磁気ピンセット、強力な単一分子操作技術は、生体高分子で(磁気トルクピンセットと呼ばれる構成を使用して)およびトルク(磁気ピンセットを自由に旋回と呼ばれる構成を使用して)ツイストを直接測定するように適合させることができる。このような測定を行うためのガイドラインは、DNAおよび関連する核 – タンパク質フィラメントの研究への応用を含めて、与えられる。
単一分子技術は、リアルタイムで、溶液中の個々の生物学的分子の挙動を調査することを可能にする。これらの技術は、原子間力顕微鏡などのいわゆる力分光法のアプローチは、光ピンセット、延伸流れ、磁気ピンセットが含まれる。これらのアプローチの中で、磁気ピンセットは、一定の伸縮力を維持しつつトルクを付与する能力によって自分自身を区別している。ここでは、図示されている方法、例えば「従来型」の磁気ピンセットの実験構成は、横方向磁場の大きさを最小にする、そのフィールド構成の簡単な改変により、生物学的分子のねじれの程度を測定するように構成することができる。結果の設定は自由に周回磁気ピンセットと呼ばれる。さらに、それはフィールド構成のさらなる変更は&#との中間大きさの横のフィールドを得ることができる方法を紹介している8220;従来の「磁気ピンセット、それが可能で直接生体分子に記憶されたトルクを測定することができる自由に旋回磁気ピンセット。この構成は、磁気トルクピンセットと呼ばれる。付属のビデオは自由に軌道磁気ピンセットや磁気トルクピンセットに従来の磁気ピンセットの変換を行うことができる方法を詳しく説明し、これらの技術の使用方法を示します。大幅にこの強力な機器の汎用性を拡大しながら、これらの適応は、従来の磁気ピンセットのすべての長所を維持します。
近年では、単一分子技術は、それらの動力学および基礎となるメカノへの洞察を得プロセッシブモータータンパク質および他の酵素の研究において、その幅広い適用性が証明されている。力分光法の文脈において、重要な貢献は、原子間力顕微鏡の流れ延伸し、光および磁気ピンセットによってなされている。光学および磁気ピンセット(MT)は、特に、高い空間分解能と時間分解能で分子操作の面で優れた柔軟性を組み合わせることに成功しました。ここでは、表面と超常磁性ビーズ1-3の間でつながれ、生物学的分子にストレッチ力とトルクの両方を適用することができる、モンタナ州に焦点を当てています。
磁気ピンセット(MT、 図1a)は、機械的核酸の性質ならびにタンパク質との相互作用の両方を監視するために使用されてきた非常に汎用性の単一分子技術である。 MTは、多くの強度を有する実験的な実装の 全体的なシンプルさと堅牢性、一定の力モード4、並列測定が5の拡張で、6、サンプルを加熱し、光損傷がない場合のトルク、自然な操作と簡単なキャリブレーションの容易なアプリケーションを含む、S、。他の単一分子アプローチと比較して、MTは≈10 fNの程度の低い力での力依存性測定を実行し、率直に超らせんの程度を制御する能力を有する方法を提供する。 MTは、主に核酸の7,8関与する生物学的プロセスを調査するための実験ツールとして使用されてきたが、それらはまた、タンパク質または9-13セル10、14-17の機械的特性の研究に応用されている。数々の有用な参照は、MT 4、18〜20をビルドして実行する方法について説明し、利用可能である。
HowevER、従来のMTは、彼らがトルクをかけながら、彼らは直接トルクを測定しない、直接回転運動を追跡し、しないでください。さらに、それらは、核酸テザーの自由回転を拘束する。ここでは、マグネットピンセットの2つの拡張を提示する。最初は、自由に旋回磁気ピンセット(FOMT、 図1b)21 と呼ばれる、テザー軸周りの回転運動を制限することなく、平衡角度変動や係留核酸分子のねじれの変化の測定を可能にする。第二に、直接適用され、単一の生体分子22-27に力およびトルクの両方を測定する能力を有する磁気トルクピンセット(MTT、 図1c)を 、と呼ばれる。
以下のプロトコールでは、読者が彼/彼女の処分で「従来の」MT器具を有することを前提。我々はセットアップし、MTをビルドして実行する方法についての参照のための検討を読者だけでなく、consideを参照してください。磁性ビーズは、磁石、及び追跡ルーチンの選択において考慮しなければならない飼料。また、議定書のテキストのセクション1と2は、我々は一般的に、MTで使用するためのDNAサンプルだけでなく、従来のMTに単一のDNAに対して実行できる予備測定を準備し、インキュベート方法について説明します。プロトコルのテキストの表示部3,4は、MT器具は容易に適合さFOMTおよびMTT測定のために使用することができる方法を示す。
MTTまたはFOMTを用いた実験を実行する場合は、選択肢の数が行うべき最良の選択肢は、関心のある実験に依存することになるビーズ、磁石、トラッキングプロトコル、等に関して行う必要がある。以下では、特定の実験のための選択を容易にするべきか、さまざまな選択肢を伴うトレードオフについて説明します。次に、我々は、MTTとFOMT実験のアライメントおよび実行に伴ういくつかの重要な手順について説明します。最後に、我々は既存の方法に関しては、MTTとFOMTの意義だけでなく、将来のアプリケーションについて説明します。
以前は、MTTとFOMT実験開始への考慮
いずれの実験では、使用するために磁気ビーズの種類を選択する1が必要です。一つは、 例えば 、いくつかの市販のストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性ビーズの間で0.25μmの半径ビーズ、0.5μmの半径ビーズ、1.4μmの半径ビーズ(Sを選択することができます)材質テーブルは、EE。より大きいビーズはより小さいビーズ(およそボリュームとしてスケーリング)と比較して増加した磁気モーメントを有し、従って、それらの使用は、より高い力(我々の器具で達成典型的な部隊で、 表1を参照)の適用を容易にする。マーカービーズを使用して、角度の追跡が必要なとき、私たちは一般的に1.4ミクロン径で動作し、(対応するアタッチメントプロトコルの段落1.9を参照)が0.5μm半径マーカービーズのような非磁性ビオチン化ビーズを使用しています。ビーズ回転τCに特徴的な時間スケールは、そのばね定数γ/ Kθを介してシステムのドラッグの比率に等しいように小さいビーズの使用は、特に、FOMTをお勧めします。重要なことには、〜R ビード 3、 すなわち半径の3乗と同様に角度測定の時間スケールスケールに関連する回転抗力係数( 表2を参照特性時間)はFOMTおよびMTT測定で複数のビーズのDNAの組み合わせに対してスケールします。適用することができる最大の力の減少は、添付の円筒状磁石27のフリップスタックを使用することによって対処することができる。それにもかかわらず、FOMT測定で、時には最高の達成可能な時間分解能と最大印加力と妥協する必要があるかもしれない。
さらに、実験は磁石構成を選択する必要があります。従来の磁気ピンセット構成( 図1a)では、我々は通常、磁石4の間に0.5または1ミリメートル間隔で垂直方向に5×5×5ミリメートルの立方一対の磁石を使用しています。磁石をx(y)軸に沿って配置されているとき、これは主に、×(y)軸に沿って導かれる磁界を生じる。 FOMT実験のために、円筒形の磁石をその中心磁場が主に向けられている時に選択されるz軸に沿った( 図1b)。実際には、我々は6mmの厚さの合計のために、3つのこのような円筒状のマグネット、6mmの直径および2mmの直径の中心穴を有する各々のスタックを使用する。高い引張力が望まれる場合には、底部磁石が反対の磁化とが積層された「フリップスタック」磁石構成が好ましい。 MTT構成( 図1c)を達成するために、我々は、FOMT構成、直径4mmと7mmの高さが典型的に円柱の主磁石スタックの側面に付加的な磁石を加える。私たちの楽器で達成される最大の力が磁石構造にどのように依存するかを確認するには、 表1を参照してください。
MTTとFOMT実験のアラインメント
磁気ビーズ(約)を均一に官能面を持っているので(通常はストレプトアビジン)及び官能Nの両方の取り付け以降ucleic酸テザーとマーカービーズ(ケースにマーカービーズベースの角度トラッキングが採用されている)を溶液中での単純なインキュベーションを介して起こるテザーおよび/またはマーカービーズ、磁気ビーズに付着した場合、1は制御しません。磁気ビーズは、外部磁場の方向に沿って整列する傾向が好ましい磁化容易軸を有している。我々は、好ましい磁化軸がN極とS極のようなビーズの表面と交差する点を示している場合は、DNA-テザーが近い赤道に接続されているビーズは、に近いかよりもわずかに大きい半径の円形の環状部をトレースしますFOMTビード半径;対照的に、南極に近い取り付けられたビーズは、式3-5を用いて、円のフィッティングを排除することができる、FOMT非常に小さい半径の円形の線維輪に変動します。我々は、単純な球面形状によって、赤道付近で取り付ける確率が正確に極での添付ファイルよりもはるかに大きいことに注意してください。したがって、ほとんどのBEADSは、係留される(x、y)に基づく角度トラッキングが正常に行うことができるようになっている。
同様の議論は角追跡を基に基準マーカーに対するマーカービーズの取り付けのために保持している。マーカービーズは、角度の追跡を可能にする磁気ビーズの像の非対称性を生成するために使用される。マーカービーズ( すなわち 、直接上に置くか、底の)ビーズのN極またはS極に正確に接続されている場合は、結果の画像はまだ回転対称であり、角のトラッキングプロトコルが失敗します。しかし、同じ球形引数によって、マーカービーズ極の1で直接接続するためのチャンスは比較的小さい。私たちは、実際には、ほとんどのマーカービーズが、角度の追跡を可能にするのに十分な非対称性を与えることがわかります。最後に、我々は、従来の磁気ピンセットで磁場の方向(x、y)が平面内にあることに注意してください。そのため、ビーズの好ましい磁化軸が目に整列するE(x、y)を平面とN極とS極、上で定義したように、ビードの両側には低い極が上にFOMTまたはMTTの状況、および下であることを行っている。
FOMT実験において、重要なステップは、半径方向の磁場がビーズに近接して無視できるように、円筒磁石のアラインメントである。アライメントは、一度に単一のビーズが行われる。 FOMTビード運動が均一に円形の弁輪に分配されるか否かを判断する、測定時間は20·τCを超えるべきである。 τC 8 kbpのDNAと半径0.5mmビーズのため〜45秒に等しいように、測定時間は、アラインメントの最終段階〜900秒である。比較のために、1.9 kbpのDNAおよび0.25ミリメートルの半径ビーズの使用は、( 表2を参照のこと)〜2秒のτCの 20倍を減少させる。
女の間の追跡のための重要なステップと考慮事項OMTおよびMTT実験
面内変動をビードのを追跡するために、その(x、y)の位置、すなわち 、我々は、後続の時間間隔35、36でビーズによって表示される強度プロファイルの相互相関解析を使用する。これは、数ナノメートルの精度で20サブピクセル解像度で行うことができる。 z方向のビーズの動きを追跡するために、我々は、典型的には、核酸20に取り付けられたビーズの回折リングを撮像しながら、対物レンズの焦点面(OFP)は正確に垂直な方向にシフトされた第1、ゴスとコロッケによって設計された方法を使用。このようにして、較正プロファイルは、ビードとOFP 19との間の距離にビードの回折パターンを相関が生成される。この較正プロファイルが補間されると、ビーズの垂直変位はまた、数nmから20までの精度で測定することができる。私たちは、より洗練された追跡アルゴリズム37、38と同様に、複数のビーズ5、6、37の追跡をパラレルへの応用について説明し、追加の参照を読者に参照してください。
角座標に(x、y)は 、位置の変換に依存していた角度の追跡を使用するとき、我々は以下の手順を実行することをお勧めします。ビーズは使用の円形輪を描くする時間トレースから(x iは 、yのi)の位置(ここで、iは 、その後の測定点を表す指標)円の中心(x 0、y 0)とする半径R の円をフィットする最小化することにより( 図2A)。
(3)
合計は、すべてのデータポイント上で実行される場所。 fitti後にngのX 0、Y 0、及びR 円は 、使用した時間トレース内の各データ点の極座標(rをiを、θi)を決定する。
(4)
(5)
1が±π、適切な場合の位相ジャンプを追加するには、 すなわち 、角度θを 「アンラップ」するように注意する必要があることに注意してください。 (R、θ)座標に(x、y)とのフィッティングと変換のためのカスタム書かれたコードは、要求に応じて作成者から提供されています。 FOMTにおいて、ビーズは円形の環状部をトレースする時間トレースは粗アライメント(参照:工程3.3)を達成し、ビーズの熱変動を記録することによって得ることができる。 MTTは、熱fluctu管理ポイントは、円環形をトレースするには不十分である。代わりに、磁石をゆっくりと(典型的には0.1 Hzで)式3-5を使用して円に合わせて数回転によって回転する時間トレースを使用しています。
我々は、 すなわち 、角追跡マーカー( 図1c、図1d、図3a)を介して、または角度座標(内の(x、y)の位置の変換を介して、MTTのために、それは適切な角度トラッキングアプローチを選択することが重要であることに注意図1d、図2b)。典型的には、(x、y)は 、位置及びマーカービーズの使用からの角度トラッキングの精度は同等であるが、に記載のように、それは、クロストーク(x、y)の中に、角度でビードの変動の間に起こることを理解することが重要であるヤンセンらは 32:このように、(X、Y)位置からの角度の追跡が提供のみ有効であることに(Xのブラウンの変動、Y)座標の角度の不確実性、および(x、y)の追跡が側磁石の位置の調整を経由して回転トラップ剛性のチューニングが必要になる場合があり、その適切な使用のみに無視できる程度貢献しています。典型的には、より高い剛性トラップの使用は、マーカービーズを使用して、角度の追跡の使用を必要とする。マーカービーズの使用は(ステップ1.9の添付プロトコールを参照)使用可能なテザーの数を減らすことができる付加的な取り付け工程を必要とする。マーカービーズベースの追跡を使用する場合は、マーカービードが最良の結果を得るために、赤道付近に装着されている磁気ビーズを選択することが重要である。
既存の方法と応用に比べてFOMTおよびMTTのアプローチの重要性
上記において、我々は簡単にMTTまたはFOMTに器具を変換するための磁石構成を変更し、一つは、従来のMTから開始する方法を示している。この単純な男odification、角度追跡マーカーの使用が望まれる角度トラッキングの導入を伴うことができる、それはに応じて、トルクを加えるトルクを測定、またはねじれを測定することをユーザに許可するように、両方の構成の即時の強い点である手元の実験。冒頭で述べたように、FOMTも並列測定を5、の機能の恩恵を受け、特にMTTで、特にその単純、MTの既存の強みの多くからのMTTの利益の両方6(これらは与えられたように簡単にFOMTで達成されない円筒状の磁石の中心に対するテザーの位置合わせの要件)。注目すべきことに、MTTやFOMTは他の技術、特別に製造されたナノ粒子22、39、40、複雑な光学設計41、またはつなが内に追加のビーズの導入(DNA)分子42とは対照的に、必要としません。例えばOTHER技術は、それにもかかわらず、より高い時間分解能27、43、44のような他の利点を提供することができる。 DNA上の分子モーターの動作は、両方の影響を受けて、地元のねじれとトルクのための結果を持っているようFOMTおよびMTTの両方が、ゲノム処理の研究に将来のアプリケーションを見つける必要があります。追加アプリケーションは、DNAナノテクノロジー27の新興分野で、または生物学的処理7、45に積極的に回転モータの広い分野で見つけることができます。
M270(R ビーズ = 1.4ミクロン) | のMyOne(R ビーズ = 0.5ミクロン) | アデムテック(Ademtech)(R ビーズ = 0.25ミクロン) | |
従来のMT(立方5×5×5mmの3対の磁石、1mmのギャップ、垂直配向) | 70 pNの | 8 pNの | 1.6 pNの |
FOMT又はMTT(* 3本の円柱状の磁石の積層体、直径6mm、直径2mmギャップ) | 9 pNの | 1 pNで | 0.2 pNの |
FOMT又はMTT(* 3本の円柱状の磁石の積層体、直径6mm、直径1mmギャップ) | 18 pNの | 2 PN | 0.4 pNの |
FOMTまたはMTT *(最後の1と3の円筒状磁石スタックは、直径1mmのギャップをひっくり返さ) | 〜50 pNの | 9 pNの | 1.8 pNの |
* MTTの小さな側磁石の存在は、伸縮力にほとんど影響を持っている
表1。最大の力は、通常、異なる磁石構成とビードタイプに達成しました。
R ビーズ = 1.4ミクロン | R ビーズ = 0.5ミクロン | R ビーズ =0.25ミクロン | |
摩擦係数* | 120 pNの·nmで·秒 | 5.5 pNの·nmで·秒 | 0.7 pNの·nmで·秒 |
特徴的な時間スケール:FOMT、10 kbpのDNA ** | 1200秒 | 55秒 | 7秒 |
特徴的な時間スケール:FOMT、1 kbpのDNA | 120秒 | 5.5秒 | 0.7秒 |
特徴的な時間スケール:MTT、K、Q = 100 pNの·NM / RAD | 1.2秒 | 0.06秒 | 0.007秒 |
特徴的な時間スケール:MTT、K、Q = 1000 pNの·NM / RAD | 0.12秒 | 0.006秒= 6秒 | 0.0007 S = 0.7ミリ秒 |
*「赤道」を通る軸の周りの回転のための摩擦係数( 図1bに示される状況、すなわち)、Hはバッファの粘度である14·P·H·R ビード 3で与えられる。
** FOMTでは、回転トラップ剛性がDNAで、k qのねじり剛性によって与えられ、Cが有効なねじり持続長であるDNA = C·k個のBの T / L Cは 、(ここでは80nmであると仮定その中間の力体制、F〜1 PN)の特徴であり、L、Cは DNAの輪郭長であり、塩基対あたり0.34程度。
表2。摩擦係数とFOMTおよびMTTのための特徴的な時間スケール。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、デルフト工科大学、科学研究費オランダ機構(NWO)、物質に関する基礎的研究財団、欧州科学財団によってサポートされていました。
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |