ile elde edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma onun KFTR 3D-Yapı Konsorsiyumu aracılığıyla ABD Kistik Fibrozis Vakfı (CFF) tarafından finanse edildi. TR İngiltere'de BBSRC öğrencilikle tarafından İngiltere CF Güven öğrencilik ve NC tarafından finanse edildi. Biz onların yardım ve tavsiye için ve kodon-optimize edilmiş tavuk KFTR dizisi ve arıtma etiketleri tasarımı için CFF CFTR 3D yapısı konsorsiyum meslektaşlarımızı kabul.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number |
0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 |
100 kDa MWCO centrifugal concentrator (PES membrane) | Vivaspin | VS0641 |
2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 |
40Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 |
Adenosine triphosphate disodium salt (Na2ATP) | Sigma-Aldrich | A26209 |
Liquid chromatography system | GE Healthcare | 28-4062-64 |
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 |
Glass bead-beating cell disrupter | BioSpec | 1107900 |
Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5417R |
Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 |
Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 |
Hydrophobic Beads SM-2 Adsorbent | BioRad | 152-3920 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 |
Gel imaging system | BioRad | 170-808 |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 |
E.coli total lipid extract | Avanti lipids | 100500 |
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 |
Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 |
Glycerol | Fisher | 65017 |
HisTrap HP columns (5 ml) | GE Healthcare | 17-5247-05 |
Rapid Coomassie Stain | Novexin | ISB1L |
Centrifuge JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 |
Leupeptin | Merck | 108975 |
Lyso-phosphatidyl glycerol-14 (LPG) | Avanti lipids | 858120 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 |
Gel tank SDS-PAGE system | BioRad | 165-8006 |
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310S |
NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 |
Prestained protein standards | Fermentas | SM1811 |
Desalting columns (Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-0851-01 |
Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 |
Sch28080 | Sigma-Aldrich | S4443 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L37771 |
Sodium thiocyanate (NaSCN) | Sigma-Aldrich | 251410 |
Gel filtration 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
Tris-base | Formedium | TRIS01 |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 |
Vortex mixer | Star Labs | N2400-0001 |
Ultrasonic water bath | Ultrawave | F0002202 |
Multimode plate reader | BioTek | BTH1MF |