Pinces magnétiques, une technique de manipulation de molécule unique puissante, peuvent être adaptés pour les mesures directes de la torsion (en utilisant une configuration appelée librement orbite pinces magnétiques) et le couple (en utilisant une configuration appelée pinces de couple magnétique) dans les macromolécules biologiques. Lignes directrices pour l'exécution de ces mesures sont donnés, y compris les applications à l'étude de l'ADN et des filaments nucléo-protéines associées.
Techniques molécule unique permettent d'enquêter sur le comportement de molécules biologiques individuelles en solution en temps réel. Ces techniques comprennent des approches dites de spectroscopie de force tels que microscopie à force atomique, pinces optiques, l'écoulement d'étirement et pinces magnétiques. Parmi ces approches, pinces magnétiques se sont distingués par leur capacité à appliquer un couple tout en maintenant une force d'étirement constant. Ici, il est illustré comment une telle configuration expérimentale des pinces magnétiques "classique" peut, par une modification simple de la configuration de son champ de réduire au minimum l'amplitude du champ transversal, être adapté à mesurer le degré de torsion dans une molécule biologique. La configuration qui en résulte est appelé les pinces magnétiques librement en orbite. En outre, il est démontré comment une autre modification de la configuration du champ peut produire un champ transverse avec une magnitude intermédiaire entre celle de l'& #8220; «pinces magnétiques classiques et les pinces magnétiques librement en orbite, ce qui permet de mesurer directement le couple stocké dans une molécule biologique. Cette configuration est appelée la pince à épiler de couple magnétiques. La vidéo d'accompagnement explique en détail comment la conversion de pinces magnétiques classiques en libre-orbite pinces magnétiques et des pinces de couple magnétique peut être accompli, et illustre l'utilisation de ces techniques. Ces adaptations maintiennent toutes les forces de pinces magnétiques classiques tout en élargissant considérablement la polyvalence de cet instrument puissant.
Au cours des dernières années, les techniques de molécule unique ont prouvé leur large application dans l'étude des protéines motrices processive et d'autres enzymes, ce qui donne un aperçu de leur cinétique et la mécanochimie sous-jacent. Dans le contexte de la spectroscopie de force, d'importantes contributions ont été apportées par les flux de microscopie à force atomique étirements, et des pinces optiques et magnétiques. Pinces optiques et magnétiques (MT) ont notamment réussi à combiner une grande flexibilité en termes de manipulation moléculaire à haute résolution spatiale et temporelle. Ici, nous nous concentrons sur MT, qui peut appliquer les deux forces d'étirement et des couples de molécules biologiques attachés entre une surface et perles superparamagnétiques 1-3.
Pinces magnétiques (MT, Figure 1a) sont une technique unique de molécule très polyvalent qui a été utilisé pour surveiller à la fois les propriétés mécaniques des acides nucléiques, ainsi que leurs interactions avec les protéines. MT ont beaucoup de forces, notamment la simplicité et la robustesse globale de la mise en œuvre expérimentale, une application facile de couple, le fonctionnement normal et en mode calibration simple à force constante 4, parallèlement à l'extension des mesures 5, 6, et en l'absence de chauffage de l'échantillon et le photovieillissement. Comparé à d'autres approches de molécule unique, MT fournir un moyen d'effectuer des mesures de force à la dépendance des forces aussi faibles que ≈ 10 fN et avoir la capacité de contrôler carrément le degré de surenroulement. Alors que MT ont principalement été utilisé comme un outil expérimental pour étudier les processus biologiques impliquant des acides nucléiques 7, 8, ils ont également trouvé une application dans l'étude des propriétés mécaniques des protéines ou des cellules 9-13 10, 14-17. De nombreuses références utiles sont disponibles qui décrivent comment construire et gérer une MT 4, 18-20.
Cepener, MT conventionnelle ne pas suivre le mouvement de rotation directement, et, alors qu'ils s'appliquent couple, ils ne mesurent pas directement le couple. De plus, elles limitent la rotation libre de l'attache d'acide nucléique. Ici, nous présentons deux extensions de pinces magnétiques. Les premiers, librement orbite pinces magnétiques appelés (FOMT, figure 1b) 21, permet des mesures de fluctuations et les changements dans la torsion de molécules d'acide nucléique captifs angle équilibre, sans contraindre le mouvement de rotation autour de l'axe d'attache. Le second, appelé magnétiques pinces de couple (MTT, figure 1c), qui a la capacité d'appliquer et de mesurer directement les forces et les couples de biomolécules uniques 22-27.
Dans le protocole suivant, nous supposons que le lecteur a à sa / son caractère un instrument «classique» de MT. Nous renvoyons le lecteur à la discussion des références sur la façon de construire et gérer un MT mis en place, ainsi que considérations qui doivent être prises en compte dans la sélection des billes magnétiques, les aimants, et les routines de suivi. En outre, les articles 1 et 2 du Protocole texte décrivent comment nous préparons généralement et incuber un échantillon d'ADN pour utilisation dans la MT ainsi que les mesures préliminaires qui peuvent être exécutées sur un seul ADN dans le MT classique. Les articles 3 et 4 du Protocole texte illustrent comment un instrument MT peut être facilement adapté et utilisé pour les mesures FOMT et MTT.
Lors de l'exécution des expériences utilisant le MTT ou la FOMT, un certain nombre de choix doivent être faits en ce qui concerne des perles, des aimants, des protocoles de suivi, etc Les meilleurs choix à faire dépendront de l'expérience d'intérêt. Ci-dessous, nous décrivons les compromis qui accompagnent des choix différents, ce qui devrait faciliter la sélection d'une expérience particulière. Ensuite, nous décrivons plusieurs étapes critiques qui accompagnent l'alignement et le fonctionnement des expériences MTT et FOMT. Enfin, nous discutons de l'importance de la MTT et FOMT par rapport aux méthodes existantes ainsi que les applications futures.
Considérations avant le début de MTT et FOMT expériences
Toute expérience oblige à sélectionner un type de bille magnétique pour utilisation. On peut choisir entre plusieurs disponibles dans le commerce des perles recouvertes de streptavidine superparamagnétiques, par exemple, de 0,25 um billes de rayon, 0,5 um billes de rayon, soit 1,4 um billes de rayon (de see la table des matières). Grandes perles auront un moment magnétique accrue par rapport aux petites perles (environ échelle que le volume) et donc leur utilisation facilitera l'application de forces supérieures (pour les forces typiques obtenus dans nos instruments, voir le tableau 1). Lorsque le suivi angulaire en utilisant des billes de marqueur est souhaitée, nous travaillons généralement avec 1,4 um rayon et utilisons 0,5 um rayon perles biotinylés non-magnétiques comme des perles de marqueurs (voir le paragraphe 1.9 du protocole de fixation correspondante). L'utilisation de petites perles est particulièrement recommandé pour la FOMT, comme le temps caractéristique de rotation de perle τ C est égal au rapport de la traînée du système sur son ressort constante γ / k θ; Surtout, le coefficient de traînée de rotation pertinentes pour les échelles de l'échelle de temps de mesure angulaire que R ~ bourrelet 3, c'est à dire avec la troisième puissance du rayon (voir le tableau 2 pourles échelles de temps caractéristique pour plusieurs combinaisons de perles ADN dans FOMT et des mesures de MTT). Réductions d'accompagnement à la force maximale pouvant être appliquées peuvent être traitées en utilisant une pile renversé des aimants cylindriques 27. Néanmoins, dans les mesures FOMT il peut parfois être nécessaire de faire des compromis entre la meilleure résolution temporelle réalisable et la force maximale appliquée.
En outre, une expérience requiert la sélection d'une configuration d'aimant. Dans la configuration classique des pinces magnétiques (figure 1a), on utilise typiquement une paire de 5x5x5 mm aimants cubes en orientation verticale avec un écart de 0,5 ou 1 mm entre les aimants 4. Lorsque les aimants sont espacés le long de l'axe x (y), on obtient un champ magnétique qui est essentiellement dirigé le long de l'axe x (y). Pour les expériences FOMT, un aimant de forme cylindrique est sélectionné au centre de laquelle le champ magnétique est essentiellement dirigéle long de l'axe z (figure 1b). Dans la pratique, on utilise un empilement de trois de ces aimants de forme cylindrique, chacune ayant un diamètre de 6 mm et un trou central d'un diamètre de 2 mm, pour une épaisseur totale de 6 mm. Lorsque des forces de traction plus élevées sont souhaitées, une configuration magnétique "de la pile renversé", dans lequel l'aimant inférieur est empilée avec une aimantation opposée est préféré. Pour atteindre la configuration de MTT (Figure 1c), on ajoute un petit aimant supplémentaire sur le côté de la pile principale de l'aimant de la configuration FOMT, typiquement un cylindre solide ayant un diamètre de 4 mm et une hauteur de 7 mm. Pour voir comment les forces maximales obtenus dans nos instruments dépendent de la configuration de l'aimant, voir le tableau 1.
L'alignement de MTT et FOMT expériences
Etant donné que les billes magnétiques ont une surface (approximativement) uniformément fonctionnalisé (typiquement la streptavidine) et depuis la fixation à la fois du n fonctionnaliséattaches d'acide ucleic et perles de marqueurs (au cas où la poursuite angulaire à base de billes marqueur est utilisé) se produit via un simple incubation dans une solution, on ne contrôle pas où l'attache et / ou marqueur perle attachent à la bille magnétique. Les billes magnétiques ont un axe de magnétisation préféré qui tend à aligner le long de la direction du champ externe. Si l'on note les points où l'axe de magnétisation préférée croise la surface de la perle que les pôles nord et sud, puis perles où l'ADN-attache est fixé près de l'équateur seront tracer un anneau circulaire avec un rayon proche ou légèrement supérieure à la rayon de la bille dans le FOMT; en revanche, les perles qui sont attachés près du pôle sud fluctuent sur un anneau circulaire très petit rayon dans la FOMT, ce qui peut empêcher le montage du cercle en utilisant les équations 3-5. Nous notons que par la géométrie sphérique simple, la probabilité de fixation à proximité de l'équateur est beaucoup plus grande que un attachement exactement aux pôles; par conséquent, les plus bEADS être attaché de telle sorte que le suivi angulaire basée sur le plan (x, y) peut être effectuée avec succès.
Un argument similaire vaut pour la fixation des perles de marqueurs pour le marqueur à base de poursuite angulaire de repère. Le cordon de marqueur est utilisé pour créer une asymétrie dans l'image de la bille magnétique qui permet le suivi de l'angle. Si le cordon de marqueur est fixé exactement au niveau du pôle nord ou sud de la bille (à savoir directement au-dessus ou sur le dessous), l'image obtenue est toujours symétrique en rotation et le protocole de repérage angulaire échoue. Cependant, par le même argument de géométrie sphérique, la possibilité pour un cordon de marqueur pour attacher directement à l'un des pôles est relativement faible; nous constatons que dans la pratique la plupart des perles de marqueurs donnent une asymétrie suffisante pour permettre le suivi angulaire. Enfin, nous notons que dans les pinces magnétiques classiques, la direction du champ est en (x, y)-plan; par conséquent, l'axe du cordon d'aimantation préférés s'aligneront dans ee (x, y)-plan et les pôles nord et sud, tel que défini ci-dessus, vont être aux côtés de la perle, peu probable que la situation dans le FOMT ou MTT, où les pôles sont en haut et en bas.
Dans des expériences FOMT, une étape essentielle est l'alignement de l'aimant cylindrique de telle sorte que le champ magnétique radial est négligeable au voisinage de la perle. Cet alignement est effectuée pour une seule bille à la fois. Pour juger si un mouvement de talon dans le FOMT est répartie uniformément sur un anneau circulaire, le temps de mesure doit être supérieure à 20 · C τ. Comme τ est égal à C ~ 45 sec à 8 kpb de l'ADN et une bille de 0,5 mm de rayon, le temps de mesure est d'environ 900 secondes dans la phase finale de l'alignement. A titre de comparaison, l'utilisation de l'ADN 1,9 kb et 0,25 mm perles de rayon réduit τ C vingt fois à ~ 2 sec (voir également le tableau 2).
Étapes critiques et des considérations pour le suivi des cours de FOMT et MTT expériences
Pour suivre les variations du talon dans le plan, c'est à dire sa position (x, y) en position, on emploie une analyse de corrélation croisée des profils d'intensité affichée par un bourrelet à des intervalles de temps suivants 35, 36. Ceci peut être effectué à une résolution inférieure au pixel avec une précision de quelques nanomètres à 20. Pour suivre le mouvement de la bille en z, nous utilisons généralement une méthode d'abord conçue par Gosse et Croquette, dans lequel le plan focal de l'objectif (OFP) est précisément déplacé dans la direction verticale tandis que l'imagerie des anneaux de diffraction du cordon attaché à l'acide nucléique 20 . De cette manière, un profil d'étalonnage est générée à corréler le spectre de diffraction de la nervure à la distance entre le bourrelet et le PFO 19. Lorsque ce profil de calibrage est interpolée, les déplacements verticaux du bourrelet peuvent être également mesurées avec une précision allant jusqu'à quelques nm 20.Nous renvoyons le lecteur aux références supplémentaires qui décrivent des algorithmes plus raffinés de suivi 37, 38 ainsi que leur application au suivi de plusieurs perles 5, 6, 37 parallèles.
Lorsque vous utilisez le suivi angulaire qui repose sur la conversion de (x, y) positions en coordonnées angulaires, nous vous conseillons de procéder comme suit. À partir d'une trace de temps dans laquelle le bourrelet trace une couronne circulaire, utilise le (x i, y i) positions (où l'indice i désigne les points de mesure ultérieurs) en fonction du centre du cercle (x 0, y 0) et cercle de rayon R (figure 2a) en réduisant au minimum:
(3)
où la somme s'étend sur tous les points de données. Après Fitting x 0, y 0, et R cercle, déterminer les coordonnées polaires (r i, θ i) de chaque point de données dans la trace de temps à l'aide:
(4)
(5)
Notez que l'on doit prendre soin de "déballer" l'angle θ, c'est à dire d'ajouter des sauts de phase de ± π le cas échéant. Code personnalisé écrit pour le montage et la conversion de (x, y) à (r, θ) coordonne est disponible auprès des auteurs sur demande. Dans le FOMT, une trace temporelle dans laquelle le bourrelet trace une couronne circulaire peut être obtenue par la réalisation de l'alignement grossier (cf. étape 3.3) et en enregistrant les variations thermiques de la perle. Dans le MTT, fluctuation thermiquetions sont insuffisantes pour tracer l'anneau circulaire; à la place, utiliser une trace du temps où les aimants sont lentement (généralement à 0,1 Hz) tourné par plusieurs tours pour s'adapter le cercle en utilisant les équations 3-5.
Nous notons que pour le MTT, il est important de choisir l'approche de suivi angulaire appropriée, soit par l'intermédiaire d'un marqueur de suivi angulaire (figure 1c, figure 1d, figure 3a) ou via la conversion de (x, y) positions en coordonnées angulaires ( Figure 1d, figure 2b). Bien que généralement la précision de la poursuite angulaire à partir de (x, y)-positions et l'utilisation de billes de marquage sont comparables, il est important de réaliser que la diaphonie se produit entre les fluctuations d'une perle en (x, y) et dans l'angle, comme décrit dans l' Janssen et al 32: ainsi, le suivi angulaire de (x, y) positions n'est valable que pour autant que les fluctuations browniennes en (x, Y) ne contribuent que de façon négligeable à l'incertitude de la coordonnée angulaire, et son utilisation appropriée de (x, y) de suivi peut nécessiter de réglage de la raideur de la trappe de rotation par l'intermédiaire de l'ajustement de la position de l'aimant latéral. En règle générale, l'utilisation de la raideur plus élevée piège requiert l'utilisation de poursuite angulaire en utilisant des billes de marquage. L'utilisation de billes de marquage nécessite une étape supplémentaire de fixation, ce qui peut réduire le nombre d'attaches utilisables (voir le protocole d'attachement à l'étape 1.9). Lors de l'utilisation du suivi en fonction de talon-terrain, il est important de sélectionner des billes magnétiques qui ont un bourrelet de marqueur est fixé près de l'équateur pour obtenir les meilleurs résultats.
Importance de la FOMT et MTT Approches par rapport aux méthodes et applications existantes
Dans ce qui précède, nous avons montré comment on peut, à partir de MT classique, facile à modifier les configurations magnétiques pour convertir l'instrument en MTT ou FOMT. Cette m simpleodification, qui peut être accompagné par la mise en place du suivi angulaire lorsque l'utilisation d'un marqueur de suivi angulaire est souhaitée, est un point fort immédiate des deux configurations, car il permet à l'utilisateur d'appliquer un couple, mesurer le couple, ou de mesurer la torsion en fonction de la expérimenter à portée de main. Comme mentionné dans l'introduction, à la fois FOMT et MTT profit de la plupart des forces existantes de MT, notamment leur simplicité, avec le MTT en particulier en bénéficiant de la capacité de mesures parallèles 5, 6 (ce ne sont pas aussi facilement atteints en FOMT donné l'exigence d'alignement de l'élément d'attache par rapport au centre de l'aimant cylindrique). Notamment, MTT et FOMT ne nécessitent pas, contrairement à d'autres techniques, spécialement des particules de nano-fabriqué 22, 39, 40, conception optique complexe 41, ou l'introduction de perles supplémentaires dans le captif (ADN) 42. Cette outres techniques peuvent néanmoins fournir d'autres avantages comme la haute résolution temporelle 27, 43, 44. Les deux FOMT et MTT devraient trouver des applications futures dans l'étude de la transformation du génome, comme le comportement des moteurs moléculaires sur l'ADN est à la fois influencé par et a des conséquences sur la touche locale et de couple. Des applications supplémentaires peuvent être trouvés dans le domaine émergent de la nanotechnologie de l'ADN 27 ou dans le domaine plus large de moteurs rotatifs actifs dans le traitement biologique 7, 45.
M270 (R bourrelet = 1,4 um) | MyOne (R bourrelet = 0,5 um) | Ademtech (R bourrelet = 0,25 pm) | |
MT classique (paire de cubes de 5 x 5 x 5 mm 3 aimants, 1 écart mm, alignement vertical) | 70 pN | 8 pN | 1,6 pN |
FOMT ou MTT * (empilement de trois aimants cylindriques, de diamètre 6 mm, écart 2 mm de diamètre) | 9 pN | 1 pN | 0,2 pN |
FOMT ou MTT * (empilement de trois aimants cylindriques, un diamètre de 6 mm, une fente de mm de diamètre) | 18 pN | 2 pN | 0,4 pN |
FOMT ou MTT * (pile de trois aimants cylindriques dernier retournées, espace de 1 mm de diamètre) | ~ 50 pN | 9 pN | 1,8 pN |
* La présence du petit aimant latéral dans le MTT a un effet négligeable sur la force d'étirement
Tableau 1. Forces maximales généralement obtenus pour les configurations magnétiques différentes et de types de perles.
R bourrelet = 1,4 um | R bourrelet = 0,5 pm | R perle =0,25 um | |
Coefficient de frottement * | 120 pN · nm · s | 5,5 pN · nm · s | 0,7 pN · nm · s |
Échelle de temps caractéristique: FOMT, 10 kbp ADN ** | 1200 sec | 55 sec | 7 s |
Échelle de temps caractéristique: FOMT, ADN de 1 kbp | 120 sec | 5.5 sec | 0,7 sec |
Échelle de temps caractéristique: MTT, k q = 100 pN · nm / rad | 1,2 s | 0,06 sec | 0,007 sec |
Échelle de temps caractéristique: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0,12 sec | 0,006 sec = 6 ms | 0.0007 s = 0,7 ms |
* Coefficient de friction pour une rotation autour d'un axe passant par le "équateur" (c'est à dire la situation représentée sur la figure 1b), Donnée par 14 · p · h · R bourrelet 3, où h est la viscosité du tampon.
** Dans le FOMT, la raideur de la trappe de rotation est donnée par la rigidité en torsion de l'ADN, k q, ADN = C · k B T / L C, où C est la longueur de torsion efficace de persistance, qui est supposé être de 80 nm ici ( qui est caractéristique d'un régime de force intermédiaire, F ~ 1 pN) et C L est la longueur du contour de l'ADN, de 0,34 nm par paire de bases.
Tableau 2. Coefficients de frottement et temps caractéristique des échelles pour FOMT et MTT.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la TU Delft, l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), la Fondation pour la recherche fondamentale sur la matière, et par la Fondation européenne de la science.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |