Magnetiske pinsett, en kraftig single-molekyl manipulasjon teknikken, kan tilpasses for de direkte målinger av twist (ved hjelp av en konfigurasjon kalles fritt-bane rundt magnetiske pinsett) og dreiemoment (ved hjelp av en konfigurasjon kalles magnetisk moment pinsett) i biologiske makromolekyler. Retningslinjer for å utføre slike målinger er gitt, inklusive anvendelser for analyse av DNA og tilhørende nucleo-proteinfilamenter.
Single-molekyl teknikker gjør det mulig å undersøke oppførselen av individuelle biologiske molekyler i løsningen i sann tid. Disse teknikkene omfatter såkalte kraft spektroskopi tilnærminger som atomic force mikroskopi, optiske pinsetter, flyte stretching, og magnetiske pinsett. Blant disse metodene, har magnetiske pinsett utmerker seg ved sin evne til å påføre dreiemoment og samtidig opprettholde en konstant strekkraft. Her er det vist hvordan en slik "vanlig" magnetiske pinsett eksperimentelle konfigurasjonen kan, via en enkel endring av dens feltkonfigurasjon for å minimere størrelsen av den tverrgående felt, være innrettet til å måle graden av vridning i et biologisk molekyl. Den resulterende konfigurasjonen kalles de fritt-bane rundt magnetiske pinsett. I tillegg er det vist hvordan ytterligere modifikasjon av feltet konfigurasjon kan gi en tverrgående felt med en størrelse mellom den i av-#8220; konvensjonelle "magnetiske pinsetter og de fritt-bane rundt magnetiske pinsett, som gjør det mulig å direkte måle dreiemomentet som er lagret i et biologisk molekyl. Denne konfigurasjonen kalles den magnetiske moment pinsett. Den tilhørende video beskriver i detalj hvordan omdannelsen av konvensjonelle magnetiske pinsett til fritt-bane rundt magnetiske pinsetter og magnetisk moment pinsett kan gjennomføres, og viser bruken av disse teknikkene. Disse tilpasningene vedlikeholde alle de sterke sidene ved konvensjonelle magnetiske pinsett mens sterkt voksende allsidigheten til denne kraftige instrument.
I de senere årene, har single-molekyl teknikker bevist sin brede anvendelighet i studiet av processive motor proteiner og andre enzymer, gir innsikt i deres kinetikk og den underliggende mechanochemistry. I sammenheng med kraft spektroskopi, har viktige bidrag blitt gjort av atomic force mikros flyt stretching, og optiske og magnetiske pinsett. Optiske og magnetiske pinsett (MT) har spesielt lyktes i å kombinere stor fleksibilitet i forhold til molekylær manipulasjon med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Her fokuserer vi på MT, som kan gjelde både strekker krefter og momenter til biologiske molekyler tjoret mellom en flate og superparamagnetiske perler 1-3.
Magnetiske pinsett (MT, figur 1a) er et meget allsidig én-molekyl teknikk som har blitt brukt for å overvåke både de mekaniske egenskaper av nukleinsyrer, så vel som deres interaksjon med proteiner. MT har mange styrkes, inkludert generelle enkelhet og robusthet av den eksperimentelle implementering, lettvinte bruk av dreiemoment, naturlig drift og grei kalibrering i konstant kraft modus 4, utvidelse til parallelle målinger 5, 6, og fravær av prøven oppvarming og photodamage. Sammenlignet med andre single-molekyl tilnærminger, MT gi en måte å utføre makt-avhengighets målinger på kreftene så lavt som ≈ 10 fN og har evnen til å oversiktlig kontrollere graden av supercoiling. Mens MTS har hovedsakelig blitt brukt som et eksperimentelt verktøy for å undersøke biologiske prosesser som omfatter nukleinsyrer 7, 8, har de også funnet anvendelse i studier av de mekaniske egenskapene til proteinene 9-13 eller celler 10, 14-17. Mange nyttige referanser er tilgjengelig som beskriver hvordan bygge og drive en MT 4, 18-20.
Howeveh, trenger konvensjonell MT ikke spore roterende bevegelse direkte, og, mens de gjelder dreiemoment, har de ikke måle dreiemoment direkte. I tillegg begrenser de den frie rotasjon av nukleinsyre tether. Her presenterer vi to utvidelser av magnet pinsett. Den første, kalt fritt-bane rundt magnetiske pinsett (FOMT, Figur 1b) 21, gjør at målinger av likevektsvinkel svingninger og endringer i twist av tethered nukleinsyremolekyler, uten å begrense den roterende bevegelse rundt tjore aksen. Den andre, kalt magnetiske moment pinsett (MTT, figur 1c), som har evnen til å søke og direkte måle både krefter og momenter til enkelt biomolekyler 22-27.
I den følgende protokoll, antar vi at leseren har på hans / hennes disposisjon en "konvensjonelle" MT instrument. Vi henviser leseren til diskusjon etter referanser på hvordan å bygge og drive en MT satt opp, samt betyderasjoner som må tas hensyn til ved valg av magnetiske kuler, magneter, og sporing av rutiner. I tillegg, avsnitt 1 og 2 i protokollen tekst beskriver hvordan vi vanligvis forberede og inkuber en DNA-prøve til bruk i MT, så vel som de foreløpige målinger som kan utføres på en enkelt DNA på konvensjonell MT. § § 3 og 4 i protokollen Tekst illustrere hvordan en MT instrument kan lett tilpasses og brukes for FOMT og MTT målinger.
Når du kjører eksperimenter ved hjelp av MTT eller FOMT, en rekke valg må gjøres om perler, magneter, sporing protokoller, etc. De beste valg som skal gjøres vil avhenge av eksperimentet av interesse. Nedenfor beskriver vi de avveiningene som følger ulike valg, som skal legge til rette valget for et bestemt eksperiment. Deretter beskriver vi flere viktige skritt som følger med justering og drift av MTT og FOMT eksperimenter. Til slutt diskuterer vi betydningen av MTT og FOMT med hensyn til eksisterende metoder samt fremtidige søknader.
Hensyn Før starten av MTT og FOMT Experiments
Alle forsøk krever en for å velge en type magnetiske kuler for bruk. Man kan velge mellom flere kommersielt tilgjengelige streptavidin-belagt superparamagnetiske perler, for eksempel, 0,25 mikrometer radius perler, 0,5 mikrometer radius perler, eller 1,4 mikrometer radius perler (see Materials tabell). Større perler vil ha en økt magnetisk moment i forhold til mindre perler (omtrent skalering som volumet) og derfor deres bruk vil lette anvendelsen av høyere krefter (for typiske styrker oppnådd i våre instrumenter, se tabell 1). Når vinkel sporing ved hjelp av markør perler er ønsket, vi vanligvis jobber med 1,4 mikrometer radius og bruke 0,5 mikrometer radius ikke-magnetiske biotinylerte perler som markør perler (se punkt 1.9 for tilsvarende vedlegg protokollen). Bruken av mindre kuler er spesielt anbefalt for FOMT, som den karakteristiske tidsskala for vulsten rotasjon τ C er lik forholdet mellom systemets drag i løpet av sin fjærkonstant γ / k θ; viktigere, rotasjons luftmotstandskoeffisient relevant for vinkelmålingstidsskala skalaer som ~ R vulsten 3, dvs. med tredje potens av radien (se tabell 2 forden karakteristiske tidsskalaer for flere perle-DNA kombinasjoner i FOMT og MTT målinger). Medfølgende reduksjoner i maksimal kraft som kan brukes kan løses ved hjelp av en snudd bunken med sylindriske magnetene 27. Likevel, i FOMT målinger kan det noen ganger være nødvendig å inngå kompromiss mellom den beste oppnåelige tidsmessig oppløsning og den maksimale anvendt kraft.
I tillegg er et eksperiment som krever valg av en magnet-konfigurasjon. I den konvensjonelle magnetiske pinsett konfigurasjon (Figur 1a), vi bruker vanligvis et par 5x5x5 mm kubiske magneter i vertikal retning med en 0,5 eller 1 mm gap mellom magnetene fire. Når magnetene er fordelt langs x-aksen (y), gir dette et magnetisk felt som er hovedsakelig rettet langs x-aksen (y). For FOMT eksperimenter, er et sylindrisk formet magnet velges ved hvis sentrum det magnetiske feltet er primært rettetlangs z-aksen (figur 1b). I praksis benyttes en stabel av tre slike sylinderformede magneter, hver med en diameter på 6 mm og en 2 mm diameter sentralt hull, for en total tykkelse på 6 mm. Når høyere trekkrefter er ønsket, blir en "tuppet stack" magnet-konfigurasjon hvori den nederste magnet er stablet med motsatt magnetiseringen foretrukket. For å oppnå den MTT-konfigurasjon (figur 1c), legger vi en ytterligere magnet på siden av hovedmagnet stabel av FOMT konfigurasjon, vanligvis en solid sylinder med 4 mm diameter og en høyde på 7 mm. For å se hvordan de maksimale krefter som oppnås i våre instrumenter avhenger av magnetkonfigurasjon, se tabell 1.
Justering av MTT og FOMT Experiments
Siden magnetiske kuler har en (ca.) jevnt funksjonalisert overflate (typisk streptavidin) og siden å feste både den funksjon nucleic syre stagene og Marker perler (i tilfelle markør perle-basert vinkel sporing er ansatt) skjer via enkle inkubasjon i løsningen, gjør man ikke kontrollere hvor snor og / eller markør perle feste til den magnetiske kuler. De magnetiske perler har en foretrukket magnetisering akse som har en tendens til å justere langs retningen av det ytre felt. Hvis vi betegner de punkter hvor den foretrukne magnetisering akse skjærer vulsten overflate som nord-og sydpolen, og perlene hvor DNA-tether er festet i nærheten av ekvator vil spore ut en sirkulær ringrommet med en radius nær eller er litt større enn perle radius i FOMT; i kontrast, vil perler som er festet nær sydpolen svinge på en sirkulær ringrommet med svært liten radius i FOMT, noe som kan være til hinder for montering av sirkelen ved hjelp av ligninger 3-5. Vi merker oss at ved enkel sfærisk geometri, er sannsynligheten for å feste nær ekvator mye større enn et vedlegg nøyaktig ved polene; Derfor er de fleste beads vil være bundet slik at de (x, y)-baserte vinkelsporing kan utføres med hell.
Et lignende argument holder til å feste markøren perler for fiducial markør basert vinkel sporing. Markøren vulsten blir brukt til å lage en asymmetri i bildet av det magnetiske kuler som muliggjør vinkelsporing. Hvis markøren vulsten blir festet nøyaktig på nord-eller sydpolen på vulsten (dvs. direkte på toppen eller på bunnen), er det resulterende bildet fremdeles rotasjonssymmetrisk og vinkelsporings protokollen svikter. Imidlertid, ved det samme sfæriske geometri argument, er sjansen for en markør perle for å feste direkte til en av polene forholdsvis liten; finner vi at i praksis de fleste markør perler gi en tilstrekkelig asymmetri å aktivere kantete sporing. Til slutt ser vi at i de konvensjonelle magnetiske pinsett feltet retningen er i (x, y)-planet; derfor vil de foretrukne magnetiseringsnivåene aksen av perlen justere i the (x, y)-planet og de nord-og sydpolen, som definert ovenfor, kommer til å være på sidene av perle, usannsynlig situasjonen i FOMT eller MTT, hvor polene er på toppen og bunnen.
I FOMT eksperimenter, er et kritisk trinn i innretting av den sylindriske magnet, slik at den radiale magnetiske feltet er ubetydelig i nærhet til vulsten. Denne innretting er utført for en enkelt perle på en gang. For å bedømme om perle bevegelse i FOMT er jevnt fordelt over en sirkulær ringrommet, bør målingen tidspunkt overstige 20 · τ C. Som τ C tilsvarer ~ 45 sek for 8 kbp DNA og en 0,5 mm radius perle, er måling tid ~ 900 sek i sluttfasen av justering. For sammenligning, bruk av 1.9 kbp DNA og 0,25 mm radius perler reduserer τ C tyve ganger til ~ 2 sek (se også tabell 2).
Kritiske trinn og Hensyn for sporing Under FOMT og MTT Experiments
For å spore perle største svingninger i-planet, det vil si sin (x, y)-stilling, anvender vi en kryss-korrelasjonsanalyse av de belastningsprofiler som vises av en vulst ved etterfølgende tidsintervaller 35, 36.. Dette kan bli utført ved sub-bildepunkter med en nøyaktighet på noen få nanometer 20. For å spore vulsten bevegelse i z, vi bruker vanligvis en metode først utformet ved Gosse og Croquette, der målet er fokalplanet (OFP) er nøyaktig forskjøvet i vertikal retning mens avbildning av diffraksjons-ringer av vulsten festet til nukleinsyren 20 . På denne måte blir en kalibreringsprofil generert korrelering diffraksjonsmønsteret av perlen til avstanden mellom vulsten og OFP 19.. Når denne kalibreringsprofilen er interpolert, kan de vertikale forskyvninger av vulsten også bli målt med en nøyaktighet på opp til noen få nm 20.Vi henviser leseren til ytterligere referanser som beskriver mer raffinert sporing algoritmer 37, 38 samt deres søknad til parallell sporing av flere perler 5, 6, 37.
Ved bruk av vinkel sporing som er avhengig av konvertering av (x, y)-posisjoner i kantete koordinater, anbefaler vi å fortsette som følger. Fra en tids spor hvori vulsten sporer ut en sirkulær ringrommet, bruker (x i, y i) posisjoner (hvor indeksen i betegner påfølgende målepunkter) for å passe til sirkelsenteret (0 x, y 0), og en radius R sirkel (figur 2a) ved å minimere:
(3)
der summen løper over alle datapunkter. Etter fitting x 0, y 0, og R sirkel, bestemme polarkoordinater (r i, θ i) av hvert datapunkt i tids spor med;
(4)
(5)
Legg merke til at man bør passe på å "pakke" vinkelen θ, dvs. å legge fase hopper av ± π der det er hensiktsmessig. Custom-skrevet kode for montering og konvertering fra (x, y) til (r, θ) koordinerer er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. I FOMT, kan en tids spor hvori vulsten sporer ut en sirkulær ringrommet kan oppnås ved å oppnå grov innretting (kfr. trinn 3.3) og registrering av termiske svingninger av vulsten. I MTT, termisk svingerasjon er utilstrekkelige for å spore opp den sirkulære ringrommet; Bruk i stedet en tid spor der magnetene er sakte (typisk på 0,1 Hz) roteres ved flere omganger for å passe sirkelen ved hjelp av ligninger 3-5.
Vi merker oss at for MTT, er det viktig å velge den riktige vinkel relativ tilnærming, det vil si via en vinkelsporingsmerke (figur 1c, Fig. 1d, figur 3a) eller via omdannelse av (x, y)-stillingene i vinkelkoordinater ( Figur 1d, figur 2b). Mens vanligvis den nøyaktighet på vinkelsporings fra (x, y)-stillingen og bruken av markør perler er sammenlignbare, er det viktig å innse at krysstale oppstår mellom en kule største svingninger i (x, y) og i vinkel, som beskrevet i Janssen et al 32: altså, er kantete sporing fra (x, y)-posisjoner bare gyldige hvis de Brownske svingninger i (x, Y) bidrar bare ubetydelig til usikkerheten i vinkel koordinaten, og den riktige bruken av (x, kan y)-sporing kreve justering av rotasjons-felle stivhet via justering av stillingen til side magnet. Vanligvis krever bruk av høyere felle stivhet ved bruk av vinkelsporing ved bruk av markør-perler. Bruken av markør perler krever et ytterligere festetrinn, noe som kan redusere antallet av brukbare stagene (se vedlegget protokollen i trinn 1.9). Ved bruk av markør perle-basert sporing, er det viktig å velge magnetiske kuler som har en markør vulsten er festet i nærheten av ekvator for best resultat.
Betydningen av den FOMT og MTT tilnærminger i forhold til eksisterende metoder og programmer
I det ovennevnte, har vi vist hvordan man kan, fra konvensjonelle MT, lett endre magnetkonfigurasjoner for å konvertere apparatet i MTT eller FOMT. Dette grei modification, som kan være ledsaget av innføringen av vinkelsporing ved bruk av en vinkelsporingsmerke er ønsket, er en umiddelbar sterk punktet for begge konfigurasjoner, som det tillater brukeren å påføre dreiemoment, å måle dreiemoment, eller måle vridning avhengig eksperimentere for hånden. Som nevnt i innledningen, både FOMT og MTT dra nytte av mange av de eksisterende styrkene i MT, spesielt sin enkelhet, med MTT spesielt også drar nytte av evnen til parallelle målinger 5, 6 (disse ikke er like enkelt å oppnå i FOMT gitt kravet om innretting av fortøyningen i forhold til midten av den sylindriske magneten). Spesielt, har MTT og FOMT ikke krever, i motsetning til andre teknikker, spesielt nanopartikler fremstilt 22, 39, 40, komplekst optisk design 41, eller innføring av ytterligere perler innenfor tjoret (DNA)-molekyl 42.. Slike other teknikker kan likevel gi andre fordeler som for eksempel høyere tidsoppløsning 27, 43, 44. Både FOMT og MTT bør finne fremtidige søknader i studiet av genomet behandling, som oppførselen til molekylære motorer på DNA er både påvirket av og har konsekvenser for lokal vri og dreiemoment. Andre programmer kan bli funnet i det nye feltet av DNA nanoteknologi 27 eller i den bredere felt av roterende motorer aktive i biologisk behandling 7, 45.
M270 (R perle = 1,4 mikrometer) | MyOne (R perle = 0,5 mikrometer) | Ademtech (R perle = 0,25 mikrometer) | |
Konvensjonell MT (par kubikk 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm gap, vertical alignment) | 70 PN | 8 PN | 1,6 PN |
FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter, mm diameter 6, 2 mm diameter gap) | 9 PN | 1 PN | 0,2 PN |
FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter, mm diameter 6, 1 mm diameter gap) | 18 PN | 2 PN | 0,4 PN |
FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter med siste snudd, 1 mm diameter gap) | ~ 50 PN | 9 PN | 1,8 PN |
* Tilstedeværelsen av den lille side magneten i MTT har en ubetydelig virkning på strekkstyrke
Tabell 1. Maksimale kreftene vanligvis oppnås for ulike magnet konfigurasjoner og perle typer.
R perle = 1,4 mikrometer | R perle = 0,5 mikrometer | R perle =0,25 um | |
Friksjonskoeffisient * | 120 PN · nm · sek | 5,5 PN · nm · sek | 0,7 PN · nm · sek |
Karakteristisk tidsskala: FOMT, 10 kbp DNA ** | 1200 sek | 55 sek | 7 sek |
Karakteristisk tidsskala: FOMT, en kbp DNA | 120 sek | 5,5 sek | 0,7 sek |
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad | 1,2 sek | 0,06 sek | 0.007 sek |
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 1000 PN · nm / rad | 0,12 sek | 0,006 sek = 6 ms | 0,0007 s = 0,7 msek |
* Friksjonskoeffisient for rotasjon om en akse gjennom "ekvator" (dvs. den situasjon er vist i figur 1b), Gitt ved 14 · p · h · R perle 3, der h er viskositeten til buffer.
** I FOMT, er rotasjons-felle stivhet gitt av vridningsstivheten av DNA, k q, DNA = C · k B t / l C, hvor C er den effektive torsjons utholdenhet lengde, antas å være 80 nm her ( som er karakteristisk for et mellomliggende kraft-regimet, F ~ 1 pN) og l C er konturen lengden av DNA, 0.34 nm per basepar.
Tabell 2. Friksjonskoeffisienter og karakteristisk tidsskalaer for FOMT og MTT.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av TU Delft, Nederland Organisation for Scientific Research (NWO), Stiftelsen for Fundamental Research on Matter, og av European Science Foundation.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |