Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51503

Summary

פינצטה המגנטית, טכניקת מניפולציה מולקולה בודדת חזקה, יכולה להיות מותאמת למדידות הישירות של טוויסט (שימוש בתצורה הנקראת באופן חופשי, המקיף פינצטה המגנטית) ומומנט (באמצעות תצורה כינתה פינצטה מומנט מגנטי) במקרומולקולות ביולוגיות. הנחיות לביצוע מדידות כאלה מקבלות, כוללים יישומים למחקר של ה-DNA וחוטי Nucleo-חלבון קשורים.

Abstract

טכניקות מולקולה בודדת מאפשרות לחקור את ההתנהגות של מולקולות ביולוגיות בודדות בפתרון בזמן אמת. טכניקות אלו כוללות מה שנקרא גישות הכוח ספקטרוסקופיה כגון מיקרוסקופ כוח אטומי, פינצטה אופטית, לזרום מתיחה, ופינצטה המגנטית. בין גישות אלה, פינצטה מגנטית הצטיינו ביכולתם ליישם את המומנט תוך שמירה על כוח מתיחות מתמיד. הנה, זה בא לידי ביטוי איך כגון תצורה ניסיונית פינצטה המגנטית "קונבנציונלית" יכולה, באמצעות שינוי פשוט של תצורת השדה שלה כדי למזער את עוצמת השדה הרוחבי, להיות מותאמת על מנת למדוד את מידת הפיתול במולקולה ביולוגית. התצורה וכתוצאה מכך שמכונה פינצטה המגנטית באופן חופשי, במסלול. בנוסף, הוא הראה כיצד שינוי נוסף של תצורת השדה יכול להניב שדה רוחבי עם גודל ביניים בין זו של & #8220; "פינצטה המגנטית הקונבנציונלית ופינצטה המגנטית באופן חופשי, במסלול, המאפשרת למדוד את המומנט מאוחסן במולקולה ביולוגית באופן ישיר. תצורה זו מכונה פינצטה המומנט המגנטית. הווידאו הנלווה מסביר בפירוט כיצד ההמרה של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית לפינצטה מגנטית באופן חופשי-מקיפה ופינצטה מומנט מגנטי יכולה להיות מושלמת, ומדגים את השימוש בטכניקות אלה. עיבודים אלה לשמור על כל נקודות החוזק של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית תוך הרחבת צדדיות של המכשיר הזה חזק מאוד.

Introduction

בשנים האחרונות, טכניקות מולקולה בודדת הוכיחו התחולה רחבה שלהם במחקר של חלבוני מנוע התהליכית ואנזימים אחרים, מניב תובנה קינטיקה שלהם וmechanochemistry הבסיסי. בהקשר של כוח ספקטרוסקופיה, תרומות חשובות שנעשו על ידי זרימת מיקרוסקופ כוח אטומי מתיחה, ופינצטה אופטית והמגנטיות. פינצטה אופטית והמגנטי (MT) הצליחה בעיקר בשילוב של גמישות רבה במונחים של מניפולציה מולקולרית גבוה במרחב וברזולוציה של זמן. כאן, אנו מתמקדים בMT, אשר יכול להחיל את שני הכוחות והמומנטים המשתרעים למולקולות ביולוגיות קשורות בין פני השטח וחרוזים פאראמגנטי 1-3.

פינצטה המגנטית (MT, איור 1 א) הן טכניקת מולקולה בודדת מאוד תכליתית, כי נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר שני התכונות מכאניות של חומצות גרעין, כמו גם יחסי הגומלין שלהם עם חלבונים. יש לי MT רבים כוחים, ובם פשטות כוללת וחוסנו של היישום הניסיוני, יישום קליל של מומנט, פעולה טבעית וכיול פשוט במצב כוח קבוע 4, הרחבה במקביל מדידות 5, 6, והעדר חימום מדגם וניזקים. בהשוואה למולקולה בודדת גישות אחרות, MT מספק דרך לבצע מדידות כוח תלות בכוחות נמוכים כמו 10 ≈ Fn ויש לי את היכולת לשלוט בצורה ישירה את מידת supercoiling. בעוד MTs יש בעיקר שימש ככלי ניסיוני כדי לחקור תהליכים ביולוגיים מעורבים חומצות גרעין 7, 8, הם מצאו גם יישום במחקרים של התכונות מכאניות של חלבונים 9-13 או תאים 10, 14-17. אזכור שימושי רב זמין המתארים כיצד לבנות ולהפעיל את 4 MT, 18-20.

Howevאה, MT הקונבנציונלי לא לעקוב אחר תנועה סיבובית באופן ישיר, ותוך שהם חלים מומנט, הם לא מודדים מומנט באופן ישיר. בנוסף, הם להגביל את הסיבוב החופשי של לקשור חומצות הגרעין. כאן, אנו מציגים שתי שלוחות של פינצטה מגנט. פינצטה הראשונה, המכונה באופן חופשי, במסלול המגנטית (FOMT, איור 1b) 21, מאפשר המדידות של תנודות זווית שיווי משקל ושינויים בטוויסט של מולקולות חומצות גרעין קשורות, ללא הגבלת התנועה הסיבובית סביב הציר לקשור. השני, המכונה פינצטה מומנט המגנטית (MTT, איור 1 ג), שבו יש לו את היכולת ליישם ולמדוד ישירות את שני הכוחות ומומנטים לביומולקולות אחת 22-27.

בפרוטוקול הבא, אנו מניחים שהקורא יש באופי שלו / שלה מכשיר MT "קונבנציונלי". אנו מפנים את הקורא לדיון לאזכור על איך לבנות ולהפעיל MT להגדיר, כמו גם consideמנות שחייבות להילקח בחשבון בבחירה של חרוזים מגנטיים, מגנטים, ואת שגרת מעקב. בנוסף, סעיפי 1 ו -2 של טקסט הפרוטוקול לתאר איך אנחנו בדרך כלל להכין ודגירת דגימת DNA לשימוש בMT, כמו גם מדידות הראשוניות שניתן לבצע על ה-DNA בודד בMT הקונבנציונלי. סעיפים 3 ו -4 לפרוטוקול הטקסט להמחיש עד כמה מכשיר MT ניתן להתאים בקלות ומשמש למדידות FOMT וMTT.

Protocol

1. הכנה ודגירה של דגימת DNA

  1. הכן בונה DNA הligated לדופלקס קצוות (בדרך כלל להעסיק ≈ 600 ברים נ"ב DNA PCR) שהם פונקציונליות עם קבוצות ביוטין וdigoxigenin מרובות, בהתאמה 18. כדי להתחיל, אורך רצועת ה-DNA> 1 מיקרומטר, למשל, kbp 7.9 מקבילים לאורך מתוח של ~ 2.7 מיקרומטר כמועסק כאן, מומלץ לנוחות שימוש; בפרט, תוך שימוש באורך ה-DNA דומה לאו קצר יותר מרדיוס חרוז הוא בעייתי בשל הגיאומטריה הקובץ המצורף בMTT וFOMT. ראה דיון לתיאור של איך אורך ה-DNA משפיע על תגובה זמנית בתחום זוויתי.
  2. להרכיב את זרימת התאים לניסויי מולקולה בודדת. עבור תאי הזרימה, השתמש בשני מיקרוסקופ זכוכית coverslips מופרד על ידי spacer Parafilm שכבה כפולה. מיקרוסקופ coverslip העליון צריך שני חורים לנוזל ובשקעים לתא. זה נוחלהשתמש במקדחה חשמלית לקדוח חורים. Coverslip התחתון מצופה בניטרוצלולוזה (0.1% wt / כרך באמיל אצטט). הנח מפרידי Parafilm בצד מצופה ניטרוצלולוזה של השקופיות התחתונה ולסגור את החלק העליון עם מגלשות העליונים נקיות.
  3. חותם את תאי הזרימה. באמצעות פינצטה פיזית, למקם את תא הזרימה המורכבת על צלחת מחמם להגדיר ל-C ° 80-100 ל~ 1 דקות. שים לב שזרימת התא אטום היטב, שParafilm לא לסגור את החורים שמתחברים ובשקע, וכי שקופיות הזכוכית מיושרות היטב.
    הערה: כדי להבטיח חותם טוב, מומלץ ללטף את הבועות בParafilm באמצעות מקלון צמר גפן גדול. תא הזרימה אז יכול להיות מותקן על מכשיר פינצטה המגנטית.
  4. הכן את המאגרים. הכן את חיץ TE קשירה (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, חומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו200 מ"מ NaCl). לחלופין, אפשר להשתמש PBS חיץ (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, חיץ פוספט 10 מ"מ, pH 7.4) בתוספת wה-i מיקרוגרם / BSA 100 מיליליטר, Tween 0.1% ו -5 אזיד הנתרן מ"מ (PBS +) כחיץ קשירה. כרכי 2-3 תא פלאש חיץ קשירת TE לתוך תא הזרימה.
  5. דגירה 0.5 או 1.5 חרוזים לטקס שאינם מגנטיים מיקרומטר רדיוס בתא הזרימה ל~ 30 דקות. חרוזים אלה יפעלו כחרוזי התייחסות במהלך מדידות פינצטה המגנטית המאפשרות אחד כדי למזער את ההשפעה של סחיפה בין המטרה לבין בעל המדגם (כלומר תא הזרימה). לשטוף את חרוזים שאינם מגנטיים פנויים על ידי שטיפה עם 2-3 כרכי תא של חיץ קשירת TE.
  6. Functionalize המשטח התחתון של תא הזרימה על ידי דגירה עם אנטי digoxigenin 100 מיקרוגרם / מיליליטר PBS במשך שעה לפחות 1 (רצוי יותר; דגירה יכולה להתבצע בין לילה), על מנת לספק לקובץ מצורף ה-DNA. לשטוף עם 2-3 כרכי תא של חיץ קשירת TE. לבסוף דגירה תא הזרימה עם 2 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) במאגר קשירת TE ל30 דקות לפסיבציה פני השטח.
  7. קח aliquot של2 מיליליטר חרוזים MyOne פאראמגנטי streptavidin המצופה (ראו דיון ולוח של חומרים) ולדלל עם 10 מיליליטר חיץ קשירת TE. שטוף פעמיים עם 10 מיליליטר חיץ קשירת TE באמצעות concentrator מגנטי חלקיקים, ו resuspend ב 10 מיליליטר חיץ קשירת TE. צרף ~ 1 מיליליטר של מולקולות ה-DNA (כ 1 ננוגרם) לחרוזים אלה על ידי דגירה במאגר קשירת TE ל30 דקות.
  8. לדלל את הפתרון של חרוזים פאראמגנטי-DNA הקשור פי עשרה על ידי הוספת 90 מיליליטר חיץ קשירת TE. לבסוף, להזריק את הפתרון לתוך תא הזרימה ודגירה ~ 1 שעות כדי לאפשר לקובץ מצורף DNA אל פני השטח אנטי מצופה digoxigenin. שטוף את תא הזרימה ביסודיות עם חיץ קשירת TE. לאחר הדגירה של בונה DNA קשור אליה, לשטוף באופן נרחב עם חיץ ניסיוני (זה יכול להיות חיץ קשירת TE) כדי להסיר את כל חרוזים שאינם מחוברים.
  9. עבור מדידות המעסיקות פרוטוקול מעקב הזוויתי שדורש חרוזים סמן fiducial המצורפים לחרוזים המגנטיים

2. מדידות על Single-DNA מולקולה במלקחיים מגנטיים קונבנציונליים

  1. שימוש MT קונבנציונלי (ראה דיון) בתצורת שדה מתאימה (איור 1 א) ושניהם translational ושליטה סיבובית של עמדת המגנט, לחפש את מולקולות ה-DNA rotationally מוגבלות בתא הזרימה. במשייכת כוחות של ≥ pN 1 (להתייעץ אזכור 4, 19, 20, 28, 29 לגבי כיול כוח בפינצטה המגנטית), יכולים בקלות להיות מכובדים על חרוזים קשורים מהחרוזים תקועים אל פני השטח של השקופית התחתונה בגבהים השונים שלהם במוקד . אם מולקולת הדנ"א היא מוגבלת rotationally ניתן להעריך על ידי החדרת 20-30 תורים של המגנטים בכוח של 0.25 ≈ pN: כאן, אורך הרצועה כאמור יורד ב0.4-0.5 מיקרומטר.
    הערה: כדי להריץ ניסויי פינצטה המגנטית, עיבוד תמונה משמש כדי לקבוע את x, y, z והעמדה של חרוזים ה-DNA הקשור. תוכנת Labview המותאם אישית למטרה זו זמינה מהמחברים על פי דרישה.
    1. ודא שהחרוז מחובר על ידי רצועת DNA בודדת. ניתן לעשות זאת על ידי השוואת ההתנהגות תחת סיבובים חיוביים ושליליים בכוחות> 1 PN (איור 2 א). במשטר בכוח זה, הנוכחות של רצועות DNA מרובות תהיה להצמיח ירידה כ סימטרית בהארכה על החדרת תורות חיוביות ושליליות, ואילו רצועות DNA בודדות תהיה להצמיח תגובה סימטרית.
  2. חיפוש עבור חרוזים קבועים מתאימים נדבק למשטח התחתון בקרבת גבול היכולת של עניין שיכול לשמש כחרוזי התייחסות.
  3. לכייל את האורך של tהוא DNA, l. העמדה של פני השטח flowcell יכולה להיקבע על ידי הבאת חרוז הקשור במגע עם פני השטח (למשל, על ידי החלפה של המגנט על ידי ~ 60 סיבובים בכוח מתחת 0.2 PN). מדידות של המיקום האנכי של חרוז הקשור ביחס למשטח הזה ואז לדווח על ערך מוחלט של ליטר.
    הערה: כדי למזער את ההשפעות הבאות של סחיפה, מומלץ לבצע מדידות של קרוב l לתפקיד חרוז התייחסות המודבק על פני השטח.
  4. הקלט את עקומת סיבוב (כלומר מדידה של סיומת ה-DNA כפונקציה של מספר הסיבובים) בכוח מתיחה של ≈ 0.25 pN (איור 2 א).
    1. לקבוע את מספר הסיבובים שבו הסיומת היא מרבי, כפי שזה מתאים למצב שבו מולקולת ה-DNA היא torsionally רגועה. לשם כך, הוא שימושי כדי להתאים את עקומת הסיבוב מקומי עם parabolic או פונקצית גאוס כדי לקבוע positi המרכזהלאה. להגדיר את הנקודה הזו כמו "אפס תור".
      הערה: שגרה אישית בכתב למטרה זו זמינה מהמחברים על פי דרישה.
  5. לסדרת ~ 20 עמדות מגנט, לקבוע את הסיומת של מולקולת torsionally-רגועה הממוצעת (כלומר "אפס תור", ראה צעד 2.4.1) מZ-העקבות.
  6. עבור כל נקודת מדידה בשלב 2.5, דווקא לקבוע את כוח המתיחה מהתנודות במצב X או Y 20, 28, 29, או, בתנאי המגנטיזציה של חרוז ידועה, תוך שימוש בידע של שיפוע השדה המקומי 4. זומם כוח המתיחה לעומת תוצאות ההארכה הממוצעת בעקומת כוח הארכה (איור 2b).
    1. להתאים את נתוני כוח הרחבה וכתוצאה מכך למשוואת השרשרת דמוית תולעת באמצעות קירוב פולינום ידי Bouchiat et 30 אל.
    אם הכנה למדידות FOMT הבאות, לסובב באיטיות את המגנטים בזמן הקלטת הטיולים של חרוז המגנטי ב( x, y).
    הערה: הרדיוס של annulus וכתוצאה מתצורת MT הקונבנציונלי קטן יותר, באופן הדוק יותר את מולקולת ה-DNA היא קשורה יותר ל" קוטב דרומי "של חרוז המגנטי. כאשר אחד עובר לתצורת FOMT, מולקולת ה-DNA כזה תהיה קשור ל" קו המשווה "של חרוז המגנטי, המאפשר מעקב אמין של זווית הסיבוב מ( x, y), המיקום (ראה דיון) בשיתוף פעולה הדוק.

3. מדידות של טוויסט DNA באמצעות מלקחיים מגנטיים באופן חופשי, במסלול

  1. ידני להחליף את המגנטים רבועים של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית על ידי מגנט גלילי המשמש לFOMT (איור 1b). פעולה זו צריכה להתבצע באופן כזה שרצועת ה-DNA שנבחרה נשארת בשדה הראייה. ניתן להשיג זאת בדקות פחות מ 1 על ידי פשוט פותח את ראש המגנט השלם שמחזיק את המגנטים לתצורת פינצטה הקונבנציונלית והחלפתו על ידי ראש מגנט שמחזיק מגנט גלילי לFOMT.
  • הטיולים ב( x, y) של חרוז מגנטי קשור ידי לקשור dsDNA אחת תלוי מאוד על עמדתה של הרצועה ביחס לציר של המגנט הגלילי (איור 1b, איור 3 א). רשום את הטיולים (x, y) על מנת לקבוע את המיקום המתאים בתוך תבנית התנודות האופיינית (איור 3 א, דיון).
  • לבצע יישור גס של המגנט בFOMT. זו יכולה להיות מושגת על ידי העברת המגנט הגלילי מעל תזרים התאים באמצעות שלבי תרגום (x, y). אם הטיולים (x, y) לעקוב אחר קשת, המגנט הגלילי אינו מכוון כראוי וצריך להתרגשבכיוון המתאים (איור 3 ב).
    1. יישור גס יכול להיות מושלם בתוך 15 דקות למקרה של חרוזים MyOne 7.9 רצועות kbp, ויושלם כאשר מדידה של תוצאות טיולים (x, y) בהתבוננות בתנועה מעגלית (3 ב איור, במרכז).
      הערה: היישור גס הוא בדרך כלל מספיק כדי לבחון את השינויים בטוויסט שנגרמו על ידי חלבון קושר לDNAs אחת קשור בתצורת FOMT 21, ביום 31 (נציג תוצאות, איור 5), למרות העובדה היסטוגרמה דו ממדים המלווה את לא יכול להיות הספירה שלה לחלוטין מפוזר באופן אחיד לאורך annulus העגול (איור 3c).
  • אם תידרש לניסויים נוספים, לבצע יישור קנס בFOMT. זו יכולה להיות מושגת באמצעות ברגי מיקרומטר ברזולוציה גבוהה או שלב אוטומטי ברזולוציה גבוהה או כדי להזיז את המגנט או תא הזרימה לסנאטאה המגנט הגלילי על חרוז עד למרחק של ~ 10 מיקרומטר. בשלב היישור בסדר, המגנט ממוקם כך שהתנודות בannulus המעגל הן אחידות כמעט, המקביל למצב שבו מחסום האנרגיה לסיבוב מלא בשל המגנט הוא k B T (איור 4) בזהירות.
    הערה: תסריט MATLAB לזוממים תנודות בהיסטוגרמה או thermogram כמו באיור 4 הוא זמין מהמחברים על פי דרישה.
    הערה: יישור פיין יכול להיות מושלם בתוך 45 דקות למקרה של חרוזים MyOne 7.9 רצועות kbp, ובפרקי זמן מופחתים עבור חרוזים ורצועות קצרות יותר קטנים יותר מועסק (ראה דיון).
    הערה: יישור פיין נדרש בדרך כלל לבצע מדידות של נוקשות הקימוט של ה-DNA החשוף או מצופה חלבון (נציג תוצאות, איור 4).
  • אם נדרש לניתוח, כייל את הכוח בFOMT. זה יכול להתבצע iאופן na מקביל לMT, או באמצעות תנודות הרדיאלי של חרוז <r 2> (שבו סוגריים הזווית נסמן את ממוצע הזמן) כפי שמוצג בוידאו הנלווה ומפורט בLipfert אח' 21, או, בתנאי המגנטיזציה של חרוז הוא גם ידוע, תוך שימוש בידע של שיפוע השדה המקומי 21.
  • 4. מדידות של ה-DNA מומנט באמצעות מלקחיים מומנט מגנטיים

    1. ידני להחליף את המגנט הגלילי המשמש לFOMT ידי מגנט גלילי בתוספת צד מגנט (קבוע) לMTT (איור 1 ג'). פעולה זו צריכה להתבצע באופן כזה שרצועת ה-DNA שנבחרה נשארת בשדה הראייה.
      1. הדרך הפשוטה ביותר להשיג זאת היא להוסיף את מגנט הצד במיקומו הראוי, אשר יכול להתבצע בתוך דקות 1 באופן ידני. אין התכנסות נוספת היא הכרחית.
        הערה: חלופה למגנט צד היא השימוששל אלקטרומגנטי 32.
    2. אם נדרש לניתוח, כייל את הכוח באופן מקביל לMT, או באמצעות x של חרוז או תנודות y או, בתנאי המגנטיזציה של חרוז ידוע, תוך שימוש בידע של שיפוע השדה המקומי 21.
    3. עקוב אחר התנודות זוויתי כפונקציה של θ הזמן (t) או באמצעות פרוטוקול fiducial מבוססת מעקב 23 או, כפי שמוצגים בוידאו הנלווה, פרוטוקול המעקב זוויתי המבוססים על הניטור (x, y), המיקום (ראה דיון). במקרה הראשון, להקליט תמונות מלאה של חרוז כפונקציה של זמן לעיבוד תמונה שלאחר מכן. במקרה האחרון, זה מספיק כדי להקליט את התנודות של חרוז (x, y) בשלב זה.
      הערה: תסריט MATLAB לקביעת θ (t) מתמונות מלאה של חרוז כפונקציה של זמן בפרוטוקול המעקב fiducial מבוססת היאvailable מהמחברים על פי דרישה.
      1. כפי שתואר בדיון, לפרוטוקול המעקב זוויתי המבוסס על ניטור (x, y), מקם אותה כמו כן, מומלץ להקליט את עקבות זמן שבו המגנטים הם לאט (בדרך כלל ב0.1 הרץ) מסובב על ידי מספר סיבובים. זה יאפשר אחד כדי להמיר במדויק קרטזיים (x, y) לקואורדינטות קוטביות (r, θ) באמצעות משוואות 3-5 של הדיון.
        הערה: תסריט MATLAB לסקריפט מעקב זוויתי המבוסס על ניטור (x, y), העמדה זמינה מהמחברים על פי דרישה.
        הערה: זמן המדידה תלוי בעיקר ברזולוציה המומנט הרצויה. טיעון מפורט נוסף מובא בLipfert et 24 אל. לחרוזי MyOne ו8 רצועות DNA kbp, מדידה ל30-100 שניות צריכים להיות מספיק כדי לתת רזולוציה מומנט בטווח של ~ 1 PN · ננומטר.
    4. לקבוע את הנוקשות של מלכודת הקימוט מהשונות דואר של תנודות זוויתי θ 2, ברדיאנים) באמצעות:
      k θ = k B T / σ θ 2 (1)
      הערה: stiffnesses מלכודת סיבובית הטיפוסי שהושג בMTT הוא בטווח של 10-1,000 pN · ננומטר / rad, נמוך יותר מאשר לפינצטה המגנטית קונבנציונלית.
    5. בנוסף, רשום את Z-המיקום של החרוז ולהשתמש בזה כדי לקבוע את אורך l לקשור (ראה גם צעדים 2.4-2.7).
    6. סובב N מסתובב ושוב להקליט θ (t) ואני (לא).
      הערה: הקשיחות מופחתת סיבוב המלכודת של MTT בהשוואה ל MT הופכת אותו מתאימה למידות של מומנט מולקולה בודד, אך מרמזת כי המומנט המרבי שיכול להיות מופעל הוא מופחת. משמעות הדבר הוא כי MTT ייתכן שלא תוכל להוות משקל נגד מומנטי גרירה גבוהים הנגרמים על ידי סיבוב מהיר. יש להקפיד ולכן לא יעלו את המהירות המרבית; לאypically לסובב בשיעורים קרובים ל0.1 הרץ.
    7. לקבוע את המומנט שנצבר ברצועת חומצות הגרעין לאחר N פונה באמצעות:
      Γ = - k θN - θ 0> (2)
      איפה <...> מציין את הממוצע וθ 0 וθ N הוא הזווית אפס התור (המקביל לרצועה torsionally רגועה, CF. צעד 2.3 וN מסתובב, בהתאמה.
    8. חזור על שלבים 4.5 ו4.6 לפי צורך על מנת לקבוע תגובת המומנט של מולקולה בטווח מדידה אחת (נציג תוצאות, איור 6) באופן מלא.

    Representative Results

    נציג תוצאות מMT (איור 1 א) מוצגות באיור 2. איור 2a מראה עקומות סיבוב הארכה לדנ"א 7.9 kb נלקח בF = 0.25, 0.5, ו2.0 PN. התגובה של דנ"א אחת לסיבוב צריכה להיות סימטרית בכוחות הנמוכים ביותר (0.25 PN), עם הסיומת של ה-DNA בירידה כתוצאה מהיווצרותם של supercoils plectonemic החיובי או שלילי. ידע איכותי של תגובה זו הוא שימושי כאשר בתחילה מחפש לקשור DNA מוגבל rotationally (שלב 2.1). שים לב כי בדיקה נוספת של הרצועה נדרש כדי לוודא שהוא מורכב ממולקולת דנ"א אחת: כאן, התגובה לא סימטרית של דנ"א יחיד לסיבוב בכוחות העולים על 0.5 pN מסייעת כדי להבדיל אותה מDNAs מרובה (צעד 2.1.1). ברגע שזה אומת, אחד חוזר לתגובה הסיבובית ב0.25 pN על מנת לקבוע את המספר המדויק של מגנט הופך בי אחת DNA iזה torsionally רגוע, שבו אחד לוקח עקומת כוח הארכה, שצריך להיות דומות לאיור 2 ב. למדידה המסוימת הזה, של הנתונים למודל דמוי תולעת השרשרת (קו מוצק) בכושר הניב C מצויד גובה אורך L = 2.71 מיקרומטר וכיפוף P = 45 ננומטר L אורך התמדה. לdsDNA, הערכים מצוידים באורך ההתמדה צריכים לשקר בננומטר 40-55 הטווח, בהתאם לתנאי החיץ 33, ואורך קווי המתאר המצויד צריך להיות קרוב (בדרך כלל תוך 10%) לשווי הצפוי למבנה ה-DNA ש משמש במדידות, תוך שימוש בדנ"א יחסי L = 0.34 ננומטר / נ"ב · מספר זוגות בסיסים.

    איור 3 מציג את ההליכים ותוצאות של יישור בFOMT (איור 1b). הטיולים הראשוניים (x, y) שנרשמו בשלב 3.2 ניתן להשוות לראייה הכוללת של תנודות כפונקצית oו עמדת המגנט רוחבית שמוצגת באיור 3 א, אשר מציג דפוס "מערבולת", שניתן להשתמש כדי להנחות את התזוזה היחסית הבאה בין המגנט והחרוז-DNA הקשור שנערך בFOMT. כאשר היישור גס שלאחר מכן הושלם, של חרוז (x, y), תנודות לאתר את מסלול מעגלי, כפי שמוצג גם על ידי העקבות השחורות באיור 3 ב. בשלב זה, המומנט מהמגנטים על ציר ה-z מצטמצם עד כדי כך שתנודות תרמיות להספיק כדי לסובב את חרוז סביב נקודת ההתקשרות שלו. מעגל R הרדיוס של annulus המעגלי וכתוצאה מכך (העיגול מצויד מוצג באדום) מייצג את המרחק הרדיאלי בין נקודת חיבור ה-DNA והמרכז של חרוז (איור 1b). כפי שניתן לראות באיור 3c, לעומת זאת, היסטוגרמה של הנתונים באיור 3 מראה כי יישור גס אינו מבטיח כיסוי אחידשל כל הפוזיציות אפשריות לאורך annulus המעגלי. למרות תנודות תרמית מספיקות כדי לחקור את כל זווית הסיבובים על המעגל, נותר מכשול קטן באנרגיה (מסדר גודל של B T k האנרגיה התרמי) לסיבוב חופשי.

    כאשר היישור עדין מתבצע בFOMT (שלב 3.4), המכשיר יכול לשמש כדי לקבוע מודולוס הקימוט של ה-DNA (איור 4). ראשית, יישור קנס של המדגם משמש להשגת תנועה מעגלית (איור 4 א) ששני ממדי היסטוגרמה צריך עכשיו להראות כיסוי אחיד (איור 4). Q המקביל זמן העקבות (t) של תנודות זוויתי (המתקבלות מהמרה של (x, y), עמדות, ראה בהמשך) לא מראה מחזוריות מתאימה ל360 (איור 4C) ˚ ומגלה טיולים גדולים המתאימים לכמה סיבובים מלאים (איור 4d). נוף האנרגיה משתמעהוא הרמוני על פני טווח של> 1,000 (4e איור) ˚. סטיית התקן של התנודות היא = 223 ° θ σ, המקביל לנוקשות מלכודת הזוויתי של k θ = k B T / σ θ 2 = 0.27 pN · ננומטר / רד, אשר בתורו נותן אומדן אורך התמדת הקימוט היעיל של ה-DNA שווה ל-C = C / σ θ 2 ~ 76 ננומטר L (C L = 1,150 ננומטר לדנ"א 3.4 kbp משמש במדידה זו) בכח הנמדד.

    דוגמא לאופן שFOMT ניתן להשתמש כדי למדוד את השינוי בטוויסט המושרה למולקולת ה-DNA הקשור באמצעות הקשירה של חלבונים ביום 31 ב, 34 מוצגת באיור 5. הנה, יש לנו פיקוח המחייב של חלבון RAD51 להכפילגדילי ה-DNA; RAD51 ידוע לשניהם להאריך ולהירגע DNA כפי שהיא מהווה נימה nucleoprotein ביום 31. לאחר שטיפת RAD51 לתזרים התאים, אנו צופים כי חרוז עובר מסלול מתפתל ב( איור 5 א) FOMT. על ידי המרת שמץ של תנועה (x, y) כפונקציה של זמן q (t) כפי שתואר לעיל, אנו יכולים לשתף עלילת ההשפעה שיש לכך על RAD51 אורך הרצועה-DNA ומידת התרתה (איור 5 ב, ג) .

    גישה חלופית למדידת תכונות הקימוט של ה-DNA הוא MTT (איור 1 ג, איור 6). סכמטי באיור 6 א ממחיש את העיקרון של המדידה: לאחר overwinding (או underwinding) לקשור-DNA על ידי N מסתובב, את ה-DNA מפעיל מומנט שחזור על החרוז שמוביל לשינוי במיקום הזוויתי שיווי המשקל מθ 0 עד N θ. בMTT הרכיב הרוחבי של שדה מגנטי מופחת לעומת MT, המאפשר מדידה של משמרות זוויתי כזה ועדיין מאפשר סיבוב חרוז (איור 1). סדר הגודל של השינוי הזוויתי נמדד לאחר יישום N = 45 פונה אל DNA 7.9 kbp מוצג באיור 6 ב. הרצף של פרוטוקול מדידת MTT ואת התוצאה של מומנט מול עקומת סיבוב עבור DNA וכתוצאה מכך המלא מוצג ב6c-f איור. כאן, מדידות של סטיית התקן (איור 6 ג) ו( 6d איור) הממוצע של זוויתי לתאם מוצגות כפונקציה של underwinding מעל ו, עם סטיית התקן להיות ביחס הפוך לנוקשות זוויתי המלכודת (המשוואה 1). יחדיו, כמויות אלה מאפשרים אחד כדי לבנות מומנט מול עקומת סיבוב עבור ה-DNA (6F איור), שצריך להראות אזור תגובה ליניארי מרוכז על 0 הופךnd שני מישורים שבו מרווית המומנט, בסיבובים חיוביים ושליליים, בהתאמה. כגון מומנט לעומת עקומת סיבוב משלים את המידע בהארכה מול עקומת סיבוב (6e איור), ובכך כימות המעברים המלווים את הקריסה וdenaturation של ה-DNA.

    איור 1
    איור 1. שרטוטים של פינצטה המגנטית הקונבנציונלית (MT), פינצטה המגנטית באופן חופשי, במסלול (FOMT), פינצטה מומנט מגנטי (MTT), ושתי אסטרטגיות למעקב אחר זווית סיבוב. (א) בכל שלושת היישומים של פינצטה המגנטית, חרוזים מגנטיים הם קשורים למשטח תא זרימה ידי מקרומולקולות פונקציונליות, למשל, מולקולות פעמיים גדילי דנ"א הראו באופן סכמטי. חרוזים התייחסות מחוברים אל פני השטח תא זרימה ומעקב לdrifתיקון לא. כל שלוש להגדיר קופצים MT להעסיק מגנטים ליישם כוח מתיחה כלפי מעלה בחרוז המגנטי, ולכן לקשור DNA. בMT הקונבנציונלי, זוג המגנטים מפעיל שדה מגנטי שמכוון באופן רוחבי יחסית לציר הרצועה, בחוזקה מגבילים רוטציה של חרוז סביב ציר ה-DNA רצועה. בFOMT, מגנט cylindrically בצורת מספק שדה מגנטי שאורינטציה לאורך כיוון הרצועה. כאשר הרצועה מיושרת למרכז המגנט cylindrically בצורת, כל שדות רוחביים שנותרו הם מזעריים, המאפשרים סיבוב חופשי על הציר לקשור בMTT, מגנט צד נוסף למגנט בצורת cylindrically משמש בFOMT על מנת לספק שדה קטן רוחבי (מופחת בגודל בהשוואה ל MT). שדה רוחבי קטן זה מאפשר היישום של מומנט, כמו גם המדידה שלה. (ב) שתי אסטרטגיות כדי למדוד את זווית הסיבוב של חרוז מגנטי על ציר ה-DNA לקשור מוצגות. 1): חרוז סמן (Green) מצורף לחרוז המגנטי (חום) נותן תמונה סימטרית המאפשרת זווית מעקב על ידי לדמיין ניתוח. שתי תמונות CCD של חרוז מגנטי 1.4-מיקרומטר-רדיוס עם סמן fiducial 0.5-מיקרומטר-רדיוס מוצגות, בפוקוס ומחוץ לפוקוס. 2): כאשר ה-DNA הוא קשור אל חרוז המגנטי בעמדה הרחק מהקוטב הדרומי של חרוז, במרכז חרוז נע לאורך קשת שמרכזה מגדיר מיקום הזוויתי. כך או אסטרטגיה יכולה להשתמש בהם כדי לעקוב אחר זווית סיבוב ולעקוב אחר שינויים במצב הזווית כרצועה היא מתוחה torsionally (עקבות בצד הימין), ובכך מאפשרת מדידות של מומנט מולקולה בודד.

    איור 2
    מדידות איור 2. כיול ה-DNA בMT הקונבנציונלי. (א) עקומות סיבוב הארכה לדנ"א 7.9 kb נלקח בF = 0.25, 0.5, ו2.0 PN. התגובה סימטרית תחת סיבוב לתורו חיובי והשלילי של רצועות גדילי הדנ"א כפולות יחידה יכולה לשמש כמבחן נוח של הקובץ המצורף הרצועה. (ב) עקומת כוח הארכה לדנ"א kb 7.9, יחד עם לכושר התולעת כמו מודל שרשרת (קו מוצק), מניב C L מצויד גובה אורך = 2.71 מיקרומטר וכיפוף P L אורך התמדה = 45 ננומטר. כל המדידות בוצעו בחיץ PBS.

    איור 3
    איור 3. יישור בFOMT. (א) (x, y) תנודות של חרוז-DNA הקשור שנערכו בFOMT כפונקציה של מיקום מגנט. העמדה של המגנט הגלילי נסרקה בגובה קבוע של 3 מ"מ על פני תא זרימה בשלבים של 250 מיקרומטר x ו (x, y) דפוס תנודות עם עמדת מגנט דומה לציקלון או מערבולת הן נראות לעין. דפוס "מערבולת" זה יכול לשמש מדריך לעקירתם של המגנט (או לחלופין לקשור תוך שמירה על המגנט הקבוע) בx ו-y (מסומן על ידי החיצים הגדולים) כדי להשיג יישור. כאשר היישור גס הוא מוחלט, של חרוז (x, y), תנודות לאתר את מסלול מעגלי (זכר כחול במרכז העלילה). עקבות זה שנרשמה בניסוי נפרד לאחר יישור המגנטים בצעדים קטנים יותר על המרכז ומוצג להמחשה בחלקה זו. (ב) (x, y), תנודות של חרוז-DNA הקשור נערך בשנת tהוא FOMT לאחר גס יישור מוצלח של המגנט (זכר שחור). התנודות לשכב על annulus מעגלי ותנודות תרמית מספיקות כדי לחקור את כל הסיבובים זוויות במעגל. מעגל מצויד מוצג באדום. (ג) היסטוגרמה מתאימה לנתונים ב( ב), שהראה כי יישור גס אינו מבטיח כיסוי אחיד של כל העמדות אפשריות לאורך annulus המעגלי. למרות תנודות תרמית מספיקות כדי לחקור את כל זווית הסיבובים על המעגל, יש עדיין מחסום אנרגיה (על בסדר גודל של B T k האנרגיה התרמי) לסיבוב חופשי.

    איור 4
    איור 4. מדידה של קשיחות קימוט ה-DNA באמצעות FOMT. (X, y) מסלול (א) והיסטוגרמה (ב) לDNA-טיתered התנודות של חרוז לאחר יישור הקנס של מיקום מגנט-לקשור היחסי בFOMT. בנסיבות אלה, היסטוגרמה מגלה כיסוי מהות אחיד של העמדות על המעגל. (ג) תנודות סיבובית של חרוז נקבע מ( x, y)-העמדות. (ד) היסטוגרמה של תנודות סיבוב. הקו האדום הוא גאוס כושר עם ° θ = 223 σ. נוף האנרגיה משתמע מצפיפות סיבוב תנודות מ( ג) ו (ד) (ה). ההבדל בין נוף האנרגיה משתמע מהתנודות הסיבוביות וקירוב הרמוני (עם k = θ k B T / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad) הוא הרבה יותר קטן מאשר ב 'T k אנרגיית התרמית על מספר סיבובים. נתונים מקוזזים לבהירות כזאת, כי θ 0 = 0. הרוחב שלהתנודות יכולות לשמש כדי לקבוע את נוקשות קימוט של ה-DNA, ראו טקסט עיקרי. המדידה בוצעה בחיץ PBS בכוח מתיחה של ~ 1 PN. הנתונים מעובדים מLipfert אח' 21.

    איור 5
    איור 5. מחייב של חלבון RAD51 ל-DNA נמדד באמצעות FOMT. (א) אסיפה של חלבון RAD51 על 7.9 kbp dsDNA קשור במעקב ב3.5 PN. (X, y, z) המסלול שבוצע על ידי חרוז המגנטי (מ"מ 1.0 קוטר) במהלך 200 שניות הראשונות של ההרכבה מוצג, עם זמן בצבעים מכחול לאדום. (ב) שלוחה של dsDNA להסיק מZ-הרכיב של מסלול חרוז ב( א) כפונקציה של זמן. (ג) זווית הסיבוב על הציר לקשור dsDNA להסיקמx, y רכיבים של מסלול חרוז ב( א) כפונקציה של זמן.

    איור 6
    איור 6. מדידות מומנט ברצועת דנ"א יחידה בMTT. (א) סכמטי המציג את העיקרון של מדידת המומנט. לאחר פירוק מעל (או מתחת) את רצועת ה-DNA על ידי N מסתובבת, את ה-DNA מפעילה מומנט שחזור על החרוז שמוביל לשינוי במיקום הזוויתי שיווי המשקל מθ 0 עד N θ. דוגמא (ב) לעקבות זווית משמשות כדי למדוד את המומנט:. תנודות הזוויתי של חרוז קשור למולקולת ה-DNA 7.9 kbp torsionally רגועה לפני (כחול) ולאחר החדרת 40 תור (אדום כהה) מדידה (CF) מומנט פיתול על מולקולת ה-DNA 7.9 kbp בPBS חיץ שנערכה בstלהקיא כוח ~ 3 pN באמצעות חרוז הסמן fiducial מבוססת פרוטוקול מעקב זוויתי. תנודות זוויתי כפי שמוצג ב( ב) נרשם כפונקציה של מספר הסיבובים מיושמים. (ג) סטיית התקן של תנודות זוויתי כפונקציה של תורות מיושמות. הרוחב של התנודות הוא כ קבוע, המצביע על קשיחות מלכודת זוויתית קבועה. (ד) השינוי בזווית הסיבוב הממוצעת כפונקציה של תורות מיושמות. משמרות שיטתיות של הזווית הממוצעת על underwinding יתר והם נראים לעין. (ה) ההארכה לקשור DNA לפקח בו זמנית כפונקציה של תורות מיושמות. (ו) המומנט המופעל על ידי לקשור DNA נקבע מהזווית הממוצעת שמוצגת ב( ד) , ראה טקסט עיקרי. מעל וunderwinding סביב אפס פונה מוליד לעומת מומנט יניארי הופך תגובה של ה-DNA-לקשור (יון מדרונות אפורים מצוידים (ד) (ו)), שניתן להשתמש כדי לקבוע את אורך התמדת הקימוט האפקטיבי (~ 77 ננומטר למערך נתונים זה). בהמשך overwinding מוביל לקריסה והיווצרות supercoils plectonemic (באופן סכמטי מוצג בריבועים), המקביל למישור מומנט (קו שחור בתורו החיובי ב( ו) ב ~ 26 pN · ננומטר) וירידה ליניארית של ההארכה לקשור עם מספר סיבובים (מדרון שחור ב( ה)). ההתרה מעבר למשטר ליניארי גורמת DNA כדי להמס באופן מקומי (שמוצג בריבועים משמאל), המתאפיין ברמת מומנט שווה למומנט ההיתוך (קו שחור בתורו השלילי ב( ו) ב ~ -11 pN · ננומטר).

    Discussion

    בעת הרצת ניסויים באמצעות MTT או FOMT, מספר אפשרויות צריכה להתבצע לגבי חרוזים, מגנטים, פרוטוקולי מעקב, וכו 'האפשרויות הטובות ביותר להתבצע יהיו תלויות בניסוי של עניין. בהמשך, אנו מתארים את הפשרות המלוות את הבחירות שונות, מה שאמור להקל על בחירה בניסוי מסוים. בשלב הבא, אנו מתארים מספר שלבים קריטיים שמלווים את היישור והפעלה של ניסויי MTT וFOMT. לבסוף, אנו דנים במשמעות של MTT וFOMT ביחס לשיטות קיימות, כמו גם יישומים עתידיים.

    שיקולים לפני התחלת ניסויי MTT וFOMT

    כל ניסוי דורש מהם לבחור סוג של חרוז מגנטי לשימוש. אפשר לבחור בין כמה חרוזים, זמינים מסחרי streptavidin המצופה פאראמגנטי, למשל, 0.25 מיקרומטר חרוזים רדיוס, 0.5 מיקרומטר חרוזים רדיוס, או 1.4 מיקרומטר חרוזים רדיוס (יםee שולחן חומרים). חרוזים גדולים יותר יהיו לי מומנט מגנטי מוגבר בהשוואה לחרוזים קטנים יותר (בערך קנה מידה כמו הנפח), ולכן השימוש בם יקל על היישום של כוחות גבוהים יותר (עבור כוחות טיפוסיים שהושגו במכשירים שלנו, ראו טבלה 1). כאשר מעקב זוויתי באמצעות חרוזים סמן הוא רצוי, אנחנו בדרך כלל עובדים עם 1.4 מיקרומטר רדיוס ולהשתמש 0.5 חרוזים biotinylated אינם מגנטיים מיקרומטר רדיוס כחרוזי סמן (ראה סעיף 1.9 לפרוטוקול המצורף המקביל). השימוש בחרוזים קטנים יותר מומלץ במיוחד לFOMT, כמו לוח הזמנים האופייניים לτ סיבוב חרוז C שווה את היחס של גרור של המערכת לאורך θ γ / k שלה באביב הקבוע; חשוב מכך, מקדם הגרר סיבובי הרלוונטי לקשקשים בקנה מידה זמן מדידת זוויתי כ~ R חרוז 3, דהיינו עם הכוח השלישי של הרדיוס (ראה טבלה 2 עבורהזמן האופייני מאזניים לכמה שילובי חרוז-DNA בFOMT ומדידות MTT). ירידות מלווה בכח המקסימאלי שניתן ליישם ניתן לטפל על ידי שימוש במחסנית התהפכה של מגנטים גליליים 27. יחד עם זאת, במדידות FOMT זה עשוי לעתים להיות הכרחי לפשרה בין הרזולוציה הטובה ביותר להשגה הזמן והכוח ליישם המרבי.

    בנוסף, ניסוי מחייב את הבחירה של תצורת מגנט. בתצורת פינצטה מגנטית הקונבנציונלית (איור 1 א), אנו משתמשים בדרך כלל זוג מגנטים מעוקב 5x5x5 מ"מ בכיוון אנכי עם פער 0.5 או 1 מ"מ בין המגנטים 4. כאשר המגנטים במרווחים לאורך ציר x (y), זה מניב שדה מגנטי שמכוון בעיקר לאורך ציר x (y). עבור ניסויי FOMT, מגנט cylindrically בצורת נבחר שבמרכזה השדה המגנטי מופנה בעיקרלאורך ציר z (איור 1b). בפועל, אנו משתמשים בערימה של שלושה מגנטים כאלה cylindrically בצורת, כל אחד בקוטר של 6 מ"מ וחור מרכזי בקוטר 2 מ"מ, לעובי כולל של 6 מ"מ. כאשר כוחות משיכה גבוהים יותר הם רצויים, תצורת מגנט "ערימה התהפכה" שבו המגנט התחתון הוא נערם עם המגנטיזציה ההפך היא מועדפת. כדי להשיג את תצורת MTT (איור 1 ג'), אנו מוסיפים מגנט נוסף לצד ערימת המגנט העיקרי של תצורת FOMT, בדרך כלל צילינדר סולידי עם 4 מ"מ קוטר וגובה של 7 מ"מ. כדי לראות כיצד הכוחות מקסימאלי שהושגו במכשירים שלנו תלויים בתצורת המגנט, ראה טבלת מס '1.

    המערך של ניסויי MTT וFOMT

    מאז יש לי חרוזים מגנטיים משטח אחיד פונקציונליות (כ) (בדרך כלל streptavidin) ומאז החיבור של שני n פונקציונליותרצועות חומצת ucleic וחרוזים סמן (במקרה של המעקב זוויתי מבוסס חרוז הסמן מועסק) מתרחש דרך דגירה פשוטה בתמיסה, אחד לא שולט בו הרצועה ו / או חרוז סמן לצרף חרוז המגנטי. יש חרוזים המגנטיים ציר המגנטיזציה העדיף שנוטה ליישר לאורך כיוון השדה החיצוני. אם נסמן את הנקודות שבן ציר המגנטיזציה העדיף מצטלב פני השטח של חרוז כקטבי צפון ובדרום, ולאחר מכן חרוזים שבו את ה-DNA-לקשור מצורף קרוב לקו המשווה יהיו לאתר את annulus מעגלי ברדיוס קרוב או מעט גדולה יותר רדיוס חרוז בFOMT; בניגוד לכך, חרוזים המחוברים קרוב לקוטב הדרומי ינוע על annulus מעגלי עם רדיוס קטן מאוד בFOMT, אשר יכול למנוע הולם של המעגל באמצעות משוואות 3-5. נציין, כי בגיאומטריה כדורית פשוטה, ההסתברות של הצמדת ליד קו המשווה היא הרבה יותר גדולה מאשר קובץ מצורף בדיוק בקטבים; לכן, רוב בEADS יהיה קשור כך שהמעקב זוויתי מבוסס (x, y) יכול להתבצע בהצלחה.

    טענה דומה מחזיקה עבור הקובץ המצורף של חרוזים הסמן למעקב הזוויתי הסמן המבוסס fiducial. חרוז הסמן משמש ליצירת סימטריה בתמונה של חרוז המגנטי המאפשר מעקב זווית. אם חרוז הסמן מצורף בדיוק בקוטב הצפוני או דרומי של חרוז (כלומר ישירות על החלק העליון או בחלק התחתון), התמונה המתקבלת היא עדיין rotationally סימטרי ופרוטוקול המעקב זוויתי נכשל. עם זאת, על ידי אותו טיעון הגיאומטריה הכדורי, הסיכוי לחרוז סמן לצרף ישירות באחד מהקטבים הוא קטן יחסית; אנו מוצאים כי בפועל רוב חרוזים סמן נותנים סימטריה מספיק כדי לאפשר מעקב זוויתי. לבסוף, נציין, כי בפינצטה המגנטית הקונבנציונלית כיוון השדה הוא ב( x, y) המטוס; לכן, ציר המגנטיזציה המועדפת של חרוז יהיה ליישר בהדואר (x, y) מטוס והקוטב הצפוני והדרומי, כהגדרתם לעיל, הם הולכים להיות בצדדים של חרוז, לא סביר שהמצב בFOMT או MTT, שבו הקטבים נמצאים בחלק העליון והתחתון.

    בניסויי FOMT, שלב קריטי הוא היישור של המגנט הגלילי כך שהשדה המגנטי רדיאלי הוא זניח בסמיכות לחרוז. יישור זה מתבצע עבור חרוז אחד בכל פעם. כדי לשפוט אם תנועת חרוז בFOMT מופצת באופן שווה על פני annulus מעגלי, זמן המדידה יעלה על 20 · C τ. כC τ שווה ~ 45 שניות ל8 DNA kbp וחרוז רדיוס 0.5 מ"מ, זמן המדידה הוא ~ 900 שניות בשלבים הסופיים של יישור. לשם השוואה, שימוש ב1.9 DNA kbp ו0.25 חרוזים רדיוס מ"מ מפחיתה ל~ 2 שניות עשרים וקיפול C τ (ראה גם טבלה 2).

    שלבים קריטיים ושיקולים למעקב במהלך Fניסויי OMT וMTT

    כדי לעקוב אחר חרוז של תנודות במטוס, כלומר שלה (x, y), עמדה, אנחנו מעסיקים ניתוח מתאם צולב של פרופילי עוצמת המוצגים על ידי חרוז במרווחי זמן שלאחר מכן 35, 36. זה יכול להתבצע ברזולוציה תת פיקסלים ברמת דיוק של ננומטרים ספורים 20. כדי לעקוב אחר התנועה של חרוז בz, אנחנו בדרך כלל להשתמש בשיטה תוכננה לראשונה על ידי גוסה וCroquette, שבמישור המוקד של האובייקטיבי (OFP) הוא עבר באופן מדויק בכיוון האנכי תוך ההדמיה טבעות דיפרקציה של חרוז מצורף חומצות גרעין 20 . באופן זה, פרופיל כיול נוצר קישור בין התבנית העקיפה של חרוז למרחק בין חרוז וOFP 19. כאשר פרופיל כיול זה אינטרפולציה, התקות אנכיות של חרוז יכולות להיות גם נמדדות עם דיוק של עד כמה 20 ננומטר.אנו מפנים את הקורא לאזכור נוסף המתארים אלגוריתמים מעודנים יותר מעקב 37, 38 כמו גם היישום שלהם במקביל למעקב של חרוזים מרובים 5, 6, 37.

    בעת שימוש במעקב זוויתי שמסתמך על המרה של (x, y), עמדות לקואורדינטות זוויתי, אנו מייעצים לך להמשיך באופן הבא. מעקבות זמן שבו חרוז עקבות החוצה annulus מעגלי, השתמש (x i, y i) עמדות (שבו המדד אני מציין נקודות מדידה שלאחר מכן) כדי להתאים את מרכז המעגל (x 0, y 0) ו R רדיוס המעגל (איור 2 א) על ידי צמצום:

    (3)

    שבו הסכום רץ על כל נקודות הנתונים. לאחר fitting x 0, y 0, ומעגל R, לקבוע את הקואורדינטות קוטביות (r i, θ i) של כל נקודת נתונים במעקב הזמן באמצעות:

    (4)

    (5)

    שים לב שאחד צריך לדאוג "לגולל" θ הזווית, כלומר להוסיף קפיצות שלב של ± π מקום שמתאים. קוד מותאם אישית שנכתב עבור הולם והמרה מ (x, y) ל( r, θ) מרכז זמין מהמחברים על פי דרישה. בFOMT, ניתן להשיג זמן עקבות שבחרוז עקבות החוצה annulus חוזר עד להשגת יישור גס (שלב השווה 3.3) והקלטת תנודות תרמיות של חרוז. בMTT, fluctu התרמיתations אינם מספיק כדי לאתר את annulus המעגלי; במקום זאת, השתמש עקבות זמן שבו המגנטים הם לאט (בדרך כלל ב0.1 הרץ) מסובבים על ידי מספר סיבובים כדי להתאים את המעגל באמצעות משוואות 3-5.

    נציין, כי לMTT, חשוב לבחור את הגישה הנכונה זוויתי מעקב, כלומר באמצעות סמן מעקב זוויתי (איור 1 ג, 1D איור, איור 3 א) או באמצעות המרה של (x, y), עמדות לקואורדינטות זוויתית ( 1D איור, איור 2b). אמנם בדרך כלל בדיוק של המעקב הזוויתי מ( x, y), עמדות והשימוש בחרוזי סמן דומים, זה חשוב להבין crosstalk המתרחש בין התנודות של חרוז ב( x, y) ובזווית, כמתואר ב Janssen et al 32: וכך, מעקב זוויתית מ( x, y)-עמדות תקף אך ורק בתנאי שהתנודות בראונית ב( x, Y) רק תורם זניח לחוסר הוודאות בזוויתי לתאם, והשימוש הנכון שלה (x, y) מעקב עשוי לדרוש כוונון של קשיחות המלכודת הסיבובית באמצעות התאמה של המיקום של מגנט הצד. בדרך כלל, השימוש במלכודת קשיחות גבוהה יותר מחייב שימוש במעקב זוויתי באמצעות חרוזים סמן. השימוש בחרוזי סמן דורש צעד מצורף נוסף, אשר עשוי להפחית את מספר רצועות שמישים (ראה הפרוטוקול המצורף בשלב 1.9). בעת השימוש במעקב מבוסס חרוז הסמן, חשוב לבחור חרוזים מגנטיים שבו יש חרוז סמן מצורף ליד קו המשווה לתוצאות הטובות ביותר.

    משמעות של FOMT וMTT התייחסות להשוואה לשיטות ויישומים קיימים

    בדוגמה למעלה, שהראינו איך, יכול החל מMT הקונבנציונלי, בקלות לשנות את תצורות המגנט כדי להמיר את המכשיר לMTT או FOMT. מ 'זה פשוטodification, אשר עשוי להיות מלווה על ידי ההקדמה של מעקב הזוויתי כאשר השימוש בסמן מעקב הזוויתי הוא רצוי, היא נקודה חזקה מיידית של שני התצורות, כפי שהוא מאפשר למשתמש להפעיל את המומנט, מודד מומנט, או למדוד טוויסט בהתאם להתנסות בהישג היד. כפי שהוזכר במבוא, שני FOMT ותועלת MTT מרב של נקודות החוזק הקיימות של MT, בעיקר הפשטות שלהם, עם MTT בפרט גם נהנה מהיכולת של מדידות במקביל 5, 6 (אלה לא הושגו בקלות בFOMT ניתנו הדרישה של יישור של הרצועה ביחס למרכז של המגנט הגלילי). יש לציין, MTT וFOMT אינם דורשים, בניגוד לשיטות אחרות, במיוחד חלקיקים מפוברק ננו 22, 39, 40, תכנון אופטי מורכב 41, או את ההקדמה של חרוזים נוספים בתוך מולקולה הקשור 42 (DNA). כזו oטכניקות יס עשויות בכל זאת לספק יתרונות אחרים, כגון רזולוציה גבוהה יותר זמנית 27, 43, 44. שני FOMT וMTT צריך למצוא יישומים עתידיים בחקר הגנום עיבוד, כמו ההתנהגות של מנועים מולקולריים על ה-DNA היא גם מושפעת ויש לו השלכות על טוויסט המקומי ומומנט. ניתן למצוא יישומים נוספים בתחום המתפתח של ננוטכנולוגיה DNA 27 או בתחום הרחב יותר של מנועים סיבוביים פעילים בטיפול ביולוגי 7, 45.

    M270 (חרוז R = 1.4 מיקרומטר) MyOne (חרוז R = 0.5 מיקרומטר) Ademtech (חרוז R = 0.25 מיקרומטר)
    הקונבנציונלי MT (זוג של 5 X 5 X 5 מ"מ 3 מגנטים מעוקב, פער של 1 מ"מ, יישור אנכי) 70 pN 8 pN 1.6 pN
    FOMT או MTT * (ערימה של שלושה מגנטים גליליים, 6 מ"מ קוטר, 2 פער מ"מ קוטר) 9 pN 1 PN 0.2 pN
    FOMT או MTT * (ערימה של שלושה מגנטים גליליים, 6 מ"מ קוטר, פער בקוטר 1 מ"מ) 18 pN 2 pN 0.4 pN
    FOMT או MTT * (ערימה של שלושה מגנטים גליליים עם האחרון התהפך, פער בקוטר 1 מ"מ) ~ 50 pN 9 pN 1.8 pN

    * הנוכחות של צד המגנט הקטן בMTT יש השפעה זניחה על כוח המתיחה

    טבלת 1. כוחות מרביים מושגת בדרך כלל לתצורות מגנט שונות וסוגי חרוז.

    חרוז R = 1.4 מיקרומטר חרוז R = 0.5 מיקרומטר R = חרוז0.25 מיקרומטר
    מקדם חיכוך * 120 pN · שניות ננומטר · 5.5 pN · ננומטר · שניות 0.7 pN · ננומטר · שניות
    ציר זמן אופייני: FOMT, DNA kbp 10 ** 1200 שניות 55 שניות 7 שניות
    ציר זמן אופייני: FOMT, DNA kbp 1 120 שניות 5.5 שניות 0.7 שניות
    ציר זמן אופייני: MTT, ש k = 100 pN · ננומטר / rad 1.2 שניות 0.06 שניות 0.007 שניות
    ציר זמן אופייני: MTT, ש k = 1000 pN · ננומטר / rad 0.12 שניות 0.006 שניות = 6 אלפיות שני 0.0007 של = 0.7 msec

    * מקדם חיכוך לסיבוב על ציר דרך "קו המשווה" (כלומר המצב שמוצג באיור 1b), שניתן על ידי 14 · p · h · R חרוז 3, שבו שעות היא הצמיגות של המאגר.
    ** בFOMT, נוקשות מלכודת סיבוב נתון על ידי נוקשות קימוט של ה-DNA, ש k, ה-DNA = C · T / C k B L, כאשר C הוא אורך התמדת הקימוט היעיל, הניח להיות 80 ננומטר כאן ( המאפיינת את משטר בכוח ביניים, F ~ 1 PN) ו-C L הוא אורך קווי המתאר של ה-DNA, 0.34 ננומטר לכל זוג בסיס.

    טבלה 2. מקדמי חיכוך וזמן אופייני מאזניים לFOMT וMTT.

    Disclosures

    פטנט הקשור לעבודה זו כבר הגיש תחת PCT/NL2011/050446 התייחסות.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי TU Delft, ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO), הקרן למחקר בסיסי בעניין, ועל ידי קרן המדע האירופית.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
    2. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
    3. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
    4. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
    5. Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
    6. De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
    7. Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
    8. Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
    9. Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
    10. Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
    11. Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
    12. Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
    13. Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
    14. Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
    15. Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
    16. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
    17. Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
    18. Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
    19. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. Springer. (2009).
    20. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
    21. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
    22. Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
    23. Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
    24. Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
    25. Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. 102 (2009).
    26. Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82, (12), (2011).
    27. Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
    28. Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
    29. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
    30. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
    31. Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
    32. Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
    33. Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
    34. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
    35. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
    36. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
    37. Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
    38. Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
    39. Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
    40. Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
    41. La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
    42. Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
    43. Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
    44. Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
    45. Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).
    מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).More

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter