Magnetiske pincet, en kraftfuld enkelt molekyle manipulation teknik, kan tilpasses til de direkte målinger af twist (ved hjælp af en konfiguration kaldes frit kredser magnetiske pincet) og drejningsmoment (ved hjælp af en konfiguration betegnes magnetisk moment pincet) i biologiske makromolekyler. Retningslinjer for udførelse af sådanne målinger er givet, herunder ansøgninger til studiet af DNA og tilhørende nucleo-protein filamenter.
Enkelt-molekyle teknikker gør det muligt at undersøge opførslen af enkelte biologiske molekyler i opløsning i realtid. Disse teknikker omfatter såkaldte force spektroskopi tilgange såsom atomic force mikroskopi, optiske pincetter, flyde stretching og magnetiske pincet. Blandt disse metoder, har magnetiske pincet udmærket sig ved deres evne til at anvende moment og samtidig opretholde en konstant stretching kraft. Her illustreres det, hvordan en sådan "konventionelle" magnetiske pincet eksperimentelle konfiguration kan gennem en enkel ændring af sit felt konfiguration til at minimere størrelsen af den tværgående område, som er indrettet til at måle graden af drejning i et biologisk molekyle. Betegnes den resulterende konfiguration af de frit-kredsløb magnetiske pincet. Derudover er det vist, hvordan yderligere modifikation af feltet konfiguration kan give et tværgående felt med en størrelsesorden mellemprodukt, der ligger mellem & #8220; konventionelle "magnetiske pincet og frit kredsløb magnetiske pincet, hvilket gør det muligt direkte at måle moment lagret i et biologisk molekyle. Betegnes denne konfiguration de magnetiske pincet moment. Den ledsagende video forklarer i detaljer, hvordan omlægning af konventionelle magnetiske pincet til frit kredser magnetiske pincetter og magnetisk moment pincet kan opnås, og demonstrerer brugen af disse teknikker. Disse tilpasninger bevare alle de stærke sider af konventionelle magnetiske pincet mens høj grad at udvide den alsidighed af denne magtfulde instrument.
I de senere år har enkelt-molekyle teknikker bevist deres brede anvendelighed i studiet af bearbejdende motordrevne proteiner og andre enzymer, hvilket gav indsigt i deres kinetik og den underliggende mechanochemistry. I forbindelse med force spektroskopi, er vigtige bidrag blevet foretaget af atomic force mikroskopi flow strække, og optiske og magnetiske pincet. Optiske og magnetiske pincet (MT) har bl.a. formået at kombinere stor fleksibilitet i form af molekylær manipulation med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Her fokuserer vi på MT, som kan anvende både strækker kræfter og momenter til biologiske molekyler tøjret mellem en overflade og superparamagnetiske perler 1-3.
Magnetiske pincet (MT, figur 1a) er en meget alsidig enkelt molekyle teknik, der har været anvendt til at overvåge både de mekaniske egenskaber af nukleinsyrer samt deres interaktioner med proteiner. MT har mange kræfters, herunder den overordnede enkelhed og robusthed forsøgsvis iværksættelse, facile anvendelse af drejningsmoment, naturlig drift og ligetil kalibrering i konstant kraft mode 4, udvidelse til parallelle målinger 5, 6, og fravær af prøve opvarmning og solskader. Sammenlignet med andre enkelt molekyle tilgange, MT giver en måde at udføre force afhængighed målinger ved kræfter så lavt som ≈ 10 fN og har evnen til at ligefrem styre graden af supercoiling. Mens MTS overvejende er blevet anvendt som et eksperimentelt redskab til at undersøge biologiske processer, der involverer nukleinsyrer 7, 8, har de også fundet anvendelse i undersøgelser af de mekaniske egenskaber af proteiner 9-13 eller celler 10, 14-17. Talrige nyttige referencer er til rådighed, der beskriver, hvordan man opbygger og køre en MT 4, 18-20.
Howevis, behøver konventionelle MT ikke spore roterende bevægelse direkte, og mens de anvender moment, de ikke måle moment direkte. Desuden kan de begrænse fri rotation af nukleinsyren tøjr. Her præsenterer vi to udvidelser af magnet pincet. Den første, der betegnes frit kredsløb magnetiske pincetter (FOMT, Figur 1b) 21, tillader målinger af ligevægts vinkel udsving og ændringer i twist af tøjrede nukleinsyremolekyler, uden at begrænse den roterende bevægelse omkring tether aksen. Den anden, betegnet magnetiske moment pincet (MTT, figur 1c), som har evnen til at anvende og direkte måle både kræfter og momenter til enkelte biomolekyler 22-27.
I det følgende protokol, formoder vi, at læseren har på hans / hendes disposition en "traditionel" MT instrument. Vi henviser læseren til diskussionen om referencer om hvordan at opbygge og drive en MT sat op, samt considerationer, der skal tages i betragtning ved udvælgelsen af magnetiske perler, magneter, og sporing af rutiner. Hertil kommer, punkt 1 og 2 i protokollen tekst beskriver, hvordan vi typisk forberede og inkuberes en DNA-prøve til brug i MT samt de foreløbige målinger, der kan udføres på en enkelt DNA i konventionel MT. Punkt 3 og 4 i protokollen Text illustrere, hvordan en MT instrument let kan tilpasses og anvendes til FOMT og MTT målinger.
Når du kører eksperimenter ved hjælp MTT eller FOMT, skal gøres med hensyn til perler, magneter, tracking protokoller, osv. De bedste valg, der skal foretages, vil afhænge af forsøget af interesse en række valg. Nedenfor beskriver vi de afvejninger, der ledsager forskellige valg, der skulle lette valg for et bestemt eksperiment. Dernæst beskriver vi flere kritiske trin, der ledsager tilpasningen og driften af MTT og FOMT eksperimenter. Endelig diskuterer vi betydningen af MTT og FOMT med hensyn til de eksisterende metoder samt fremtidige ansøgninger.
Overvejelser Forud for starten af MTT og FOMT Eksperimenter
Ethvert eksperiment kræver en til at vælge en form for magnetisk perle til brug. Man kan vælge mellem flere kommercielt tilgængelige streptavidin-coatede superparamagnetiske perler, f.eks, 0,25 mM radius perler, 0,5 mM radius perler, eller 1,4 mM radius perler (see Materials tabel). Større perler vil have en øget magnetisk moment i forhold til mindre perler (groft skalering som volumen), og dermed deres anvendelse vil lette anvendelsen af højere kræfter (for typiske kræfter opnået i vores instrumenter, se tabel 1). Når kantet tracking bruge markør perler ønskes, vi typisk arbejder med radius 1,4 m og bruge 0,5 mM radius umagnetisk biotinylerede perler som markør perler (se punkt 1.9 for den tilsvarende vedhæftede protokol). Brugen af mindre perler anbefales især til FOMT, som den karakteristiske tidshorisont for perle rotation τ C er lig med forholdet mellem systemets træk over sin fjederkonstanten γ / k θ; vigtigere, roterende vindmodstand relevant for kantede måletid skala skalaer som ~ R perle 3, dvs med tredje potens af radius (se tabel 2 forden karakteristiske tidsskalaer flere perle-DNA kombinationer i FOMT og MTT målinger). Ledsagende nedsættelser af den maksimale kraft, der kan anvendes, kan løses ved hjælp af en spejlvendt stak af cylindriske magneter 27. Ikke desto mindre, i FOMT målinger kan det nogle gange være nødvendigt at gå på kompromis mellem det bedst opnåelige tidsmæssige opløsning og den maksimale anvendte kraft.
Derudover et eksperiment kræver udvælgelsen af en magnet konfiguration. I den konventionelle magnetiske pincet konfiguration (figur 1a), bruger vi typisk et par af 5x5x5 mm kubiske magneter i lodret retning med en 0,5 eller 1 mm mellem magneterne 4. Når magneterne er anbragt langs x (y-aksen), giver dette et magnetfelt, der er primært rettet langs x (y-aksen). For FOMT eksperimenter, er en cylinderformet magnet udvalgt hvis centrum magnetfeltet er primært rettetlangs z-aksen (figur 1b). I praksis anvender vi en stak af tre sådanne cylindrisk formede magneter, hver med en diameter på 6 mm, og et centralt hul 2 mm i diameter, til en samlet tykkelse på 6 mm. Når der ønskes højere trækkræfter, er en "vendt stakken" magnet konfiguration, i hvilken den nederste magnet er stablet med modsat magnetisering foretrækkes. For at opnå MTT konfiguration (figur 1c), vi tilføjer en yderligere magnet på siden af den primære magnet stakken af FOMT konfiguration, typisk en massiv cylinder med diameter på 4 mm og en højde på 7 mm. At se, hvordan den maksimale kræfter opnået i vores instrumenter afhænger af den magnet konfiguration, se tabel 1.
Tilpasningen af MTT og FOMT Eksperimenter
Da magnetiske perler har en (ca.) jævnt funktionaliserede overflade (typisk streptavidin), og siden fastgørelse af både den funktionaliserede nucleic syre bindsler og markør perler (i tilfælde af markør perle-baserede kantet sporing er ansat) sker via simpel inkubation i opløsning, man ikke styre, hvor linen og / eller markør perle tillægger magnetisk perle. De magnetiske perler har en foretrukken magnetisering akse, der har tendens til at bringe langs retningen af det eksterne felt. Hvis vi betegne de punkter, hvor den foretrukne magnetisering skærer perlen overflade som nord og syd poler, så perler, hvor DNA-tether er knyttet tæt på ækvator vil spore en cirkulær annulus med en radius tæt på eller lidt større end perle radius i FOMT; I modsætning hertil vil perler, der er knyttet tæt på den sydlige pol svinge på en cirkulær annulus med meget lille radius i FOMT, der kan udelukke montering af cirklen ved hjælp af ligninger 3-5. Vi bemærker, at ved simpel sfærisk geometri, sandsynligheden for at knytte nær ækvator er meget større end en vedhæftet fil, præcis ved polerne; derfor, de fleste beads vil bindes således, at (x, y)-baserede kantet sporing kan udføres med succes.
Et lignende argument holder til fastgørelse af markør-perler til fiducielle markør baseret kantet sporing. Markøren perle bruges til at skabe en asymmetri i billedet af den magnetiske perle, der muliggør vinkel tracking. Hvis markøren perlen er fastgjort nøjagtigt på nord eller sydpolen af perlen (dvs. direkte på toppen eller i bunden), det resulterende billede er stadig rotationssymmetriske og kantede sporing protokol mislykkes. Men ved samme sfæriske geometri argument, chancen for en markør perle at vedhæfte direkte på en af polerne er relativt lille; finder vi, at i praksis de fleste markør perler giver en tilstrækkelig asymmetri at aktivere kantet sporing. Endelig bemærker vi, at den retning felt i de konventionelle magnetiske pincet er i (x, y)-planen; derfor vil de foretrukne magnetiseringskurver akse perlen tilpasse i the (x, y)-planen og nord og syd poler, som defineret ovenfor, der kommer til at være på siderne af perlen usandsynligt situationen i FOMT eller MTT, hvor polerne er i top og bund.
I FOMT eksperimenter, et afgørende skridt er tilpasningen af den cylindriske magnet, således at den radiale magnetfelt er ubetydelig i nærhed til perlen. Denne tilpasning udføres for en enkelt perle ad gangen. At bedømme, hvorvidt perle bevægelse i FOMT er jævnt fordelt over et cirkulært annulus, skal målingen tid overstige 20 · τ C. Da τ C lig ~ 45 sek 8 kbp DNA og et 0,5 mm radius perle, måling tid er ~ 900 sek i de sidste faser af tilpasning. Til sammenligning, anvendelse af 1,9 kbp-DNA og 0,25 mm radius perler reducerer τ C tyve-fold til ~ 2 sek (se også tabel 2).
Kritiske trin og overvejelser til Tracking Under FOMT og MTT Eksperimenter
At spore perle in-plane udsving, dvs sin (x, y)-position, vi ansætter en krydskorrelationsfunktion analyse af intensitetsprofiler vises af en perle ved efterfølgende tidsintervaller 35, 36. Dette kan udføres ved sub-pixel opløsning med en nøjagtighed på nogle få nanometer 20. At spore perlens bevægelse i z, bruger vi typisk en metode først designet af Gosse og Croquette, hvor målet er brændplanet (OFP) nøjagtigt forskydes i lodret retning, mens billeddannelse af diffraktion ringe af vulsten fastgjort til nukleinsyre 20 . På denne måde, er en kalibrering profil frembragt korrelere diffraktionsmønstret af perlen til afstanden mellem perlen og OFP 19.. Når denne kalbreringsprofil interpoleres, kan de lodrette forskydninger af perlen også målt med en nøjagtighed på op til et par nm 20.Vi henviser læseren til yderligere referencer, der beskriver mere raffinerede sporingsalgoritmerne 37, 38 samt deres ansøgning til parallel sporing af flere perler 5, 6, 37.
Når du bruger kantet sporing, der bygger på omdannelsen af (x, y)-positionerne i kantede koordinater, vi anbefaler at gå frem som følger. Fra en tid, spor, hvor perlen spor ud af en cirkulær annulus bruge (x i, y i) positioner (hvor indekset i betegner efterfølgende målepunkter) for at passe cirklens centrum (x 0, y 0) og radius R cirkel (figur 2a) ved at minimere:
(3)
hvor summen løber over alle datapunkter. Efter Fitting x 0, y 0, og R cirkel, fastlægge de polære koordinater (r i, θ i), i hvert datapunkt i den tid spor ved hjælp af:
(4)
(5)
Bemærk, at man skal sørge for at "pakke" vinklen θ, dvs at tilføje fase spring af ± π eventuelt. Brugerdefineret skrevet kode for montering og konvertering fra (x, y) til (r, θ) koordinater er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning. I FOMT kan en tid spor, hvor perlen spor ud af en cirkulær annulus opnås ved at opnå grov justering (jf. trin 3.3) og registrering af termiske fluktuationer af perlen. I MTT termiske svingningertioner er utilstrækkelige til at spore den cirkulære annulus; i stedet bruge en tid spor, hvor magneterne er langsomt (typisk ved 0,1 Hz) drejes af flere omgange for at passe til cirkel ved hjælp af ligninger 3-5.
Vi bemærker, at for MTT, er det vigtigt at vælge den rette kantede sporing fremgangsmåde, dvs via en kantet sporing markør (Figur 1c, figur 1d, figur 3a) eller via omdannelse af (x, y)-positionerne i kantede koordinater ( Figur 1d, figur 2b). Mens typisk nøjagtighed vinkelpositionen sporing fra (x, y)-position og anvendelse af markørvacciner perler er sammenlignelige, er det vigtigt at indse, at krydstale opstår mellem en perle er udsving i (x, y) og i vinkel, som beskrevet i Janssen et al 32: således, kantet sporing fra (x, y)-positionerne er kun gyldige, forudsat at de Brownske udsving i (x, Y) kun bidrager ubetydeligt til usikkerheden i den kantede koordinere og dets rette brug af (x, kan y)-sporing kræver tuning af roterende fælde stivhed via justering af positionen af siden magnet. Typisk anvendelse af højere fælde stivhed kræver brug af kantede tracking bruge markør perler. Anvendelsen af markørgener perler kræver et yderligere trin vedhæftet fil, hvilket kan reducere antallet af brugbare tøjr (se vedhæftede protokol i trin 1.9). Ved brug af markør perle-baseret sporing, er det vigtigt at vælge magnetiske perler, der har en markør perle er fastgjort nær ækvator for de bedste resultater.
Betydningen af den FOMT og MTT Approaches Sammenlignet med eksisterende metoder og applikationer
I det ovenstående har vi vist, hvordan man kan, startende fra konventionel MT, nemt ændre magnet konfigurationer til at konvertere instrumentet til MTT eller FOMT. Denne enkle mNDRING, som kan være ledsaget af indførelsen af kantede sporing når der ønskes brug af en kantet sporing markør, er en øjeblikkelig stærkt punkt i begge konfigurationer, da det tillader brugeren at anvende moment, måle moment, eller måle twist, afhængigt af eksperimentere ved hånden. Som nævnt i indledningen, både FOMT og MTT gavn af mange af de eksisterende styrker af MT, navnlig deres enkelhed, med MTT i særdeleshed også nyder godt af den evne parallelle målinger 5, 6 (disse er ikke så nemt at opnå i FOMT givet kravet om tilpasning af tøjret i forhold til midten af den cylindriske magnet). Især gør MTT og FOMT ikke kræver, i modsætning til andre teknikker, komplekse optiske design 41 specielt nano-fabrikerede partikler 22, 39, 40, eller indførelse af yderligere perler inden for den tøjret (DNA) molekyle 42.. Sådanne other teknikker kan ikke desto mindre give andre fordele såsom højere tidsmæssig opløsning 27, 43, 44. Både FOMT og MTT skulle finde fremtidige ansøgninger i studiet af genomet behandling, da adfærd molekylære motorer på DNA er både påvirket af og har konsekvenser for den lokale twist og drejningsmoment. Yderligere programmer kan findes i de nye inden for DNA-nanoteknologi 27 eller i den bredere roterende motorer er aktive i biologisk behandling 7, 45.
M270 (R perle = 1,4 um) | MyOne (R perle = 0,5 um) | Ademtech (R perle = 0,25 um) | |
Konventionel MT (par kubik 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm hul, lodret justering) | 70 PN | 8 PN | 1.6 PN |
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter, diameter 6 mm, 2 mm hul diameter) | 9 PN | 1 pn | 0,2 PN |
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter, diameter 6 mm, 1 mm hul diameter) | 18 PN | 2 PN | 0,4 PN |
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter med sidste vendt, 1 mm hul diameter) | ~ 50 PN | 9 PN | 1.8 PN |
* Tilstedeværelsen af den lille side magnet i MTT har en ubetydelig indvirkning på den strækning kraft
Tabel 1. Maksimale kræfter typisk opnået for forskellige magnet konfigurationer og perle typer.
R perle = 1,4 um | R perle = 0,5 um | R perle =0,25 um | |
Friktionskoefficient * | 120 PN · nm · sek | 5.5 PN · nm · sek | 0.7 PN · nm · sek |
Karakteristisk tidsskala: FOMT, 10 kbp DNA ** | 1200 sek | 55 sec | 7 sek |
Karakteristisk tidsskala: FOMT, 1 kbp DNA | 120 sek | 5,5 sek | 0,7 sek |
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad | 1,2 sek | 0,06 sek | 0,007 sek |
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 1000 PN · nm / rad | 0,12 sek | 0,006 sek = 6 msek | 0,0007 s = 0,7 msek |
* Friktionskoefficient til rotation omkring en akse gennem "ækvator" (dvs. situationen vist i figur 1b), Givet ved 14 · p · h · R vulst 3, hvor h er viskositeten af bufferen.
** I FOMT er den roterende fælde stivhed givet ved vridningsstivhed af DNA, k q, DNA = C · k B T / L C, hvor C er den effektive torsionsstivhed vedholdenhed længde, antages at være 80 nm her ( som er karakteristisk for en mellemliggende kraft regime, F ~ 1 PN) og L C er konturen længde af DNA, 0,34 nm pr basepar.
Tabel 2.. Friktion koefficienter og karakteristisk tidsplaner for FOMT og MTT.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af TU Delft, Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), Fonden til grundforskning på Matter, og af European Science Foundation.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |