Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

الملقط المغناطيسي لقياس تطور وعزم الدوران

doi: 10.3791/51503 Published: May 19, 2014

Summary

ملاقط المغناطيسي، واحدة جزيء تقنية التلاعب قوية، يمكن تكييفها لقياسات مباشرة للتطور (باستخدام التكوين يسمى بحرية تدور-ملاقط المغناطيسي) وعزم الدوران (باستخدام التكوين يطلق ملاقط عزم الدوران المغناطيسي) في الجزيئات البيولوجية. وترد المبادئ التوجيهية لتنفيذ هذه القياسات، بما في ذلك تطبيقات لدراسة الحمض النووي وما يرتبط بها من خيوط نكليوتيد البروتين.

Abstract

تقنيات جزيء واحد تجعل من الممكن للتحقيق في سلوك الجزيئات البيولوجية الفردية في حل في الوقت الحقيقي. وتشمل هذه التقنيات ما يسمى النهج قوة التحليل الطيفي مثل القوة الذرية المجهري، ملاقط بصرية، وتدفق وتمتد، وملاقط المغناطيسي. بين هذين النهجين، ملاقط المغناطيسي تميزوا من خلال قدرتها على تطبيق عزم الدوران مع الحفاظ على قوة تمتد ثابتة. هنا، ويتضح ذلك كيف يمكن لهذه ملاقط المغناطيسي التكوين التجريبية "التقليدية" يمكن، من خلال التعديل مباشرة من تكوين مجالها لتقليل حجم الحقل عرضية، أن تتكيف مع قياس درجة تطور في جزيء البيولوجية. ويطلق على تكوين الناتج ملاقط المغناطيسية التي تدور بحرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يظهر كيف مزيد من التعديل من التكوين الحقل يمكن أن تسفر عن حقل عرضية بلغت قوته وسيطة بين أن من & #8220؛ "ملاقط المغناطيسية التقليدية وملاقط المغناطيسية التي تدور بحرية، مما يجعل من الممكن لقياس عزم الدوران مباشرة المخزنة في جزيء البيولوجية. ويطلق على هذا التكوين ملاقط عزم الدوران المغناطيسي. ويوضح شريط الفيديو المرافق بالتفصيل كيفية تحويل ملاقط المغناطيسية التقليدية إلى تدور بحرية ملاقط ملاقط المغناطيسية وعزم الدوران المغناطيسي يمكن أن يتحقق، ويوضح استخدام هذه التقنيات. هذه التكيفات الحفاظ على جميع نقاط القوة في ملاقط المغناطيسية التقليدية بينما توسع كثيرا من براعة هذا أداة قوية.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أثبتت تقنيات احدة جزيء تطبيق على نطاق واسع في دراسة البروتينات والإنزيمات processive السيارات الأخرى، مما أسفر عن نظرة ثاقبة حركية بهم وmechanochemistry الأساسية. في سياق قوة التحليل الطيفي، وقد قدمت مساهمات هامة من خلال القوة الذرية تدفق المجهري وتمتد، وملاقط بصرية والمغناطيسية. ملاقط بصرية والمغناطيسية (MT) قد نجحت لا سيما في الجمع بين مرونة كبيرة من حيث التلاعب الجزيئية مع مكانية عالية والقرار الزماني. هنا، ونحن نركز على MT، والتي يمكن أن تنطبق على كل القوى تمتد وعزم الدوران إلى الجزيئات البيولوجية المربوطة بين سطح والخرز مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic 1-3.

ملاقط المغناطيسية (MT، الشكل 1A) هي تقنية متعددة جدا جزيء واحد التي تم استخدامها لرصد كل من الخواص الميكانيكية من الأحماض النووية وكذلك تفاعلها مع البروتينات. MT دينا العديد من القوةق، بما في ذلك البساطة والمتانة الشاملة لتنفيذ التجريبية، وتطبيق السهل من عزم الدوران، وعملية طبيعية والمعايرة واضحة في وضع قوة ثابتة والإرشاد موازية قياسات 5، 6، وغياب التدفئة العينة وphotodamage. بالمقارنة مع غيرها من جزيء واحد النهج، MT توفر طريقة لإجراء قياسات قوة الاعتماد على قوات منخفضة تصل إلى 10 ≈ FN ولها القدرة على التحكم بشكل مباشر درجة الفائق. بينما في الغالب استخدمت النظام التجاري المتعدد الأطراف كأداة تجريبية للتحقيق في العمليات البيولوجية التي تنطوي على الأحماض النووية 7، 8، أنهم وجدوا أيضا تطبيق في الدراسات من الخواص الميكانيكية للبروتينات 9-13 خلايا أو 10، 14-17. تتوفر العديد من المراجع المفيدة التي تصف كيفية بناء وتشغيل MT 4، 18-20.

Howevإيه، MT التقليدية لا تتبع الحركة الدورانية مباشرة، و، في حين أنها تطبيق عزم الدوران، وأنها لا تقيس عزم الدوران مباشرة. بالإضافة إلى أنها تحد من دوران حر من حبل الحمض النووي. هنا، نقدم اثنين من ملاقط ملحقات المغناطيس. أول، ووصف تدور بحرية ملاقط المغناطيسي (FOMT، الشكل 1B) 21، بما يسمح للقياسات التوازن تقلبات زاوية والتغيرات في تطور من المربوطة جزيئات الحمض النووي، من دون تقييد الحركة الدورانية حول محور حبل. الثانية، ووصف ملاقط عزم الدوران المغناطيسي (الإنتقالي العسكري، الشكل 1C)، والتي لديها القدرة على تطبيق ومباشرة قياس كل القوى والعزم على الجزيئات الحيوية واحدة 22-27.

في بروتوكول التالية، ونحن نفترض أن القارئ لديه في له / لها التصرف على 'التقليدية' الصك طن متري. نشير للقارئ إلى مناقشة لمراجع حول كيفية بناء وتشغيل MT إعداد، وكذلك consideالحصص التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار في اختيار حبات مغناطيسية، مغناطيس، وإجراءات تتبع. بالإضافة إلى ذلك، المادتين 1 و 2 من نص البروتوكول تصف كيف نستعد عادة واحتضان عينة الحمض النووي للاستخدام في MT وكذلك القياسات الأولية التي يمكن القيام بها على الحمض النووي واحد في MT التقليدية. البابين 3 و 4 من نص البروتوكول توضيح كيفية أداة MT يمكن تكييفها بسهولة واستخدامها لقياس FOMT وMTT.

Protocol

1. إعداد والحضانة من عينة الحمض النووي

  1. إعداد بنيات الحمض النووي التي لو تربط النهايات المزدوجة (عادة توظف 600 ≈ شظايا غليان الحمض النووي PCR) التي بين functionalized مع البيوتين وdigoxigenin مجموعات متعددة، على التوالي 18. للبدء، وطول حبل الحمض النووي> 1 ميكرون، على سبيل المثال، وهو 7.9 KBP المقابلة لطول امتدت من 2.7 ميكرومتر ~ كما يعملون هنا، فمن المستحسن لسهولة الاستخدام؛ على وجه الخصوص، وذلك باستخدام الحمض النووي طول مشابه لأو أقصر من نصف قطر حبة إشكالية نظرا لهندسة المرفق في MTT وFOMT. انظر مناقشة للحصول على وصف لكيفية طول الحمض النووي يؤثر الاستجابة الزمنية في المجال الزاوي.
  2. تجميع تدفق الخلايا لإجراء التجارب جزيء واحد. لتدفق الخلايا، استخدام اثنين المجهر الزجاج coverslips مفصولة طبقة مزدوجة Parafilm الفاصل. وينبغي أن يكون أعلى ساترة المجهر اثنين من الثقوب لالسائل في وسائل إلى الخلية. أنها مريحة لاستخدام المنظف لحفر الثقوب. وهي مغلفة ساترة القاع مع النيتروسليلوز (0.1٪ وزن / المجلد في خلات الأميل). وضع الفواصل Parafilm على الجانب المغلفة النيتروسليلوز الشرائح أسفل وإغلاق أعلى مع كبار الشرائح نظيفة.
  3. ختم تدفق الخلايا. باستخدام الملقط المادية، ووضع خلية تدفق تجميعها على لوحة سخان تعيين إلى 80-100 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ~. الانتباه إلى أن خلية تدفق وختم جيدا، أن Parafilm لا تغلق الثقوب التي تتصل في ومخرج، والتي تتماشى الشرائح الزجاجية جيدا.
    ملاحظة: لضمان ختم جيدة، فمن المستحسن أن السكتة الدماغية فقاعات خارج في Parafilm باستخدام مسحة القطن الكبيرة. ويمكن بعد ذلك خلية تدفق تركيبها على الصك ملاقط المغناطيسي.
  4. إعداد المخازن المؤقتة. إعداد TE الربط العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم). بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام عازلة برنامج تلفزيوني (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4) تستكمل ثإيث 100 ميكروغرام / مل BSA، 0.1٪ توين و 5 ملي أزيد الصوديوم (PBS +) كما عازلة الربط. تدفق كميات الخلية 2-3 العازلة TE الربط في الخلية التدفق.
  5. احتضان 0.5 أو 1.5 ميكرون دائرة نصف قطرها الخرز اللاتكس غير المغناطيسية في الخلية التدفق ل~ 30 دقيقة. وهذه حبات الخرز بمثابة إشارة أثناء ملاقط المغناطيسي القياسات التي تسمح لأحد لتقليل تأثير الانجراف بين الهدف وصاحب العينة (أي خلية تدفق). طرد الخرز غير المغناطيسية غير مرتبط قبل الشطف 2-3 مع أحجام الخلية من TE العازلة الربط.
  6. Functionalize السطح السفلي للخلية تدفق قبل الحضانة مع 100 ميكروغرام / مل مكافحة digoxigenin في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على الأقل (ويفضل أطول، ويمكن أن يتم بين عشية وضحاها من الحضانة)، لتوفير مرفق الحمض النووي. شطف مع 2-3 كميات خلية من TE العازلة الربط. أخيرا احتضان الخلية التدفق مع 2 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) في TE العازلة الربط لمدة 30 دقيقة لالتخميل السطح.
  7. اتخاذ قسامة من2 مل حبات streptavidin المغلفة MyOne مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic (انظر مناقشة وجدول المواد) وتمييع مع 10 مل العازلة TE الربط. يغسل مرتين مع 10 مل العازلة TE الربط باستخدام مكثف الجسيمات المغناطيسية، وresuspend في 10 مل العازلة TE الربط. نعلق ~ 1 مل من جزيئات الحمض النووي (ما يقرب من 1 نانوغرام) لهذه الخرز التي الحضانة في TE العازلة الربط لمدة 30 دقيقة.
  8. تمييع الحل من الخرز الحمض النووي المربوطة مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic عشرة أضعاف وذلك بإضافة 90 مل العازلة TE الربط. أخيرا، وضخ الحل في الخلية التدفق واحتضان لمدة 1 ساعة ~ للسماح لمرفق الحمض النووي إلى السطح المطلي مكافحة digoxigenin. غسل خلية تدفق تماما مع TE العازلة الربط. بعد الحضانة للبنيات الحمض النووي حبل، تدفق على نطاق واسع مع العازلة التجريبية (هذا يمكن أن يكون TE العازلة الربط) لإزالة جميع حبات غير المرفقة.
  9. للقياسات التي تستخدم بروتوكول تتبع الزاوي الذي يتطلب الخرز علامة إيمانية تعلق على حبات مغناطيسية

2. القياسات على الحمض النووي جزيء واحد في الملقط المغناطيسي التقليدية

  1. باستخدام MT التقليدية (انظر مناقشة) مع تكوين الحقل المناسب (الشكل 1A) وكلا متعدية ومراقبة دوران موقف المغناطيس، بحث عن جزيئات الحمض النووي مقيدة بالتناوب في الخلية التدفق. في سحب القوات من ≥ 1 السندات الإذنية (استشارة المراجع 4، 19، 20، 28، 29 بشأن قوة المعايرة في ملاقط المغناطيسي)، والخرز المربوطة يمكن بسهولة تمييزها عن حبات عالقة على سطح الشريحة السفلي بواسطة ارتفاعها مختلفة في التركيز . ما إذا كان يتم تقييد جزيء الحمض النووي بالتناوب يمكن تقييمها من خلال إدخال 20-30 بدورهق من المغناطيس في قوة ≈ 0.25 السندات الإذنية: هنا، يجب تقليل طول حبل بواسطة 0.4-0.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: لتشغيل ملاقط المغناطيسي التجارب، ويستخدم لمعالجة الصور لتحديد س، ص، ض والموقف من الخرز الحمض النووي المربوطة. ابفيف البرمجيات المخصصة لهذا الغرض هو متاح من المؤلفين بناء على طلبها.
    1. تحقق من أن يتم إرفاق حبة بواسطة حبل الحمض النووي واحد. ويمكن أن يتم هذا من خلال مقارنة السلوك تحت المنعطفات الإيجابية والسلبية في قوى> 1 السندات الإذنية (الشكل 2A). في هذا النظام بالقوة، فإن وجود الحبال الحمض النووي متعددة تؤدي إلى انخفاض متماثل تقريبا في ملحق عند إدخال المنعطفات الإيجابية والسلبية، في حين الحبال الحمض النووي واحد سوف تؤدي إلى رد فعل غير متماثل.
  2. البحث عن حبات الثابتة المناسبة تمسك السطح السفلي في المنطقة المجاورة للحبل من الفائدة التي يمكن أن تكون بمثابة مرجع الخرز.
  3. معايرة طول رانه الحمض النووي، ل. موقف سطح flowcell يمكن تحديده من خلال جلب حبة المربوطة في اتصال مع السطح (على سبيل المثال، عن طريق تدوير المغناطيس التي كتبها ~ 60 المنعطفات في قوة أدناه 0.2 السندات الإذنية). قياسات موقف حبة المربوطة الرأسي فيما يتعلق هذا السطح ثم يقدم تقريرا عن القيمة المطلقة ل.
    ملاحظة: لتقليل الآثار اللاحقة من الانجراف، وينصح لأداء قياسات لتر بالنسبة للموقف من حبة المرجعية الملصقة على السطح.
  4. تسجيل منحنى التناوب (أي قياس تمديد الحمض النووي بوصفها وظيفة من عدد من الأدوار) في قوة تمتد من السندات الإذنية ≈ 0.25 (الشكل 2A).
    1. تحديد عدد اللفات التي التمديد هو الحد الأقصى، وهذا يتوافق مع الدولة التي جزيء الحمض النووي هو استرخاء إلتوائي. للقيام بذلك، فإنه من المفيد لتناسب منحنى دوران محليا مع مكافئ أو دالة جاوس لتحديد مركز positiعلى. تحدد هذه النقطة بأنها "صفر المنعطفات".
      ملاحظة: روتين مكتوبة مخصصة لهذا الغرض هو متاح من المؤلفين بناء على طلبها.
  5. لسلسلة من المواقف ~ 20 المغناطيس، تحديد متوسط ​​تمديد جزيء إلتوائي-استرخاء (أي في "الصفر يتحول"، راجع الخطوة 2.4.1) من ض التتبع.
  6. لكل نقطة قياس في الخطوة 2.5، تحدد بدقة قوة تمتد من التقلبات في س أو ص موقف 20، 28، 29، أو، قدم مغنطة حبة هو معروف، وذلك باستخدام المعرفة من التدرج الميدانية المحلية 4. التآمر القوة تمتد مقابل متوسط ​​نتائج التمديد في منحنى قوة التمديد (الشكل 2B).
    1. تناسب البيانات الناتجة قوة التمديد للمعادلة سلسلة مثل دودة باستخدام تقريب متعدد الحدود من قبل Bouchiat وآخرون 30.
    إذا تستعد لقياسات FOMT اللاحقة، وتناوب ببطء المغناطيس في حين تم تسجيل الرحلات حبة المغناطيسي في (س، ص).
    ملاحظة: أصغر نصف قطر الحلقة مما أدى إلى تكوين MT التقليدية، وأكثر ارتباطا وثيقا والمربوطة جزيء الحمض النووي أقرب إلى "القطب الجنوبي" من حبة المغناطيسي. عند واحد تتحول إلى تكوين FOMT، سيتم المربوطة مثل جزيء الحمض النووي ارتباطا وثيقا "خط الاستواء" حبة المغناطيسي، والذي يتيح تتبع موثوقة من زاوية دوران من (س، ص) موقف (انظر مناقشة).

3. قياسات تويست الحمض النووي باستخدام الملقط المغناطيسي تدور بحرية

  1. يدويا استبدال المغناطيس مربع من ملاقط المغناطيسي التقليدية من خلال مغناطيس اسطواني يستخدم للFOMT (الشكل 1B). يجب أن يتم تنفيذ هذه العملية في مثل هذه الطريقة أن حبل DNA المحدد لا يزال داخل مجال الرؤية. وهذا يمكن أن يتحقق في أقل من 1 دقيقة ببساطة عن طريق فك رأس المغناطيس الكامل الذي يحمل المغناطيس لتكوين ملاقط التقليدية والاستعاضة عنها رئيس المغناطيس الذي يحمل مغناطيس اسطواني لFOMT.
  • الرحلات في (س، ص) من حبة المغناطيسي المربوطة من قبل dsDNA وحبل واحد تعتمد بشدة على موقف حبل فيما يتعلق محور المغناطيس أسطواني (الشكل 1B، 3A الشكل). تسجيل (س، ص) الرحلات من أجل تحديد موقع المقابلة ضمن نمط التذبذب سمة (الشكل 3A، المناقشة).
  • أداء المحاذاة الخشنة من المغناطيس في FOMT. ويمكن تحقيق هذا عن طريق تحريك مغناطيس اسطواني فوق خلية تدفق باستخدام (س، ص) مراحل الترجمة. إذا كان (س، ص) متابعة الرحلات قوس، لا يتم محاذاة مغناطيس اسطواني بشكل صحيح ويحتاج إلى نقلفي الاتجاه المناسب (الشكل 3B).
    1. ويمكن تحقيق المواءمة الخشنة في غضون 15 دقيقة لحالة من الخرز MyOne مع 7.9 KBP الحبال، واكتمال عند قياس (س، ص) الرحلات النتائج في مراقبة حركة دائرية (الشكل 3B، وسط).
      ملاحظة: المحاذاة الخشنة كافية عادة لمراقبة التغيرات في تطور سببها البروتين ملزمة لسلطات الوطنية المعينة واحد المربوطة في تكوين FOMT 21، 31 (ممثل النتائج، الشكل 5)، على الرغم من حقيقة أن يرافق الرسم البياني ثنائية الأبعاد قد لا يكون لها التهم وزعت بشكل موحد على الاطلاق على طول حلقة دائرية (الشكل 3C).
  • إذا لزم الأمر لإجراء المزيد من التجارب، وأداء غرامة المحاذاة في FOMT. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام مسامير ميكرومتر عالية الدقة أو مرحلة الآلي عالية الدقة إما تحريك المغناطيس أو الخلية التدفق إلى المائةإيه المغناطيس أسطواني على حبة إلى داخل ~ 10 ميكرون. في المرحلة محاذاة غرامة، يتم وضع مغناطيس بعناية بحيث التقلبات على بالطوق دائرة موحدة تقريبا، الموافق الحالة التي يكون فيها حاجز الطاقة لدورة كاملة بسبب المغناطيس هو ك ب T (الشكل 4).
    ملاحظة: وهناك سيناريو MATLAB بتهمة التآمر التقلبات في رسم بياني أو مخطط حراري كما في الشكل (4) يتوفر من الكتاب عند الطلب.
    ملاحظة: يمكن تحقيق المواءمة الجميلة في غضون 45 دقيقة لحالة من الخرز MyOne مع 7.9 KBP الحبال، وانخفاض في الأطر الزمنية لحبات أصغر وأقصر الحبال يعملون (انظر مناقشة).
    ملاحظة: مطلوب عادة المحاذاة الجميلة لأداء قياسات صلابة التوائية من الحمض النووي العارية أو المغلفة البروتين (ممثل النتائج، الشكل 4).
  • إذا لزم الأمر للتحليل، معايرة القوة في FOMT. هذا يمكن أن يتم طغ بطريقة مماثلة لMT، وذلك باستخدام إما تقلبات شعاعي حبة في <r 2> (حيث تدل الأقواس الزاوية متوسط ​​الوقت) كما هو موضح في الفيديو المرافق ومفصلة في Lipfert وآخرون 21، أو، قدم مغنطة حبة شيء على ما يرام المعروفة، وذلك باستخدام المعرفة من التدرج الميدانية المحلية 21.
  • 4. قياسات العزم الحمض النووي باستخدام الملقط العزم المغناطيسي

    1. استبدال المغناطيس الاسطوانية التي تستخدم لFOMT بواسطة مغناطيس اسطواني بالإضافة إلى الجانب (دائمة) المغناطيس لالإنتقالي العسكري (الشكل 1C) يدويا. يجب أن يتم تنفيذ هذه العملية في مثل هذه الطريقة أن حبل DNA المحدد لا يزال داخل مجال الرؤية.
      1. الطريق الأكثر مباشرة لتحقيق ذلك هو لإضافة المغناطيس الجانب في موقعه الصحيح، الذي يمكن إنجازه في حدود 1 دقيقة يدويا. لا مزيد من إعادة ضروري.
        ملاحظة: بديل لمغناطيس الجانب هو استخداممن المغناطيسات الكهربائية 32.
    2. إذا لزم الأمر للتحليل، معايرة القوة بطريقة مماثلة لMT، وذلك باستخدام إما س حبة أو تقلبات أو ذ، قدمت مغنطة حبة هو معروف، وذلك باستخدام المعرفة من التدرج الميدانية المحلية 21.
    3. تتبع تقلبات الزاوي بوصفها وظيفة من الوقت θ (ر) باستخدام إما إيمانية مقرها تتبع البروتوكول 23 أو، كما هو موضح في الفيديو المصاحبة، وبروتوكول تتبع الزاوي على أساس رصد (س، ص) موقف (انظر مناقشة). في الحالة الأولى، تسجيل الصور الكاملة لحبة بوصفها وظيفة من الوقت لمعالجة الصور اللاحقة. في الحالة الأخيرة، فإنه يكفي لتسجيل (س، ص) تقلبات حبة لفي هذه الخطوة.
      ملاحظة: وهناك سيناريو MATLAB لتحديد θ (ر) من الصور الكامل لحبة بوصفها وظيفة من الوقت في إيمانية تعتمد على بروتوكول تتبع هوتوفرة من المؤلفين بناء على طلبها.
      1. كما هو موضح في مناقشة، لبروتوكول تتبع الزاوي على أساس رصد (س، ص) الموقف كما أنه من المستحسن أن يسجل تتبع الوقت حيث المغناطيس ببطء (عادة عند 0.1 هرتز) استدارة من قبل العديد من المنعطفات. وهذا سوف يسمح احد لتحويل بدقة الإحداثيات الديكارتية (س، ص) في الإحداثيات القطبية (ص، θ) باستخدام المعادلات 3-5 من مناقشة.
        ملاحظة: وهناك سيناريو MATLAB لتتبع النصي الزاوي على أساس رصد (س، ص) موقف يتوفر من الكتاب عند الطلب.
        ملاحظة: الساعة القياس يعتمد في الغالب على القرار عزم الدوران المطلوب. ويرد حجة مفصلة في Lipfert وآخرون 24. لحبات MyOne و 8 الحبال الحمض النووي KBP، وقياس ل30-100 ثانية ينبغي أن تكون كافية لإعطاء القرار عزم الدوران في حدود 1 ~ · السندات الإذنية نانومتر.
    4. تحديد صلابة التوائية من فخ من اله تباين تقلبات الزاوي θ بالراديان) باستخدام:
      ك θ = ك ب ر / σ θ 2 (1)
      ملاحظة: نموذجي فخ التناوب التصلب التي تحققت في MTT هي في حدود 10-1،000 السندات الإذنية · نانومتر / راد، أي أقل من لملاقط المغناطيسية التقليدية.
    5. بالإضافة إلى ذلك، تسجل ض موقف حبة واستخدام هذا لتحديد طول الحبل ل (انظر أيضا الخطوات من 2،4-2،7).
    6. تناوب N يتحول مرة أخرى وتسجيل θ (ر) ولتر (ر).
      ملاحظة: تخفيض فخ صلابة دوران MTT مقارنة MT يجعلها مناسبة لقياس عزم الدوران جزيء واحد، ولكن يعني أن الحد الأقصى لعزم الدوران التي يمكن أن تمارس يتم تخفيض. هذا يعني أن الإنتقالي العسكري قد لا تكون قادرة على موازنة عزم الدوران السحب العالية الناجمة عن دوران سريع. لذا يجب الحرص على عدم تجاوز الحد الأقصى للسرعة؛ رتدوير ypically بمعدلات قريبة من 0.1 هرتز.
    7. تحديد عزم الدوران المتراكمة في حبل الحمض النووي بعد باستخدام يتحول N:
      Γ = - ك θN - θ 0> (2)
      حيث <...> يدل على المتوسط ​​وθ θ 0 و N هي الزاوية صفر يتحول (الموافق حبل استرخاء إلتوائي، انظر الخطوة 2.3 و N يتحول، على التوالي.
    8. كرر الخطوات من 4.5 و 4.6 عند الضرورة من أجل تحديد عزم الدوران بشكل كامل استجابة جزيء في شوط واحد قياس (ممثل النتائج، الشكل 6).

    Representative Results

    وتظهر نتائج ممثلة من MT (الشكل 1A) في الشكل 2. يظهر الشكل 2A منحنيات دوران التمديد لDNA 7.9 كيلو بايت التي اتخذت في F = 0.25، 0.5، و 2.0 السندات الإذنية. وينبغي متماثل استجابة الحمض النووي واحد للتناوب على أدنى قوات (0.25 PN)، مع تمديد خفض الحمض النووي نتيجة لتشكيل سوبركويل الخيوط الصبغية الملتفة إيجابية أو سلبية. المعرفة النوعية لهذا الرد هو مفيد عند البحث في البداية لحبل الحمض النووي مقيدة بالتناوب (الخطوة 2.1). نلاحظ أن تفتيش إضافية من حبل مطلوب للتحقق من أنه يتكون من جزيء الحمض النووي واحد: هنا، واستجابة غير متكافئة من الحمض النووي واحد للتناوب في القوات تتجاوز 0.5 السندات الإذنية يساعد على تمييزه عن السلطات الوطنية المعينة متعددة (الخطوة 2.1.1). مرة واحدة وقد تم التحقق من هذا، واحد يعود إلى استجابة التناوب عند 0.25 السندات الإذنية من أجل تحديد العدد الدقيق للمغناطيس يتحول عنده الحمض النووي واحد طق استرخاء إلتوائي، حيث واحد يأخذ منحنى القوة والإرشاد، والتي يجب أن يشبه الشكل 2 ب. لهذا القياس على وجه الخصوص، نوبة من البيانات إلى نموذج سلسلة مثل دودة (خط الصلبة) أسفرت عن المجهزة كفاف طول L C = 2.71 ميكرون والانحناء طول استمرار L P = 45 نانومتر. لdsDNA و، ينبغي القيم مزودة من طول استمرار تقع في نطاق 40-55 نانومتر، وهذا يتوقف على الظروف العازلة 33، ويجب أن يكون طول كفاف المجهزة وثيقة (عادة في غضون 10٪) من القيمة المتوقعة لبناء الحمض النووي التي يستخدم في القياسات، وذلك باستخدام الحمض النووي العلاقة L = 0.34 نانومتر / بي بي · عدد أزواج القاعدة.

    ويبين الشكل 3 إجراءات ونتائج المحاذاة في FOMT (الشكل 1B). الأولي (س، ص) الرحلات سجلتها في الخطوة 3.2 يمكن مقارنة إلى العرض العام للتقلبات بوصفها وظيفة سو موقف المغناطيس عرضية هو مبين في الشكل 3A، مما يدل على "الدوامة" النمط التي يمكن استخدامها لتوجيه النزوح النسبي اللاحقة بين المغناطيس وحبة الحمض النووي المربوطة التي عقدت في FOMT. عند محاذاة الخشنة اللاحقة كاملة، وحبة من (س، ص) من التقلبات تتبع مسار دائري، كما هو مبين أيضا تتبع السوداء في الشكل 3B. عند هذه النقطة، يتم تقليل عزم الدوران من مغناطيس حول محور ض لدرجة أن التقلبات الحرارية تكفي لتدوير حبة حول نقطة تمسكه. دائرة نصف قطرها R من الحلقة الدائرية الناتجة (ويرد دائرة تركيبها في الحمراء) يمثل المسافة بين نقطة شعاعي مرفق الحمض النووي ومركز حبة في (الشكل 1B). كما هو مبين في الشكل 3C، ومع ذلك، رسم بياني للبيانات في الشكل 3B يدل على أن محاذاة الخشنة لا يضمن تغطية موحدةجميع المناصب الممكنة على طول حلقة دائرية. على الرغم من التقلبات الحرارية كافية لاستكشاف كل زاوية تناوب على الدائرة، لا يزال هناك حاجز الطاقة الصغيرة (في حدود الحرارية ك الطاقة B T) لدوران حر.

    عندما يتم محاذاة فاينر عليها في FOMT (الخطوة 3.4)، ويمكن استخدام الأداة لتحديد معامل الالتواء من الحمض النووي (الشكل 4). أولا، يتم استخدام المحاذاة غرامة من العينة للحصول على حركة دائرية (الشكل 4A) والتي يجب أن تظهر الآن تغطية موحدة (الشكل 4B) رسم بياني ثنائي الأبعاد. الوقت المقابلة ف التتبع (ر) من التقلبات الزاوي (تم الحصول عليها من تحويل (س، ص) مناصب، انظر أدناه) لا يظهر أي دورية الموافق 360 ˚ (الشكل 4C) ويكشف الرحلات الكبيرة المقابلة لعدة دورات كاملة (الشكل 4D). المشهد ضمنية الطاقةغير متناسق على مجموعة من> 1،000 ˚ (الشكل 4E). الانحراف المعياري للتقلبات غير σ θ = 223 °، الموافق فخ صلابة الزاوي θ = ك ك ب ر / σ θ 2 = 0.27 السندات الإذنية · نانومتر / راد، والذي بدوره يعطي تقديرا للمدة استمرار فعالية التوائية من الحمض النووي يساوي C = L C / σ θ 2 ~ 76 نانومتر (L C = 1،150 نانومتر لDNA 3.4 KBP المستخدمة في هذا القياس) في القوة المقاسة.

    مثال عن كيفية FOMT يمكن استخدامها لقياس التغير في تطور يسببها في جزيء الحمض النووي المربوطة من خلال الربط من البروتينات 31، 34 هو مبين في الشكل 5. هنا، قمنا برصد ملزمة للبروتين RAD51 لمضاعفةالذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي؛ ومن المعروف RAD51 لكلا إطالة والاسترخاء الحمض النووي لأنها تشكل خيوط البروتين النووي 31. على بيغ RAD51 في تدفق الخلايا، نلاحظ أن حبة يخضع لمسار المتصاعد في (5A الشكل) FOMT. عن طريق تحويل أثر لل(س، ص) الحركة بوصفها وظيفة من الوقت لف (ر) كما هو موضح أعلاه، يمكننا المشاركة في مؤامرة مفادها أن RAD51 ديه على طول حبل الحمض النووي ودرجته من الفك (الشكل 5B، ج) .

    نهج بديل لقياس خصائص التوائية من الحمض النووي هي الإنتقالي العسكري (الشكل 1C، الشكل 6). التخطيطي في الشكل 6A يوضح مبدأ القياس: بعد overwinding (أو underwinding) حبل الحمض النووي عن طريق N يتحول، الحمض النووي يمارس عزم على استعادة حبة الذي يؤدي إلى تحول في الموقف من التوازن الزاوي θ θ 0 إلى N. في MTT يتم تقليل عنصر عرضية من المجال المغناطيسي مقارنة MT، مما يسهل قياس هذه التحولات الزاوي في حين لا يزال يسمح حبة دوران (الشكل 1). ضخامة التحول الزاوي قياس بعد تطبيق N = 45 يتحول إلى الحمض النووي 7.9 KBP هو مبين في الشكل 6B. وتظهر التسلسل الكامل للبروتوكول MTT قياس ونتائج الناتجة من عزم الدوران مقابل منحنى دوران للDNA في الشكل 6C-F. هنا، وتظهر قياسات الانحراف المعياري (الشكل 6C) و(6D الشكل) يعني من زاوية تنسيق بوصفها وظيفة من خلال وunderwinding، مع انحراف معياري كونها تتناسب عكسيا مع صلابة فخ الزاوي (المعادلة 1). أخذت معا، هذه الكميات تسمح لأحد لبناء عزم دوران للمنحنى مقابل الحمض النووي (الشكل 6F)، والتي يجب أن تظهر على المنطقة استجابة خطية تتمحور حول يتحول 0الثاني اثنين في الهضاب التي التشبع عزم الدوران، في التناوب الإيجابية والسلبية، على التوالي. مثل هذا عزم الدوران مقابل منحنى دوران تكمل المعلومات في ملحق مقابل منحنى دوران (الشكل 6E)، وبالتالي قياس التحولات التي ترافق التواء وتمسخ من الحمض النووي.

    الشكل 1
    الشكل 1. الخطط من ملاقط المغناطيسية التقليدية (MT)، تدور بحرية ملاقط المغناطيسي (FOMT)، ملاقط عزم الدوران المغناطيسي (الإنتقالي العسكري)، واثنين من الاستراتيجيات لتتبع زاوية دوران. (أ) في جميع تطبيقات ثلاثة من ملاقط المغناطيسي، والمربوطة الخرز المغناطيسي لسطح خلية تدفق الجزيئات التي كتبها بين functionalized، على سبيل المثال، جزيئات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل أظهرت تخطيطي. وتعلق الخرز الإشارة إلى سطح الخلية التدفق ومجنزرة الظريفر التصحيح. جميع MT مجموعة عمليات توظيف ثلاثة مغناطيس لتطبيق قوة تمتد تصاعدية على حبة المغناطيسي، وبالتالي، حبل الحمض النووي. في MT التقليدية، وزوج من المغناطيس يمارس المجال المغناطيسي الذي يكون موجها بشكل مستعرض نسبة إلى محور حبل، يقيد بإحكام دوران حول محور حبة الحمض النووي حبل. في FOMT، يوفر المغناطيس على شكل إسطوانيا-المجال المغناطيسي أن المنحى على طول اتجاه حبل. عندما يتم محاذاة حبل إلى مركز المغناطيس على شكل إسطوانيا، يتم الحد من أي حقول عرضية المتبقية، مما يسمح للدوران حر حول محور حبل في الإنتقالي العسكري، يتم إضافة مغناطيس الجانب إلى المغناطيس إسطوانيا على شكل المستخدمة في FOMT من أجل توفير حقل عرضية صغيرة (انخفاض في الحجم مقارنة مع MT). هذا المجال عرضية صغيرة يمكن تطبيق عزم الدوران وكذلك قياسه. (ب) يتم عرض اثنين من استراتيجيات لقياس زاوية دوران حبة المغناطيسي حول محور الحمض النووي حبل. 1): حبة علامة (الجشعن) تعلق على حبة المغناطيسي (البني) ويعطي صورة غير المتماثلة التي تمكن زاوية تتبع تخيل التحليل. يتم عرض صورتين CCD من حبة المغناطيسي 1.4 ميكرون نصف قطرها مع 0.5 ميكرون دائرة نصف قطرها علامة إيمانية، في التركيز وخارج التركيز. 2): عندما يكون الحمض النووي هو المربوطة إلى حبة المغناطيسي في موضع بعيدا عن القطب الجنوبي حبة، ووسط حبة يتقلب على طول قوس الذي يحدد موقف الزاوي المركز. إما استراتيجية يمكن استخدامها لتتبع زاوية دوران ورصد التحولات في موقف زاوية باعتبارها حبل توترت إلتوائي (آثار على اليمين)، وبالتالي تمكين القياسات من عزم الدوران جزيء واحد.

    الرقم 2
    قياسات الشكل 2. معايرة الحمض النووي في MT التقليدية. (أ) منحنيات دوران تمديد لDNA 7.9 كيلو بايت التي اتخذت في F = 0.25، 0.5، و 2.0 السندات الإذنية. الاستجابة غير المتماثلة تحت التناوب على المنعطفات الإيجابية والسلبية من واحد الحبال الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل يمكن استخدامها كاختبار مريحة المرفق حبل. (ب) منحنى القوة والإرشاد لDNA كيلو بايت 7.9، جنبا إلى جنب مع نوبة إلى دودة مثل نموذج سلسلة (خط الصلبة)، مما أسفر عن المجهزة كفاف طول L C = 2.71 ميكرون والانحناء استمرار طول L P = 45 نانومتر. أجريت جميع القياسات في المخزن برنامج تلفزيوني.

    الرقم 3
    الرقم 3. محاذاة في FOMT. (أ) (س، ص) تقلبات حبة الحمض النووي المربوطة التي عقدت في FOMT بوصفها وظيفة من موقف المغناطيس. تم تفحص موقف المغناطيس أسطواني على ارتفاع مستمر من 3 مم على سطح خلية تدفق في الخطوات من 250 ميكرومتر في العاشر و (س، ص) نمط التذبذب مع موقف المغناطيس تشبه الإعصار أو دوامة واضحة. هذه "الدوامة" نمط يمكن استخدامها لتوجيه تشريد المغناطيس (أو بدلا من حبل مع الحفاظ على مغناطيس ثابت) في x و y (المشار إليها بواسطة الأسهم الكبيرة) لتحقيق المحاذاة. عند محاذاة الخشنة كاملة، وحبة من (س، ص) من التقلبات تتبع مسار دائري (تتبع الزرقاء في وسط المؤامرة). تم تسجيل هذا التتبع في تجربة منفصلة بعد محاذاة المغناطيس في خطوات أصغر عن المركز ويظهر التوضيح في هذه المؤامرة. (ب) (س، ص) تقلبات حبة الحمض النووي المربوطة التي عقدت في رانه FOMT بعد نجاح الخشنة الانحياز من المغناطيس (تتبع السوداء). تقلبات الاستلقاء على الحلقة الدائرية والتقلبات الحرارية كافية لاستكشاف كل الزوايا تناوب على الدائرة. ويرد المجهزة دائرة باللون الأحمر. (ج) الرسم البياني الموافق البيانات في (ب)، وتبين أن المحاذاة الخشنة لا يضمن تغطية موحدة لجميع المناصب الممكنة على طول حلقة دائرية. على الرغم من التقلبات الحرارية كافية لاستكشاف كل زاوية تناوب على الدائرة، لا يزال هناك حاجز الطاقة (على النظام الحراري للطاقة ك ب T) لدوران حر.

    الرقم 4
    الشكل 4. قياس الحمض النووي الصلابة الالتوائية باستخدام FOMT. (س، ص) مسار (أ) والرسم البياني (ب) من الحمض النووي تيثالدو تقلبات حبة بعد المحاذاة الدقيقة للموقف المغناطيس حبل النسبي في FOMT. في ظل هذه الظروف، والرسم البياني يكشف تغطية موحدة أساسا من المناصب على الدائرة. (ج) تقلبات الدوران من حبة تحديد من (س، ص) مناصب. (د) من الرسم البياني تقلبات التناوب. الخط الأحمر هو نوبة التمويه مع σ θ = 223 °. (ه) طبيعة الطاقة التي تنطوي عليها كثافة التذبذب التناوب من (ج) و (د). الفرق بين المشهد الطاقة التي تنطوي عليها تقلبات التناوب التوافقي وترسم (مع ك θ = ك ب ر / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad) هو أصغر بكثير من الطاقة الحرارية ك ب T على مدى عدة المنعطفات. ويقابل البيانات من أجل الوضوح بحيث θ 0 = 0. وعرضيمكن استخدام تقلبات لتحديد صلابة التوائية من الحمض النووي، انظر النص الرئيسي. وأجري قياس عازلة في برنامج تلفزيوني في قوة تمتد من ~ 1 السندات الإذنية. يتم تكييفها البيانات من Lipfert وآخرون 21.

    الرقم 5
    الرقم 5. وملزمة للبروتين RAD51 لقياسها باستخدام الحمض النووي FOMT. (أ) مراقبة الجمعية من البروتين RAD51 الصعود إلى المربوطة 7.9 KBP dsDNA وبنسبة 3.5 السندات الإذنية. يظهر (س، ص، ض) مسار تنفذها حبة المغناطيسي (قطر 1.0 مم) خلال ثانية 200 الأولى للجمعية، مع مرور الوقت ترميز اللون من الأزرق إلى الأحمر. (ب) تمديد dsDNA واستخلاصه من ض المكون من مسار حبة في (أ) بوصفها وظيفة من الوقت. (ج) زاوية الدوران حول محور حبل dsDNA واستخلاصهمن س، ذ المكونات من مسار حبة في (أ) بوصفها وظيفة من الوقت.

    الرقم 6
    الرقم 6. قياسات العزم على حبل الحمض النووي واحد في الإنتقالي العسكري (أ) تظهر تخطيطي مبدأ قياس عزم الدوران. بعد أكثر (أو أقل) لف حبل الحمض النووي عن طريق N يتحول، الحمض النووي يمارس عزم على استعادة حبة الذي يؤدي إلى تحول في الموقف من التوازن الزاوي θ θ 0 إلى N. (ب) مثال من آثار زاوية المستخدمة لقياس عزم الدوران: تقلبات الزاوي من حبة المربوطة إلى استرخاء إلتوائي جزيء DNA 7.9 KBP قبل (الازرق) وبعد إدخال 40 المنعطفات (الأحمر الداكن) (راجع) قياس العزم على جزيء DNA 7.9 KBP العازلة في برنامج تلفزيوني عقدت في الحادي وتهوع قوة ~ 3 السندات الإذنية باستخدام حبة علامة إيمانية تعتمد على بروتوكول تتبع الزاوي. تقلبات الزاوي كما هو مبين في الفقرة (ب) تم تسجيلها بوصفها وظيفة من عدد من الأدوار تطبيقها. (ج) الانحراف المعياري للتقلبات الزاوي بوصفها وظيفة من المنعطفات تطبيقها. عرض التقلبات هو ثابت تقريبا، مشيرا المستمر فخ الزاوي صلابة. (د) تحول في متوسط ​​زاوية دوران بوصفها وظيفة من المنعطفات تطبيقها. تحولات منهجية من زاوية يعني على أكثر من وunderwinding واضحة. (ه) الحمض النووي تمديد حبل رصد في وقت واحد بوصفها وظيفة من المنعطفات تطبيقها. (و) عزم الدوران بواسطة حبل DNA يتحدد من زاوية يعني هو مبين في (د) بذل ، انظر النص الرئيسي. الإفراط في وunderwinding حول الصفر يتحول إلى نشوء عزم الدوران مقابل الخطية يتحول استجابة الحمض النووي حبل (المنحدرات الرمادي مزودة أيون (د) و (و)) التي يمكن استخدامها لتحديد طول فعالة استمرار التوائية (7 ~7 نانومتر لهذه المجموعة البيانات). مزيد من overwinding يؤدي إلى التواء وتشكيل سوبركويل الخيوط الصبغية الملتفة (كما هو موضح تخطيطي في إدراجات)، المقابلة لهضبة عزم الدوران (الخط الأسود في المنعطفات الإيجابية في (و) في ~ 26 السندات الإذنية · نانومتر) وانخفاض خطية من تمديد الحبل مع عدد من المنعطفات (المنحدر السوداء في (ه)). الفك خارج النظام الخطي يسبب الحمض النووي لإذابة محليا (كما هو موضح في إدراجات على اليسار)، التي تميزت هضبة عزم الدوران مساويا لعزم الدوران ذوبان (الخط الأسود في المنعطفات السلبية في (و) في ~ -11 السندات الإذنية · نانومتر).

    Discussion

    عند تشغيل التجارب باستخدام MTT أو FOMT، عددا من الخيارات يجب القيام بها فيما يتعلق الخرز، والمغناطيس، والبروتوكولات تتبع، وما إلى ذلك أفضل الخيارات لإجراء تعتمد على التجربة المثيرة للاهتمام. أدناه، ونحن تصف المقايضات التي تصاحب الخيارات المختلفة، والتي ينبغي أن تسهل اختيار تجربة معينة. المقبل، ونحن تصف العديد من الخطوات الحاسمة التي تصاحب تشكيلة وتسيير الإنتقالي العسكري وFOMT التجارب. أخيرا، ونحن نناقش أهمية الإنتقالي العسكري وFOMT فيما يتعلق بأساليب القائمة وكذلك التطبيقات المستقبلية.

    اعتبارات قبل بداية الإنتقالي العسكري وFOMT التجارب

    أي تجربة تتطلب واحد لتحديد نوع حبة المغناطيسي للاستخدام. يمكن للمرء اختيار بين عدة streptavidin المغلفة الخرز المتاحة تجاريا مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، على سبيل المثال، 0.25 ميكرومتر الخرز دائرة نصف قطرها 0.5 ميكرومتر الخرز دائرة نصف قطرها، أو 1.4 ميكرومتر الخرز دائرة نصف قطرها (قهه الجدول مواد). حبات أكبر سيكون زيادة لحظة المغناطيسي بالمقارنة مع حبات أصغر (التحجيم تقريبا، حيث بلغ حجم) وبالتالي استخدامها سيسهل تطبيق أعلى القوات (القوات النموذجية التي تحققت في أدواتنا، انظر الجدول 1). عندما تتبع الزاوي باستخدام الخرز علامة هو المطلوب، ونحن نعمل مع 1.4 ميكرومتر عادة نصف قطرها 0.5 ميكرومتر واستخدام نصف قطرها الخرز البيروكسيديز غير المغناطيسية والخرز علامة (انظر الفقرة 1.9 للبروتوكول المرفق المقابلة). فمن المستحسن استخدام حبات صغيرة خاصة لFOMT، والجدول الزمني مميزة لحبة التناوب τ C يساوي نسبة السحب للنظام أكثر من الربيع المستمر γ / ك θ لها؛ الأهم من ذلك أن معامل السحب التناوب ذات الصلة لالزاوي جداول النطاق الزمني القياس على النحو ~ R 3 حبة، أي مع القوة الثالثة في دائرة نصف قطرها (انظر الجدول 2 لالوقت مميزة المقاييس لعدة تركيبات الحمض النووي حبة في FOMT والقياسات الإنتقالي العسكري). تخفيضات المرفقة في أقصى القوة التي يمكن تطبيقها يمكن معالجتها باستخدام كومة من مغناطيس اسطواني انقلبت 27. مع ذلك، في القياسات FOMT قد يكون من الضروري أحيانا لتقديم تنازلات بين أفضل قرار الزمانية للتحقيق أقصى قدر من القوة وتطبيقها.

    بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تجربة اختيار تكوين المغناطيس. في ملاقط المغناطيسية التقليدية التكوين (الشكل 1A)، ونحن عادة استخدام زوج من 5x5x5 ملم مغناطيس مكعب في اتجاه رأسي مع وجود فجوة 0.5 أو 1 ملم بين المغناطيس 4. عندما متباعدة المغناطيس على طول محور س (ص)، وهذا ينتج مجال مغناطيسي أن يتم توجيه المقام الأول على طول المحور x (ص). للتجارب FOMT، يتم تحديد نقطة جذب على شكل إسطوانيا-في الذي يتم توجيه المجال المغناطيسي في المقام الأول مركزعلى طول المحور z (الشكل 1B). في الممارسة العملية، ونحن نستخدم كومة من ثلاثة من هذه مغناطيس على شكل إسطوانيا، كل يبلغ قطرها 6 مم وثقب 2 مم قطر المركزي، وذلك لسمك مجموعه 6 مم. عندما يتم سحب القوات المطلوب أعلى، ويفضل "كومة المعكوسة" التكوين المغناطيس التي يتم مكدسة المغناطيس أسفل مع مغنطة المعاكس. لتحقيق التكوين الإنتقالي العسكري (الشكل 1C)، ونحن إضافة المغناطيس إضافية إلى جانب كومة المغناطيس الرئيسي لتكوين FOMT، وعادة اسطوانة الصلبة مع 4 مم وارتفاعه 7 مم. لنرى كيف القوات القصوى التي تحققت في أدواتنا تعتمد على تكوين المغناطيس، انظر الجدول رقم 1.

    المعراخ من MTT وFOMT التجارب

    منذ حبات مغناطيسية لها (تقريبا) عن سطح البحر بين functionalized موحد (streptavidin عادة) ومنذ المرفقات كل من ن بين functionalizedالحبال حمض ucleic والخرز علامة (في حال استخدمت علامة القائم على حبة تتبع الزاوي) يحدث عن طريق الحضانة بسيطة في الحل، واحد لا تتحكم فيها حبل و / أو علامة حبة نعلق على حبة المغناطيسي. حبات مغناطيسية يكون محور مغنطة يفضل أن يميل إلى محاذاة على طول اتجاه المجال الخارجي. إذا كنا دلالة على نقطة حيث محور مغنطة يفضل يتقاطع سطح حبة كما القطبين الشمالي والجنوبي، ثم حبات حيث يتم إرفاق الحمض النووي حبل بالقرب من خط الاستواء سوف تتبع خارج الحلقة الدائرية مع دائرة نصف قطرها قريبة أو أكبر قليلا من دائرة نصف قطرها حبة في FOMT؛ في المقابل، والخرز التي تعلق على مقربة من القطب الجنوبي تتقلب على الحلقة الدائرية مع دائرة نصف قطرها صغير جدا في FOMT، والتي يمكن أن تحول دون تركيب الدائرة باستخدام المعادلات 3-5. نلاحظ أنه من خلال الهندسة الكروية بسيطة، واحتمال ربط بالقرب من خط الاستواء هو أكبر بكثير من مرفق بالضبط في القطبين؛ وبالتالي، فإن معظم بسيتم المربوطة EADS بحيث تتبع الزاوي (س، ص) المستندة يمكن القيام بها بنجاح.

    يحمل حجة مماثلة لمرفق من الخرز علامة للحصول على علامة مقرها تتبع الزاوي إيمانية. يتم استخدام حبة علامة لخلق التفاوت في صورة حبة المغناطيسية التي تمكن تتبع زاوية. إذا تم إرفاق حبة علامة بالضبط في القطب الشمالي أو الجنوبي من حبة (أي مباشرة في أعلى أو في أسفل)، والصورة الناتجة لا يزال متماثل بالتناوب وفشل بروتوكول تتبع الزاوي. ومع ذلك، من خلال نفس الحجة الهندسة الكروية، وفرصة لحبة علامة إرفاق مباشرة في واحدة من أعمدة صغيرة نسبيا؛ نجد أنه في الممارسة الأكثر الخرز علامة إعطاء التماثل كافية لتمكين تتبع الزاوي. أخيرا، نلاحظ أن في ملاقط المغناطيسية التقليدية الاتجاه الحقل في (س، ص) الطائرة؛ وبالتالي، فإن محور مغنطة المفضل للحبة محاذاة في اله (س، ص) الطائرة والقطبين الشمالي والجنوبي، كما هو محدد أعلاه، ستكون في الجانبين من حبة، من غير المحتمل أن الوضع في FOMT أو الإنتقالي العسكري، حيث القطبين هي في أعلى وأسفل.

    في التجارب FOMT، خطوة حاسمة هي المواءمة بين المغناطيس أسطواني مثل أن الحقل المغناطيسي شعاعي لا يكاد يذكر في القرب من حبة. يتم تنفيذ هذا التوافق لحبة واحدة في وقت واحد. للحكم على ما إذا كانت الحركة حبة في FOMT يتم توزيعها بالتساوي على الحلقة الدائرية، ينبغي قياس الوقت يتجاوز 20 · τ C. كما τ C يساوي ~ 45 ثانية لمدة 8 الحمض النووي KBP وحبة دائرة نصف قطرها 0.5 ملم، وقياس الوقت هو ~ 900 ثانية في المراحل النهائية من المحاذاة. للمقارنة، واستخدام الحمض النووي KBP 1.9 و 0.25 ملم حبات نصف قطرها يقلل τ C عشرين ضعفا إلى ~ 2 ثانية (انظر أيضا الجدول 2).

    خطوات واعتبارات حاسمة لتتبع خلال FOMT وMTT التجارب

    لتتبع تقلبات في حبة في الطائرة، أي في (س، ص) الموقف، ونحن توظيف التحليل عبر ارتباط لمحات كثافة عرضها بواسطة حبة في فترات زمنية لاحقة 35، 36. وهذا يمكن أن يتم على بكسل فرعية القرار إلى دقة بضعة نانوميتر 20. لتتبع الحركة حبة في ض، ونحن عادة استخدام أسلوب تصميم أول مرة من قبل غوس وكروكيت، الذي البؤري على الهدف في (OFP) يتم إزاحة بدقة في الاتجاه الرأسي، بينما تصوير حلقات حيود حبة تعلق على الحمض النووي 20 . في هذه الطريقة، يتم إنشاء ملف تعريف المعايرة ربط نمط حيود من حبة إلى المسافة بين حبة وOFP 19. عندما يتم محرف هذا الملف المعايرة، والتشريد العمودي للحبة يمكن قياسها أيضا بدقة تصل إلى بضعة نانومتر 20.نشير القارئ إلى مراجع إضافية التي تصف الخوارزميات أكثر دقة تتبع 37، 38 وكذلك تطبيقها موازية تتبع من الخرز متعددة 5، 6، 37.

    عند استخدام تتبع الزاوي التي تعتمد على تحويل (س، ص) مناصب في الإحداثيات الزاوي، فإننا ننصح المضي قدما على النحو التالي. من تتبع الوقت الذي يتتبع حبة خارج الحلقة الدائرية، استخدم ط، ط ذ) وظائف (حيث مؤشر يدل على نقطة ط القياس اللاحق) لتتناسب مع مركز الدائرة ص 0) ودائرة نصف قطرها R (الشكل 2A) عن طريق التقليل:

    (3)

    حيث تدير أكثر من مجموع جميع نقاط البيانات. بعد fittiنانوغرام س ذ وR الدائرة، وتحديد الإحداثيات القطبية ط، ط θ) لكل نقطة بيانات في تتبع الوقت باستخدام:

    (4)

    (5)

    لاحظ أنه ينبغي للمرء أن الحرص على "بسط" وθ زاوية، أي يقفز لإضافة مرحلة ± π عند الاقتضاء. قانون مكتوب خصيصا للمناسبة وتحويلها من (س، ص) إلى (ص، θ) بتنسيق يتوفر من الكتاب عند الطلب. في FOMT، وقت تتبع فيه حبة يتتبع خارج الحلقة الدائرية يمكن الحصول عليها من خلال تحقيق المواءمة الخشنة (راجع الخطوة 3.3) وتسجيل التقلبات الحرارية للحبة. في الإنتقالي العسكري، fluctu الحراريةations غير كافية لتتبع خارج الحلقة الدائرية؛ بدلا من ذلك، استخدم تتبع الوقت حيث المغناطيس ببطء (عادة عند 0.1 هرتز) استدارة من قبل العديد من المنعطفات لتناسب الدائرة باستخدام المعادلات 3-5.

    نلاحظ أن لالإنتقالي العسكري، فمن المهم أن تختار النهج السليم تتبع الزاوي، أي عبر علامة تتبع الزاوي (الشكل 1C، 1D الشكل، الشكل 3A) أو عن طريق تحويل (س، ص) مناصب في الإحداثيات الزاوي ( 1D الشكل، الشكل 2B). في حين أن الدقة في تتبع الزاوي من (س، ص) مواقف واستخدام الخرز علامة عادة قابلة للمقارنة، فمن المهم أن ندرك أن يحدث الحديث المتبادل بين تقلبات حبة في (س، ص) والزاوية، كما هو موضح في يانسن وآخرون (32): وبالتالي، تتبع الزاوي من (س، ص) مواقف صالحة فقط شريطة أن التقلبات في البراونية ، ذ) المساهمة تكاد لا تذكر فقط لعدم اليقين في تنسيق الزاوي، والاستخدام السليم لها من (س، ص) تتبع قد تتطلب ضبط للفخ صلابة التناوب عبر تعديل موقف المغناطيس الجانب. عادة، واستخدام أعلى فخ صلابة يتطلب استخدام تتبع الزاوي باستخدام الخرز علامة. استخدام الخرز علامة يتطلب خطوة إضافية المرفق، والذي قد يقلل من عدد من الحبال صالحة للاستعمال (انظر البروتوكول المرفق في الخطوة 1.9). عند استخدام تتبع القائم على حبة علامة، فمن المهم لاختيار حبات مغناطيسية والتي لها تعلق حبة علامة بالقرب من خط الاستواء للحصول على أفضل النتائج.

    أهمية FOMT وMTT المناهج بالمقارنة مع الأساليب القائمة والتطبيقات

    في ما سبق، لقد أظهرنا كيف يمكن للمرء، بدءا من MT التقليدية، بسهولة تعديل تكوينات المغناطيس لتحويل الصك إلى الإنتقالي العسكري أو FOMT. هذا واضحة مodification، والتي قد تكون مصحوبة إدخال تتبع الزاوي عندما كان المطلوب استخدام علامة تتبع الزاوي، هو نقطة قوية الفوري عن كل من التكوينات، كما أنها تسمح للمستخدم لتطبيق عزم الدوران، وقياس عزم الدوران، أو قياس تطور تبعا ل التجربة في متناول اليد. كما ذكر في المقدمة، سواء FOMT والاستفادة MTT من العديد من نقاط القوة الموجودة لMT، ولا سيما على البساطة، مع الإنتقالي العسكري على وجه الخصوص الاستفادة أيضا من قدرة قياسات موازية 5، 6 (هذه ليست بالسهولة التي تحققت في FOMT نظرا متطلبات المواءمة بين حبل فيما يتعلق وسط المغناطيس أسطواني). والجدير بالذكر أن MTT وFOMT لا تتطلب، في تناقض مع تقنيات أخرى، خصيصا نانو جزيئات ملفقة 22، 39، 40، التصميم البصري مجمع 41، أو إدخال حبات إضافية ضمن المربوطة (DNA) جزيء 42. مثل سقد التقنيات ذر مع ذلك توفر مزايا أخرى مثل دقة أعلى الزمنية 27، 43، 44. كلا FOMT وMTT أن تجد التطبيقات المستقبلية في دراسة الجينوم المعالجة، وسلوك المحركات الجزيئية في الحمض النووي على حد سواء تتأثر ولها عواقب على تطور المحلية وعزم الدوران. تطبيقات إضافية يمكن العثور عليها في مجال تكنولوجيا النانو الناشئة من الحمض النووي 27 أو في مجال أوسع من المحركات الدوارة نشط في معالجة البيولوجية 7، 45.

    M270 (R = 1.4 ميكرومتر حبة) MyOne (R = 0.5 ميكرومتر حبة) Ademtech (R = 0.25 ميكرون حبة)
    MT التقليدية (زوج من مكعب 5 × 5 × 5 مم 3 المغناطيس، 1 ملم الفجوة، المحاذاة العمودية) 70 السندات الإذنية 8 السندات الإذنية 1.6 السندات الإذنية
    FOMT أو MTT * (كومة من ثلاثة مغناطيس اسطواني، 6 مم، 2 مم فجوة قطرها) 9 السندات الإذنية 1 السندات الإذنية 0.2 السندات الإذنية
    FOMT أو MTT * (كومة من ثلاثة مغناطيس اسطواني، 6 مم، 1 مم فجوة قطرها) 18 السندات الإذنية 2 السندات الإذنية 0.4 السندات الإذنية
    FOMT أو MTT * (كومة من ثلاثة مغناطيس اسطواني مع مشاركة واحدة انقلبت، 1 ملم الفجوة قطر) ~ 50 السندات الإذنية 9 السندات الإذنية 1.8 السندات الإذنية

    * وجود المغناطيس الجانب الصغيرة في MTT له تأثير يذكر على قوة تمتد

    الجدول 1. حققت قوات أقصى عادة لتكوينات مختلفة وأنواع المغناطيس حبة.

    R = 1.4 ميكرومتر حبة R = 0.5 ميكرومتر حبة R حبة =0.25 ميكرومتر
    معامل الاحتكاك * 120 نانومتر · · السندات الإذنية ثانية 5.5 نانومتر · · السندات الإذنية ثانية 0.7 نانومتر · · السندات الإذنية ثانية
    النطاق الزمني مميزة: FOMT، 10 KBP الحمض النووي ** 1200 ثانية 55 ثانية 7 ثانية
    النطاق الزمني مميزة: FOMT، DNA 1 KBP 120 ثانية 5.5 ثانية 0.7 ثانية
    النطاق الزمني مميزة: MTT، ك ف = 100 السندات الإذنية · نانومتر / راد 1.2 ثانية 0.06 ثانية 0.007 ثانية
    النطاق الزمني مميزة: MTT، ك ف = 1000 السندات الإذنية · نانومتر / راد 0.12 ثانية 0.006 ثانية = 6 ميللي ثانية ق = 0.0007 0.7 ميللي ثانية

    * معامل الاحتكاك للدوران حول محور من خلال "خط الاستواء" (أي الوضع هو مبين في الشكل 1B)، التي قدمها 14 · ع · ح · R حبة حيث h هو اللزوجة من المخزن المؤقت.
    ** في FOMT، ونظرا لصلابة فخ التناوب من صلابة التوائية من الحمض النووي، ك ف، الحمض النووي = C · ك ب ر / L حيث C هو طول فعالة استمرار التوائية، يفترض أن تكون 80 نانومتر هنا ( والتي هي من سمات نظام قوة وسيطة، F ~ 1 PN) وL C هو طول كفاف من الحمض النووي، 0.34 نانومتر لكل زوج قاعدة.

    الجدول 2. معاملات الاحتكاك والزمنية المميزة المقاييس وFOMT وMTT.

    Disclosures

    وقد تم رفعها البراءة المرتبطة بهذا العمل في إطار PCT/NL2011/050446 المرجعية.

    Acknowledgments

    وأيد هذا العمل من قبل TU دلفت، ومنظمة هولندا للبحث العلمي (NWO)، ومؤسسة للبحوث الأساسية في المسألة، ومؤسسة العلوم الأوروبية.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
    2. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
    3. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
    4. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
    5. Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
    6. De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
    7. Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
    8. Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
    9. Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
    10. Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
    11. Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
    12. Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
    13. Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
    14. Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
    15. Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
    16. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
    17. Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
    18. Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
    19. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. Springer. (2009).
    20. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
    21. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
    22. Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
    23. Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
    24. Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
    25. Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. 102 (2009).
    26. Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82, (12), (2011).
    27. Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
    28. Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
    29. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
    30. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
    31. Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
    32. Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
    33. Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
    34. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
    35. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
    36. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
    37. Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
    38. Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
    39. Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
    40. Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
    41. La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
    42. Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
    43. Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
    44. Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
    45. Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).More

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter