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Bioengineering

ट्विस्ट और टोक़ के मापन के लिए चुंबकीय चिमटी

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

Summary

चुंबकीय चिमटी, एक शक्तिशाली अणु हेरफेर तकनीक, जैविक अणुओं में (चुंबकीय टोक़ चिमटी करार दिया एक विन्यास का उपयोग) और टोक़ (एक चुंबकीय चिमटी आज़ादी की परिक्रमा बुलाया विन्यास का उपयोग) मोड़ के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुकूलित किया जा सकता. इस तरह के मापन के प्रदर्शन के लिए दिशानिर्देश डीएनए और एसोसिएटेड Nucleo प्रोटीन filaments का अध्ययन करने के लिए आवेदन पत्र सहित दिए गए हैं.

Abstract

एकल अणु तकनीक यह संभव वास्तविक समय में समाधान में व्यक्तिगत जैविक अणुओं के व्यवहार की जांच करने के लिए बनाते हैं. इन तकनीकों में ऐसे परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में तथाकथित बल स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण, ऑप्टिकल चिमटी, खींच प्रवाह, और चुंबकीय चिमटी शामिल हैं. इन तरीकों में से, चुंबकीय चिमटी एक निरंतर खींच बल को बनाए रखते हुए टोक़ लागू करने की क्षमता के आधार पर स्वयं को प्रतिष्ठित किया है. यहां, यह साफ है कि कैसे इस तरह के एक "पारंपरिक" चुंबकीय चिमटी प्रयोगात्मक विन्यास, अनुप्रस्थ क्षेत्र की भयावहता को कम करने के लिए अपने क्षेत्र विन्यास का एक सरल संशोधन के माध्यम से, एक जैविक अणु में मोड़ की डिग्री को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. जिसके परिणामस्वरूप विन्यास आज़ादी की परिक्रमा चुंबकीय चिमटी करार दिया है. इसके अतिरिक्त, यह क्षेत्र विन्यास के आगे संशोधन & # के बीच मध्यवर्ती एक परिमाण के साथ एक अनुप्रस्थ क्षेत्र प्राप्ति कर सकते हैं कि कैसे दिखाया गया है8220; पारंपरिक "चुंबकीय चिमटी और यह संभव सीधे एक जैविक अणु में संग्रहित टोक़ को मापने के लिए बनाता है जो आज़ादी की परिक्रमा चुंबकीय चिमटी,. यह विन्यास चुंबकीय टोक़ चिमटी करार दिया है. साथ वीडियो आज़ादी की परिक्रमा चुंबकीय चिमटी और चुंबकीय टोक़ चिमटी में पारंपरिक चुंबकीय चिमटी का रूपांतरण पूरा किया जा सकता है कि कैसे विस्तार से बताते हैं, और इन तकनीकों के उपयोग को दर्शाता है. यह बहुत शक्तिशाली साधन की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करते हुए इन रूपांतरों पारंपरिक चुंबकीय चिमटी की सभी शक्तियों को बनाए रखने.

Introduction

हाल के वर्षों में, एकल अणु तकनीक उनके कैनेटीक्स और अंतर्निहित mechanochemistry में अंतर्दृष्टि उपज processive मोटर प्रोटीन और अन्य एंजाइमों के अध्ययन में उनके व्यापक प्रयोज्यता साबित किया है. बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के संदर्भ में महत्वपूर्ण योगदान परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी खींच प्रवाह, और ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी द्वारा किया गया है. ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी (एमटी), विशेष रूप से उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ आणविक हेरफेर के मामले में काफी लचीलापन के संयोजन में सफल रहा है. यहाँ, हम एक सतह और superparamagnetic मोती 1-3 के बीच सीमित जैविक अणुओं के लिए दोनों खींच बलों और torques आवेदन कर सकते हैं, जो माउंट पर ध्यान केंद्रित.

चुंबकीय चिमटी (एमटी, चित्रा 1 ए) के मैकेनिकल न्यूक्लिक एसिड के गुण के साथ ही प्रोटीन के साथ उनकी बातचीत दोनों की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक बहुत बहुमुखी एकल अणु तकनीक हैं. एमटी कई ताकत हैसमग्र सादगी और मजबूती प्रायोगिक कार्यान्वयन की, टोक़ की सतही आवेदन, प्राकृतिक संचालन और निरंतर बल मोड 4 में सीधा अंशांकन, माप 5, 6 समानांतर एक्सटेंशन, और नमूना हीटिंग और photodamage के अभाव सहित,. अन्य एकल अणु तरीकों की तुलना में, मीट्रिक टन ≈ 10 एफ एन जितनी कम बलों पर बल निर्भरता मापन प्रदर्शन और straightforwardly सुपर कॉइलिंग की डिग्री नियंत्रित करने की क्षमता के लिए एक रास्ता प्रदान करते हैं. टन मुख्यतः न्यूक्लिक एसिड 7, 8 को शामिल जैविक प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक प्रायोगिक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है, वे भी प्रोटीन 9-13 या कोशिकाओं 10, 14-17 के यांत्रिक गुणों के अध्ययन में आवेदन मिल गया है. कई उपयोगी संदर्भ एक मीट्रिक टन 4, 18-20 निर्माण और कैसे चलता है कि उपलब्ध हैं.

Howevएर, पारंपरिक मीट्रिक टन वे टोक़ आवेदन करते हैं, वे सीधे टोक़ उपाय नहीं है, सीधे घूर्णी गति को ट्रैक, और नहीं है. इसके अलावा, वे न्यूक्लिक एसिड तार से मुक्त रोटेशन विवश. यहाँ, हम चुंबक चिमटी के दो एक्सटेंशन उपस्थित थे. पहला, करार दिया आज़ादी का चक्कर लगाने वाले चुंबकीय चिमटी (FOMT, चित्रा 1 बी) 21, की अनुमति देता है पगहा धुरी के चारों ओर घूर्णी गति में बाधा के बिना संतुलन कोण उतार चढ़ाव और सीमित न्यूक्लिक एसिड अणुओं के मोड़ में परिवर्तन की माप,. दूसरा, चुंबकीय टोक़ चिमटी एकल biomolecules 22-27 के लिए दोनों बलों और torques लागू करते हैं और सीधे उपाय करने की क्षमता है जो (MTT, चित्रा -1 सी), करार दिया.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम पाठक उसकी / उसके स्वभाव एक 'पारंपरिक' मीट्रिक टन साधन पर है कि अनुमान है. हम निर्माण और चलाने के लिए स्थापित एक लाख टन है, साथ ही करने के बारे में संदर्भ के लिए चर्चा करने के लिए पाठक उल्लेख consideचुंबकीय मोती, मैग्नेट, और ट्रैकिंग दिनचर्या के चयन में ध्यान में रखा जाना चाहिए कि राशन. इसके अलावा, 1 वर्गों और प्रोटोकॉल पाठ के 2 हम आम तौर पर तैयार है और मीट्रिक टन में इस्तेमाल के लिए एक डीएनए नमूने के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक मीट्रिक टन में एक डीएनए पर प्रदर्शन किया जा सकता है कि प्रारंभिक माप सेते क्या करते हैं. प्रोटोकॉल पाठ की धारा 3 और 4 के एक मीट्रिक टन साधन आसानी से अनुकूलित और FOMT और MTT माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन कैसे.

Protocol

एक डीएनए नमूने के 1. तैयारी और ऊष्मायन

  1. क्रमश: 18 एकाधिक बायोटिन और digoxigenin समूहों के साथ क्रियाशील कर रहे हैं कि समाप्त होता है (आमतौर पर ≈ 600 बीपी डीएनए पीसीआर टुकड़े को रोजगार) द्वैध की ligated हैं कि डीएनए निर्माणों को तैयार है. शुरू करने के लिए,> 1 एक डीएनए तार लंबाई माइक्रोन, जैसे, यहां कार्यरत के रूप में ~ 2.7 माइक्रोन की एक बढ़ाकर लंबाई को इसी 7.9 KBP, उपयोग में आसानी के लिए सिफारिश की है; विशेष रूप से, करने के लिए इसी तरह की या मनका त्रिज्या की तुलना में कम है कि एक डीएनए लंबाई का उपयोग कारण MTT और FOMT में अनुलग्नक ज्यामिति के लिए समस्याग्रस्त है. डीएनए लंबाई कोणीय डोमेन अस्थायी प्रतिक्रिया को प्रभावित करती है की एक विवरण के लिए चर्चा देखें.
  2. एकल अणु प्रयोगों के लिए प्रवाह कोशिकाओं को इकट्ठा करो. प्रवाह कोशिकाओं के लिए, एक डबल परत Parafilm स्पेसर द्वारा अलग दो गिलास खुर्दबीन coverslips का उपयोग करें. शीर्ष खुर्दबीन coverslip में और द्रव सेल करने के लिए दुकानों के लिए दो छेद होना चाहिए. यह करने के लिए सुविधाजनक हैछेद ड्रिल करने के लिए एक sandblaster का उपयोग करें. नीचे coverslip nitrocellulose (amyl एसीटेट में 0.1% wt / खंड) के साथ लेपित है. नीचे स्लाइड के nitrocellulose में लिपटे पक्ष पर Parafilm spacers रखें और स्वच्छ शीर्ष स्लाइड के साथ शीर्ष बंद करें.
  3. प्रवाह कोशिकाओं सील. शारीरिक चिमटी का प्रयोग, ~ 1 मिनट के लिए 80-100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक हीटर प्लेट पर इकट्ठे प्रवाह सेल जगह है. Parafilm में और आउटलेट, और गिलास स्लाइड अच्छी तरह से जुड़ रहे हैं कि करने के लिए कनेक्ट उस छेद को बंद नहीं करता है, प्रवाह सेल अच्छी तरह से सील कर दिया है कि ध्यान दे.
    नोट: एक अच्छा सील सुनिश्चित करने के लिए यह एक बड़ा कपास झाड़ू का उपयोग स्ट्रोक बाहर Parafilm में बुलबुले की सिफारिश की है. प्रवाह सेल तो चुंबकीय चिमटी साधन पर रखा जा सकता है.
  4. बफ़र्स तैयार करें. ते tethering बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 8.0 पीएच, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), और 200 मिमी NaCl) तैयार करें. वैकल्पिक रूप से, एक (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच) डब्ल्यू पूरक पीबीएस बफर का उपयोग कर सकते हैंith 100 माइक्रोग्राम / एमएल BSA, tethering बफर के रूप में 0.1% बीच और 5 मिमी सोडियम azide (पीबीएस). प्रवाह सेल में फ्लश 2-3 सेल संस्करणों ते tethering बफर.
  5. ~ 30 मिनट के लिए प्रवाह सेल में 0.5 या 1.5 माइक्रोन त्रिज्या गैर चुंबकीय लेटेक्स मोती सेते हैं. ये मोती एक (प्रवाह सेल यानी) उद्देश्य और नमूना धारक के बीच बहाव के प्रभाव को कम करने के लिए अनुमति देते हैं कि चुंबकीय चिमटी माप के दौरान संदर्भ मोती के रूप में कार्य करेगा. ते tethering बफर के 2-3 सेल संस्करणों के साथ rinsing द्वारा स्वाधीन गैर चुंबकीय मोतियों फ्लश.
  6. कम से कम 1 घंटे के लिए पीबीएस में 100 माइक्रोग्राम / एमएल विरोधी digoxigenin साथ ऊष्मायन द्वारा प्रवाह सेल के नीचे की सतह functionalize (अधिमानतः अब, ऊष्मायन रात भर बाहर किया जा सकता है), डीएनए कुर्की के लिए प्रदान करने के लिए. ते tethering बफर के 2-3 सेल संस्करणों के साथ कुल्ला. अंत में सतह passivation के लिए 30 मिनट के लिए ते tethering बफर में 2 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (BSA) के साथ प्रवाह सेल सेते हैं.
  7. एक विभाज्य की लो2 मिलीलीटर streptavidin लेपित superparamagnetic MyOne मोती (माल की चर्चा और टेबल देखें) और 10 मिलीलीटर ते tethering बफर के साथ पतला. 10 मिलीलीटर ते tethering बफर में एक चुंबकीय कण concentrator, और resuspend का उपयोग कर 10 मिलीलीटर ते tethering बफर के साथ दो बार धोएं. 30 मिनट के लिए ते tethering बफर में ऊष्मायन द्वारा इन मोतियों को डीएनए अणु (लगभग 1 एनजी) के ~ 1 मिलीलीटर देते हैं.
  8. 90 मिलीलीटर ते tethering बफर जोड़कर डीएनए सीमित superparamagnetic मोती दस गुना का समाधान पतला. अंत में, प्रवाह सेल में समाधान इंजेक्षन और विरोधी digoxigenin लेपित सतह के लिए डीएनए कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए ~ 1 घंटे के लिए सेते हैं. ते tethering बफर के साथ अच्छी तरह से प्रवाह सेल धो लें. डीएनए पगहा निर्माणों की ऊष्मायन के बाद, सभी गैर जुड़ी मोतियों को दूर करने के लिए (इस ते tethering बफर) हो सकता है प्रयोगात्मक बफर के साथ बड़े पैमाने पर फ्लश.
  9. चुंबकीय मोतियों से जुड़ी मापकला मार्कर मोतियों की आवश्यकता है कि एक कोणीय ट्रैकिंग प्रोटोकॉल है कि रोजगार माप के लिए

पारंपरिक चुंबकीय चिमटी में एक डीएनए अणु पर 2. माप

  1. प्रवाह सेल में rotationally विवश डीएनए अणु के लिए खोज, एक पारंपरिक मीट्रिक टन (चर्चा देखने के लिए) उपयुक्त क्षेत्र विन्यास के साथ (चित्रा 1 ए) और translational और चुंबक की स्थिति के घूर्णी नियंत्रण दोनों का उपयोग करना. ≥ 1 पी.एन. की ताकतों खींच (चुंबकीय चिमटी में बल अंशांकन के बारे में संदर्भ 4, 19, 20, 28, 29 से परामर्श), सीमित मोती आसानी से फोकस में उनकी अलग अलग ऊंचाई से नीचे स्लाइड की सतह के लिए अटक मोती से प्रतिष्ठित किया जा सकता . एक डीएनए अणु rotationally विवश है चाहे 20-30 बारी शुरू करने से आकलन किया जा सकता है≈ 0.25 पी.एन. के बल पर मैग्नेट के एस: यहाँ, तार लंबाई 0.4-0.5 माइक्रोन से कम करना चाहिए.
    नोट: चुंबकीय चिमटी प्रयोगों को चलाने के लिए, इमेज प्रोसेसिंग डीएनए सीमित मोतियों की एक्स, वाई, जेड और स्थिति निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस उद्देश्य के लिए कस्टम Labview सॉफ्टवेयर अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है.
    1. मनका एक डीएनए तार से जुड़ा हुआ है की जाँच करें. यह> 1 PN (2A चित्रा) के बलों पर सकारात्मक और नकारात्मक बदल जाता है के तहत व्यवहार की तुलना द्वारा किया जा सकता है. एकल डीएनए tethers एक असममित प्रतिक्रिया को जन्म देगा, जबकि इस बल के शासन में, कई डीएनए tethers की उपस्थिति, सकारात्मक और नकारात्मक बदल जाता है शुरू करने पर विस्तार में एक लगभग सममित कमी को जन्म देगा.
  2. उचित तय मोतियों के लिए खोज संदर्भ मोती के रूप में सेवा कर सकते हैं कि ब्याज के तार के आसपास के क्षेत्र में नीचे की सतह के लिए अटक गया.
  3. टी की लंबाई जांचनावह डीएनए, एल. flowcell सतह की स्थिति (0.2 पी.एन. नीचे एक बल पर ~ 60 मुड़ता द्वारा चुंबक घूर्णन द्वारा, उदाहरण के लिए) की सतह के साथ संपर्क में सीमित मनका लाकर निर्धारित किया जा सकता है. इस सतह के संबंध में सीमित मनका के ऊर्ध्वाधर स्थिति का माप तो एल के निरपेक्ष मूल्य पर रिपोर्ट.
    नोट: बहाव के बाद प्रभाव को कम करने के लिए, यह सतह पर चिपका एक संदर्भ मनका के पद पर एल रिश्तेदार की माप प्रदर्शन करने की सलाह दी है.
  4. एक रोटेशन वक्र ≈ 0.25 PN (2A चित्रा) के एक खींच बल पर (बदल जाता है की संख्या के एक समारोह के रूप में डीएनए विस्तार की यानी एक माप) रिकार्ड.
    1. इस डीएनए अणु torsionally आराम है, जिस पर राज्य करने के लिए संगत के रूप में विस्तार, अधिक से अधिक है, जिस पर जाता है की संख्या निर्धारित करते हैं. ऐसा करने के लिए, यह केंद्र की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक परवलयिक या एक गाऊसी समारोह के साथ स्थानीय स्तर पर रोटेशन वक्र फिट करने के लिए उपयोगी हैपर. "शून्य में बदल जाता है" के रूप में इस बिंदु को परिभाषित.
      नोट: इस उद्देश्य के लिए एक कस्टम लिखा दिनचर्या अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है.
  5. ~ 20 चुंबक पदों की एक श्रृंखला के लिए, (, "शून्य में बदल जाता है" पर यानी कदम 2.4.1 देखें) torsionally-आराम अणु की औसत विस्तार निर्धारित Z-ट्रेस से.
  6. 2.5 कदम में प्रत्येक माप बिंदु के लिए, ठीक एक्स या वाई स्थिति 20, 28, 29 में उतार चढ़ाव से खींच बल का निर्धारण, या, मनका के आकर्षण संस्कार स्थानीय क्षेत्र ढाल 4 के ज्ञान का उपयोग कर, अच्छी तरह से जाना जाता है प्रदान की. एक बल विस्तार वक्र में औसत विस्तार परिणामों बनाम खींच बल की साजिश रचने चित्रा (2 बी).
    1. Bouchiat एट अल 30 से बहुपद सन्निकटन का उपयोग कीड़ा की तरह श्रृंखला समीकरण को परिणामी बल विस्तार डेटा फिट.
    बाद में FOMT माप के लिए तैयारी कर रहा है (एक्स, वाई) में चुंबकीय मनका के आस जबकि रिकॉर्डिंग, धीरे धीरे मैग्नेट बारी बारी से.
    नोट: पारंपरिक मीट्रिक टन विन्यास में जिसके परिणामस्वरूप वलय की त्रिज्या छोटे, अधिक बारीकी से डीएनए अणु करीब चुंबकीय मनका के "दक्षिण ध्रुव" के लिए सीमित है. एक FOMT विन्यास पर स्विच करते हैं, इस तरह के एक डीएनए अणु (एक्स, वाई) की स्थिति (चर्चा देखने के लिए) से रोटेशन कोण की विश्वसनीय ट्रैकिंग सक्षम बनाता है जो चुंबकीय मनका के "भूमध्य रेखा", को बारीकी से सीमित हो जाएगा.

आज़ादी की परिक्रमा चुंबकीय चिमटी का उपयोग डीएनए ट्विस्ट की 3. माप

  1. मैन्युअल FOMT (चित्रा 1 बी) के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक बेलनाकार चुंबक द्वारा पारंपरिक चुंबकीय चिमटी के वर्ग मैग्नेट जगह. इस आपरेशन के लिए चयनित डीएनए पगहा देखने के क्षेत्र के भीतर रहता है कि इस तरह से किया जाना चाहिए. यह बस पारंपरिक चिमटी विन्यास के लिए मैग्नेट मानती है कि पूर्ण चुंबक सिर unscrewing और FOMT के लिए एक बेलनाकार चुंबक धारण एक चुंबक सिर से यह जगह से कम से कम 1 मिनट में पूरा किया जा सकता है.
  • एक भी dsDNA पगहा द्वारा सीमित एक चुंबकीय मनका की (एक्स, वाई) में भ्रमण बेलनाकार चुंबक (चित्रा 1 बी, चित्रा 3 ए) की धुरी के संबंध में तार की स्थिति पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं. विशेषता अस्थिरता पैटर्न के भीतर इसी स्थान (चित्रा 3A निर्धारित करने के क्रम में (एक्स, वाई) भ्रमण रिकॉर्ड चर्चा).
  • FOMT में चुंबक के मोटे संरेखण प्रदर्शन करना. यह (एक्स, वाई) अनुवाद चरणों का उपयोग कर प्रवाह सेल ऊपर बेलनाकार चुंबक ले जाकर प्राप्त किया जा सकता है. (एक्स, वाई) भ्रमण के एक चाप का पालन करें, बेलनाकार चुंबक ठीक से गठबंधन किया और स्थानांतरित करने के लिए की जरूरत नहीं हैउचित दिशा में (चित्रा 3 बी).
    1. मोटे संरेखण 7.9 KBP tethers साथ MyOne मोती के मामले के लिए 15 मिनट के भीतर पूरा किया, और किया जा सकता है जब पूरा परिपत्र गति (चित्रा 3 बी, केंद्र) के निरीक्षण में (एक्स, वाई) भ्रमण के परिणाम की माप.
      नोट: मोटे संरेखण 21, 31 (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 5), इस तथ्य के बावजूद साथ दो आयामी हिस्टोग्राम इसके मायने रखता है नहीं हो सकता है FOMT विन्यास में सीमित एकल DNAs के लिए बाध्य प्रोटीन से हुआ मोड़ में परिवर्तन का पालन करने के लिए आमतौर पर पर्याप्त है बिल्कुल समान रूप से परिपत्र वलय (चित्रा -3 सी) के साथ वितरित की.
  • आगे के प्रयोगों के लिए यदि आवश्यक हो, FOMT में ठीक संरेखण प्रदर्शन करते हैं. इस प्रतिशत को चुंबक या प्रवाह सेल को स्थानांतरित करने के लिए या तो उच्च संकल्प सुक्ष्ममापी शिकंजा या एक उच्च संकल्प स्वचालित मंच का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता हैएर ~ 10 माइक्रोन के भीतर करने के लिए मनका पर बेलनाकार चुंबक. ठीक संरेखण चरण में, चुंबक ध्यान से वृत्त वलय ​​पर उतार चढ़ाव की वजह से चुंबक को पूर्ण रोटेशन के लिए ऊर्जा बाधा के बी टी (चित्रा 4) है, जहां एक की स्थिति के लिए इसी लगभग एक समान हैं कि इस तरह की स्थिति में है.
    नोट: चित्रा 4 में के रूप में एक हिस्टोग्राम या thermogram में उतार चढ़ाव की साजिश रचने के लिए एक matlab स्क्रिप्ट अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है.
    नोट: ललित संरेखण 7.9 KBP tethers साथ MyOne मोती के मामले के लिए 45 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है, और छोटे मोती और कम tethers के लिए कम समय सीमा में (चर्चा देखने के लिए) में कार्यरत हैं.
    नोट: ललित संरेखण आमतौर पर नंगे या प्रोटीन में लिपटे डीएनए की मरोड़ कठोरता की माप (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 4) प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है.
  • विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं, FOMT में बल जांचना. यह मैं किया जा सकता हैमनका के आकर्षण संस्कार प्रदान की <r 2> (angled कोष्ठक समय औसत निरूपित जहां) के साथ वीडियो में दिखाया गया है और Lipfert एट अल 21 में विस्तृत रूप में, या, मनका के रेडियल उतार चढ़ाव का उपयोग मीट्रिक टन के अनुरूप न ढंग से, अच्छी तरह से है स्थानीय क्षेत्र ढाल 21 के ज्ञान का उपयोग कर, जाना जाता है.

    • 4. चुंबकीय टोक़ चिमटी का उपयोग डीएनए टोक़ के माप

    1. मैन्युअल एक बेलनाकार चुंबक प्लस MTT के लिए एक पक्ष (स्थायी) चुंबक (चित्रा 1C) द्वारा FOMT के लिए प्रयोग किया जाता है कि बेलनाकार चुंबक जगह. इस आपरेशन के लिए चयनित डीएनए पगहा देखने के क्षेत्र के भीतर रहता है कि इस तरह से किया जाना चाहिए.
      1. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे सरल तरीका मैन्युअल रूप से 1 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है जो अपने उचित स्थान पर ओर चुंबक, जोड़ने के लिए है. आगे कोई फिर से संगठित करना आवश्यक है.
        ध्यान दें: एक ओर चुंबक के लिए एक विकल्प का उपयोग है32 electromagnets.
    2. विश्लेषण के लिए आवश्यक है, तो स्थानीय क्षेत्र ढाल 21 के ज्ञान का उपयोग करते हुए, मनका के एक्स या वाई उतार चढ़ाव का उपयोग, मीट्रिक टन के अनुरूप तरीके से बल जांचना या, मनका के आकर्षण संस्कार प्रदान की अच्छी तरह से जाना जाता है.
    3. विश्वस्त आधारित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल 23 या, साथ वीडियो में दिखाया गया है, (एक्स, वाई) की स्थिति (चर्चा देखने के लिए) की निगरानी के आधार पर कोणीय ट्रैकिंग प्रोटोकॉल का उपयोग कर समय θ (टी) के एक समारोह के रूप में कोणीय उतार चढ़ाव हुए. पूर्व मामले में, बाद में छवि प्रसंस्करण के लिए समय के एक समारोह के रूप में मोती का पूरा रिकॉर्ड छवियों. उत्तरार्द्ध मामले में, यह इस कदम पर मनका के (एक्स, वाई) के उतार चढ़ाव दर्ज करने के लिए पर्याप्त है.
      नोट: मापकला आधारित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल में समय के एक समारोह के रूप में मोती से भरा छवियों से θ (टी) के निर्धारण के लिए एक matlab स्क्रिप्ट है एकअनुरोध पर लेखकों से vailable.
      1. यह मैग्नेट (आमतौर पर 0.1 हर्ट्ज पर) कई मुड़ता द्वारा घुमाया धीरे धीरे कर रहे हैं, जहां एक समय का पता लगाने के रिकॉर्ड को भी सलाह दी जाती है (एक्स, वाई) की स्थिति की निगरानी के आधार पर कोणीय ट्रैकिंग प्रोटोकॉल के लिए, चर्चा में वर्णित है. यह एक सही चर्चा के समीकरण 3-5 का उपयोग ध्रुवीय निर्देशांक (θ आर,) में कार्तीय निर्देशांक (एक्स, वाई) में परिवर्तित करने की अनुमति देगा.
        नोट: (एक्स, वाई) की स्थिति अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है की निगरानी के आधार पर कोणीय ट्रैकिंग स्क्रिप्ट के लिए एक matlab स्क्रिप्ट.
        नोट: माप समय वांछित टोक़ संकल्प पर ज्यादातर निर्भर करता है. एक विस्तृत तर्क Lipfert एट अल 24 में दी गई है. MyOne माला और 30-100 सेकंड के लिए मापने 8 KBP डीएनए tethers, ~ 1 पी.एन. · एनएम के रेंज में एक टोक़ संकल्प देने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
    4. वें से मरोड़ जाल की कठोरता का निर्धारण करेंकोणीय उतार चढ़ाव के ई विचरण का उपयोग (σ रेडियन में, 2 θ):
      कश्मीर θ = कश्मीर बी टी / σ θ 2 (1)
      नोट: MTT में हासिल की विशिष्ट घूर्णी जाल stiffnesses 10-1,000 पी.एन. · एनएम / रेड, पारंपरिक चुंबकीय चिमटी के लिए की तुलना में कम की रेंज में हैं.
    5. इसके अलावा, मनका की स्थिति z-रिकॉर्ड और (देखें भी 2.4-2.7 कदम) पगहा लंबाई एल निर्धारित करने के लिए इस का उपयोग करें.
    6. घुमाएँ एन बदल जाता है और फिर से (टी) और एल (टी) θ रिकॉर्ड.
      नोट: मीट्रिक टन की तुलना में MTT की कम घूर्णी जाल कठोरता एक अणु टोक़ की माप के लिए यह उपयुक्त renders, लेकिन exerted किया जा सकता है कि अधिकतम टोक़ कम है कि निकलता है. इस MTT तेजी से रोटेशन के कारण उच्च खींचें torques counterbalance करने में सक्षम नहीं हो सकता है कि निकलता है. केयर इसलिए अधिकतम गति से अधिक नहीं लिया जाना चाहिए; टीypically 0.1 हर्ट्ज के करीब दरों पर बारी बारी से.
    7. N का उपयोग बदल जाता है के बाद न्यूक्लिक एसिड पगहा में संचित टोक़ का निर्धारण करते हैं:
      Γ = - कश्मीर θ <θ एन - 0 θ> (2)
      कहां <...> औसत और θ 0 और θ एन शून्य बदल जाता है पर कोण (एक torsionally आराम पगहा के लिए इसी रहे हैं, अर्थ, क्रमशः, CF. 2.3 कदम और एन बदल जाता है.
    8. दोहराएँ पूरी तरह से एक ही माप समय में एक अणु का टोक़ प्रतिक्रिया (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 6) निर्धारित करने के लिए 4.5 और आवश्यक के रूप में 4.6 कदम.

    Representative Results

    मीट्रिक टन (चित्रा 1 ए) से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया. चित्रा 2A एफ पर लिया एक 7.9 केबी डीएनए = 0.25, 0.5, और 2.0 पी.एन. के लिए रोटेशन विस्तार से घटता दिखाता है. रोटेशन के लिए एक एकल डीएनए की प्रतिक्रिया सकारात्मक या नकारात्मक plectonemic supercoils के गठन का एक परिणाम के रूप में कम डीएनए के विस्तार के साथ, सबसे कम बल (0.25 पीएन) पर सममित किया जाना चाहिए. शुरू में एक rotationally विवश डीएनए पगहा (2.1 कदम) के लिए खोज जब इस प्रतिक्रिया के गुणात्मक ज्ञान उपयोगी है. तार की अतिरिक्त निरीक्षण यह एक डीएनए अणु होते हैं कि सत्यापित करने के लिए आवश्यक है कि ध्यान दें: यहाँ, 0.5 पी.एन. से अधिक बलों पर रोटेशन के लिए एक एकल डीएनए की असममित प्रतिक्रिया एकाधिक DNAs (कदम 2.1.1) से अलग करने में मदद करता है. यह सत्यापित हो जाने के बाद एक बदल जाता है चुंबक की सही संख्या का निर्धारण करने के क्रम में 0.25 पी.एन. पर घूर्णी प्रतिक्रिया के लिए रिटर्न, जिस पर एक डीएनए मैंएक चित्रा 2 बी सदृश चाहिए जो एक बल विस्तार वक्र लेता है, जहां, torsionally आराम है. इस विशेष माप के लिए, कीड़ा की तरह श्रृंखला मॉडल (ठोस लाइन) के लिए डेटा का एक फिट एक फिट लंबाई समोच्च एल सी = 2.71 माइक्रोन और झुकने हठ लंबाई एल पी = 45 एनएम झुकेंगे. DsDNA के लिए, हठ लंबाई के फिट मूल्यों बफर स्थितियों 33 के आधार पर, सीमा 40-55 एनएम में झूठ चाहिए, और फिट लंबाई समोच्च डीएनए का निर्माण के लिए उम्मीद मूल्य के करीब (आमतौर पर 10% के भीतर) होना चाहिए कि रिश्ता एल डीएनए = 0.34 एनएम / बीपी · आधार जोड़े की संख्या का उपयोग कर, माप में प्रयोग किया जाता है.

    चित्रा 3 FOMT में प्रक्रियाओं और संरेखण के परिणाम (चित्रा 1 बी) से पता चलता है. 3.2 कदम में दर्ज की गई प्रारंभिक (एक्स, वाई) भ्रमण के एक समारोह के रूप में ओ उतार चढ़ाव के समग्र दृष्टिकोण की तुलना में किया जा सकता हैच FOMT में आयोजित चुंबक और डीएनए सीमित मनका के बीच बाद सापेक्ष विस्थापन मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक "भंवर" पैटर्न से पता चलता है जो चित्रा 3 ए, में दिखाया अनुप्रस्थ चुंबक स्थिति. बाद में मोटे संरेखण पूर्ण होने पर भी चित्रा 3 बी में काला ट्रेस करके दिखाया गया है, मनका के (एक्स, वाई) के उतार चढ़ाव, एक परिपत्र प्रक्षेपवक्र बाहर का पता लगा. इस बिंदु पर, Z-अक्ष के बारे में मैग्नेट से टोक़ थर्मल उतार चढ़ाव अपने लगाव बिंदु के आसपास मनका बारी बारी से करने के लिए पर्याप्त है कि बात करने के लिए कम है. परिणामस्वरूप परिपत्र वलय (सज्जित चक्र लाल रंग में दिखाया गया है) की त्रिज्या आर सर्कल डीएनए लगाव बिंदु और मनका के केंद्र (चित्रा 1 बी) के बीच रेडियल दूरी का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, तथापि, चित्रा 3 बी में डेटा की एक हिस्टोग्राम मोटे संरेखण वर्दी कवरेज की गारंटी नहीं है कि पता चलता हैपरिपत्र वलय साथ सब संभव स्थिति की. थर्मल उतार चढ़ाव के चक्र पर सभी घुमाव कोण का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं, भले ही मुक्त रोटेशन के लिए (थर्मल ऊर्जा के बी टी के आदेश के) एक छोटे से ऊर्जा बाधा बनी हुई है.

    महीन संरेखण FOMT (3.4 कदम) में किया जाता है, जब साधन डीएनए की मरोड़ मापांक (चित्रा 4) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सबसे पहले, नमूना के ठीक संरेखण जिसका दो आयामी हिस्टोग्राम अब (चित्रा 4 बी) वर्दी कवरेज दिखाना चाहिए परिपत्र गति (चित्रा -4 ए) प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ((एक्स, वाई) पदों के रूपांतरण से प्राप्त, नीचे देखें) कोणीय उतार चढ़ाव के इसी समय का पता लगाने क्यू (टी) कोई अवधि 360 ˚ (चित्रा 4C) को इसी से पता चलता है और कई पूर्ण बदल जाता है इसी को बड़ी आस (चित्रा का पता चलता है 4D). निहित ऊर्जा परिदृश्य> 1,000 ˚ (चित्रा 4E) की एक सीमा से अधिक हार्मोनिक है. उतार चढ़ाव के मानक विचलन कश्मीर के एक कोणीय जाल कठोरता के लिए इसी σ θ = 223 डिग्री है θ = कश्मीर बी टी / σ θ 2 = 0.27 पी.एन. · बदले में प्रभावी मरोड़ हठ लंबाई के एक अनुमान देता है जो एनएम / रेड, मापा बल पर सी = एल सी / σ θ 2 ~ 76 एनएम (इस माप में प्रयोग किया जाता 3.4 KBP डीएनए के लिए एल सी = 1,150 एनएम) के बराबर डीएनए की.

    FOMT प्रोटीन 31 के बंधन के माध्यम से सीमित डीएनए अणु में प्रेरित मोड़ में परिवर्तन को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण, 34 चित्रा 5 में दिखाया गया है. यहाँ, हम करने के लिए डबल RAD51 प्रोटीन के बंधन से नजर रखी हैअसहाय डीएनए; RAD51 लंबा दोनों के लिए जाना जाता है और यह एक nucleoprotein रेशा 31 रूपों के रूप में डीएनए खोलना है. प्रवाह सेल में RAD51 निस्तब्धता पर, हम मनका FOMT (चित्रा 5A) में एक बढ़ती प्रक्षेपवक्र कि आए निरीक्षण करते हैं. जैसा कि ऊपर वर्णित क्यू (टी) के लिए समय के एक समारोह के रूप में (एक्स, वाई) गति का पता लगाने में परिवर्तित करके, हम RAD51 डीएनए तार लंबाई और unwinding के अपने डिग्री पर प्रभाव है कि साजिश सह सकते हैं (चित्रा 5 ब, स) .

    डीएनए की मरोड़ गुणों को मापने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण MTT (चित्रा 1C, चित्रा 6) हैं. चित्रा 6A में योजनाबद्ध माप के सिद्धांत को दिखाता है: overwinding के बाद (या underwinding) एन द्वारा डीएनए तार बदल जाता है, डीएनए θ एन 0 θ से संतुलन कोणीय स्थिति में एक बदलाव की ओर जाता है कि मनका पर एक बहाल टोक़ डालती. MTT में चुंबकीय क्षेत्र की अनुप्रस्थ घटक अभी भी मनका रोटेशन (चित्रा 1) की अनुमति है, जबकि इस तरह के कोणीय पारियों की माप की सुविधा है, जो लाख टन की तुलना में कम है. एन 45 = लगाने के बाद मापा कोणीय पारी की भयावहता एक 7.9 KBP डीएनए में बदल जाता है चित्रा 6B में दिखाया गया है. MTT माप प्रोटोकॉल और डीएनए के लिए रोटेशन वक्र बनाम एक टोक़ के परिणामस्वरूप परिणाम की पूरी अनुक्रम चित्रा 6C एफ में दिखाया गया. यहाँ, समन्वय कोणीय का मानक विचलन (चित्रा 6C) और मतलब (चित्रा 6D) की माप मानक विचलन कोणीय जाल कठोरता (1 समीकरण) के विपरीत आनुपातिक होने के साथ खत्म हो गया और underwinding के एक समारोह के रूप में दिखाया गया है. साथ में ले ली, इन मात्रा केंद्रित एक एक रेखीय प्रतिक्रिया क्षेत्र दिखाना चाहिए जो डीएनए के लिए रोटेशन की अवस्था (चित्रा 6F), बनाम एक टोक़ के निर्माण के लिए अनुमति देने के बारे में 0 एक मुड़ताND दो पठारों जिस पर सकारात्मक और नकारात्मक घुमाव पर टोक़ संतृप्त,, क्रमशः. रोटेशन वक्र बनाम इस तरह के एक टोक़ जिससे डीएनए की buckling और विकृतीकरण के साथ कि बदलाव बढ़ाता, रोटेशन वक्र (चित्रा 6E) बनाम एक विस्तार में जानकारी पूरक.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. पारंपरिक चुंबकीय चिमटी की schematics (एमटी), आज़ादी की परिक्रमा चुंबकीय चिमटी (FOMT), चुंबकीय टोक़ चिमटी (MTT), और रोटेशन कोण पर नज़र रखने के लिए दो रणनीतियों. (एक) चुंबकीय चिमटी के सभी तीन कार्यान्वयन में, चुंबकीय मोतियों क्रियाशील अणुओं से एक प्रवाह कोशिका की सतह को सीमित कर रहे हैं, जैसे, डबल असहाय डीएनए अणु रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है. संदर्भ मोती प्रवाह कोशिका की सतह से जुड़ी है और drif के लिए ट्रैक किए गए हैंटी सुधार. सभी तीन लाख टन सेट अप, इसलिए, डीएनए तार चुंबकीय मनका पर एक ऊपर की ओर खींच बल लागू करने के लिए मैग्नेट रोजगार और. पारंपरिक माउंट में, मैग्नेट की एक जोड़ी कसकर डीएनए पगहा धुरी के चारों ओर मनका के रोटेशन में बाधा, transversely पगहा अक्ष के सापेक्ष उन्मुख है कि एक चुंबकीय क्षेत्र डाल रही है. FOMT में, एक cylindrically के आकार का चुंबक पगहा दिशा साथ उन्मुख है कि एक चुंबकीय क्षेत्र प्रदान करता है. पगहा cylindrically के आकार का चुंबक के केंद्र के लिए गठबंधन किया है, जब किसी भी शेष अनुप्रस्थ क्षेत्रों MTT में पगहा अक्ष के बारे में नि: शुल्क रोटेशन की अनुमति, कम कर रहे हैं, एक ओर चुंबक प्रदान करने के क्रम में FOMT में इस्तेमाल cylindrically के आकार का चुंबक में जोड़ा जाता है (मीट्रिक टन की तुलना में परिमाण में कम) एक छोटे अनुप्रस्थ क्षेत्र. इस छोटे से अनुप्रस्थ क्षेत्र टोक़ के आवेदन के साथ ही इसकी माप सक्षम बनाता है. (ख) डीएनए पगहा अक्ष के बारे में एक चुंबकीय मनका के रोटेशन कोण को मापने के लिए दो रणनीतियों दिखाए जाते हैं. 1): एक मार्कर मनका (Greeएन) चुंबकीय मनका (ब्राउन) से जुड़ी द्वारा विश्लेषण कल्पना ट्रैकिंग कोण में सक्षम बनाता है कि एक असममित छवि देती है. एक 0.5 माइक्रोन त्रिज्या मापकला मार्कर के साथ एक 1.4 माइक्रोन त्रिज्या चुंबकीय मनका के दो सीसीडी छवियों को ध्यान में और बाहर का ध्यान केंद्रित, दिखाए जाते हैं. 2): डीएनए दूर मनका के दक्षिणी ध्रुव से एक स्थान पर चुंबकीय मनका के लिए सीमित है, जब मनका के केंद्र जिसका केन्द्र एक कोणीय स्थिति को परिभाषित करता है एक चाप साथ उतार चढ़ाव होता रहता. पगहा torsionally इस प्रकार एक अणु टोक़ की माप सक्षम, (सही पर निशान) तनावपूर्ण है के रूप में या तो रणनीति रोटेशन कोण को ट्रैक करने के लिए और कोण की स्थिति में बदलाव पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    चित्रा 2
    पारंपरिक मीट्रिक टन में चित्रा 2. डीएनए अंशांकन माप. एफ = 0 पर लिया एक 7.9 केबी डीएनए के लिए (एक) रोटेशन विस्तार से घटता.25, 0.5, और 2.0 पी.एन.. सिंगल, डबल असहाय डीएनए tethers के सकारात्मक और नकारात्मक बदल जाता है को रोटेशन के तहत असममित प्रतिक्रिया पगहा लगाव का एक सुविधाजनक परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक साथ करने के लिए एक फिट के साथ एक 7.9 केबी डीएनए के लिए (ख) सेना के विस्तार की अवस्था, कीड़ा एक फिट लंबाई समोच्च एल सी उपज श्रृंखला मॉडल (ठोस लाइन), जैसे = 2.71 माइक्रोन और झुकने हठ लंबाई एल पी = 45 एनएम. सभी माप पीबीएस बफर में प्रदर्शन किया गया.

    चित्रा 3
    FOMT में चित्रा 3. संरेखण. (क) (एक्स, वाई) चुंबक स्थिति के एक समारोह के रूप में FOMT में आयोजित डीएनए सीमित मनका के उतार चढ़ाव. बेलनाकार चुंबक की स्थिति एक्स में 250 माइक्रोन के चरणों में प्रवाह सेल सतह भर में 3 मिमी की एक निरंतर ऊंचाई पर स्कैन किया गया था और (एक्स, वाई) चुंबक स्थिति एक चक्रवात या भंवर दिखने के साथ उतार - चढ़ाव पैटर्न के व्यवस्थित विविधताओं स्पष्ट कर रहे हैं. यह "भंवर" पैटर्न संरेखण को प्राप्त करने के लिए एक्स और वाई (बड़े तीर द्वारा संकेत) में (फिक्स्ड चुंबक रखते हुए या वैकल्पिक रूप से तार है) चुंबक का विस्थापन मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मोटे संरेखण पूर्ण होने पर, मनका के (एक्स, वाई) के उतार चढ़ाव एक परिपत्र प्रक्षेपवक्र (साजिश के केंद्र में नीला ट्रेस) बाहर का पता लगा. यह पता लगाने के केंद्र के बारे में छोटे कदमों में मैग्नेट aligning और इस साजिश में दृष्टांत के रूप में दिखाया गया है के बाद एक अलग प्रयोग में दर्ज की गई थी. टी में आयोजित एक डीएनए सीमित मनका (ख) (एक्स, वाई) के उतार चढ़ाववह चुंबक (काला ट्रेस) का सफल मोटे संरेखण के बाद FOMT. उतार चढ़ाव एक परिपत्र वलय पर झूठ और थर्मल उतार चढ़ाव के चक्र पर कोण सभी घुमाव का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं. एक फिट चक्र लाल रंग में दिखाया गया है. (ग) एक हिस्टोग्राम मोटे संरेखण परिपत्र वलय साथ सब संभव स्थिति की वर्दी कवरेज की गारंटी नहीं है कि दिखा, (ख) में डेटा के लिए इसी. थर्मल उतार चढ़ाव के चक्र पर सभी घुमाव कोण का पता लगाने के लिए पर्याप्त हैं, भले ही मुक्त रोटेशन के लिए (थर्मल ऊर्जा के बी टी के आदेश के पर) एक ऊर्जा बाधा बनी हुई है.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. FOMT का उपयोग डीएनए मरोड़ कठोरता का मापन. (एक्स, वाई) प्रक्षेपवक्र (एक) और हिस्टोग्राम (बी) के एक डीएनए TethFOMT में रिश्तेदार चुंबक पगहा स्थिति के ठीक संरेखण के बाद मनका के उतार चढ़ाव जुटी. इन परिस्थितियों में, हिस्टोग्राम वृत्त पर पदों की अनिवार्य रूप से वर्दी कवरेज से पता चलता है. (एक्स, वाई) के पदों पर. (डी) घूर्णी उतार चढ़ाव के हिस्टोग्राम से निर्धारित मनका (ग) घूर्णी उतार चढ़ाव. लाल रेखा σ θ = 223 डिग्री के साथ एक गाऊसी फिट है. (ई) घूर्णी उतार - चढ़ाव (ग) से घनत्व और (घ) द्वारा निहित ऊर्जा परिदृश्य. घूर्णी उतार चढ़ाव से गर्भित ऊर्जा परिदृश्य और कश्मीर (θ = कश्मीर बी टी / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad साथ) एक हार्मोनिक सन्निकटन के बीच का अंतर कई मुड़ता अधिक तापीय ऊर्जा के बी टी तुलना में काफी छोटा है. डाटा ऐसी स्पष्टता के लिए भरपाई कर रहे हैं कि 0 = 0 θ. चौड़ाई कीउतार चढ़ाव, डीएनए की मरोड़ कठोरता निर्धारित मुख्य पाठ को देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. माप ~ 1 पी.एन. की एक खींच बल पर पीबीएस बफर में बाहर किया गया था. डाटा Lipfert एट अल 21 से अनुकूलित कर रहे हैं.

    चित्रा 5
    चित्रा 5. डीएनए को RAD51 प्रोटीन के बंधन FOMT का उपयोग करके मापा. (एक) एक सीमित 7.9 KBP dsDNA पर RAD51 प्रोटीन की विधानसभा 3.5 पी.एन. पर नजर रखी. (एक्स, वाई, जेड) विधानसभा के पहले 200 सेकंड दौरान चुंबकीय मनका (व्यास 1.0 मिमी) द्वारा निष्पादित-प्रक्षेपवक्र समय लाल को नीले रंग से रंग कोडित के साथ दिखाया गया है. (ख) dsDNA का विस्तार deduced deduced dsDNA पगहा अक्ष के बारे में (एक) समय के एक समारोह के रूप में. (ग) घूर्णी कोण में मनका प्रक्षेपवक्र के z-घटक सेएक्स से, समय के एक समारोह के रूप में (एक) में मनका प्रक्षेपवक्र के वाई घटकों.

    चित्रा 6
    MTT में एक डीएनए पगहा पर चित्रा 6. टोक़ माप. (एक) योजनाबद्ध टोक़ माप के सिद्धांत दिखा. (अंडर पर या) एन द्वारा डीएनए तार बदल जाता समापन के बाद, डीएनए θ एन 0 θ से संतुलन कोणीय स्थिति में एक बदलाव की ओर जाता है कि मनका पर एक बहाल टोक़ डाल रही है. इस्तेमाल किया कोण निशान (ख) उदाहरण टोक़ को मापने के लिए:. एक सेंट में आयोजित पीबीएस बफर में एक 7.9 KBP डीएनए अणु पर (नीला) से पहले और 40 बदल जाता है (गहरे लाल) शुरू करने के बाद एक torsionally आराम से 7.9 KBP डीएनए अणु के लिए सीमित एक मनका के कोणीय उतार चढ़ाव (CF) टोक़ मापविश्वस्त मार्कर मनका आधारित कोणीय ट्रैकिंग प्रोटोकॉल का उपयोग ~ 3 पी.एन. के बल retching. कोणीय उतार चढ़ाव (बी) लागू किया जाता है की संख्या के एक समारोह के रूप में दर्ज किया गया. (ग) कोणीय उतार चढ़ाव का मानक विचलन लागू मुड़ता के एक समारोह के रूप में दिखाया गया है. उतार चढ़ाव की चौड़ाई लगातार कोणीय जाल कठोरता का संकेत है, लगभग स्थिर है. (डी) लागू किया जाता है की एक समारोह के रूप में मतलब रोटेशन कोण में बदलाव. अधिक और underwinding पर मतलब कोण के व्यवस्थित बदलाव के स्पष्ट कर रहे हैं. (ई) लागू किया जाता है की एक समारोह के रूप में एक साथ नजर रखी डीएनए पगहा विस्तार. (एफ) (डी) में दिखाया मतलब कोण से निर्धारित डीएनए पगहा द्वारा लगाए टोक़ , मुख्य पाठ देखें. अधिक और शून्य चारों ओर मुड़ता है underwinding एक रेखीय टोक़ बनाम को जन्म देता है (~ 7 प्रभावी मरोड़ हठ लंबाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि डीएनए पगहा (सज्जित ग्रे ढलानों आयन (घ) और (च)) की प्रतिक्रिया में बदल जाता हैइस डेटा सेट के लिए 7 एनएम). इसके अलावा buckling और (रेखाचित्र insets में दिखाया गया है) plectonemic supercoils के गठन, (~ 26 पी.एन. · एनएम (च) में सकारात्मक बदल जाता है पर काला लाइन) एक टोक़ पठार और संख्या के साथ पगहा विस्तार की एक रेखीय कमी को इसी की ओर जाता है overwinding घुमावों की (ई) (में काला ढलान). रेखीय शासन परे unwinding ((एफ) में ~ -11 पी.एन. · एनएम में नकारात्मक बदल जाता है पर काला लाइन) पिघलने टोक़ के बराबर टोक़ पठार द्वारा चिह्नित, (बाईं ओर insets में दिखाया गया है) स्थानीय स्तर पर पिघला करने के लिए डीएनए का कारण बनता है.

    Discussion

    MTT या FOMT का उपयोग कर प्रयोगों चल रहा है, विकल्पों की एक संख्या आदि की माला, मैग्नेट, ट्रैकिंग प्रोटोकॉल, किए जाने के लिए सबसे अच्छा विकल्प ब्याज के प्रयोग पर निर्भर करेगा के बारे में किए जाने की जरूरत है. नीचे, हम एक विशेष रूप से प्रयोग के लिए चयन की सुविधा चाहिए, जो विभिन्न विकल्पों के साथ कि व्यापार नापसंद का वर्णन. अगला, हम MTT और FOMT प्रयोगों के संरेखण और चल रहा है के साथ आने वाली कई महत्वपूर्ण कदम का वर्णन. अन्त में, हम मौजूदा तरीकों के संबंध के साथ ही भविष्य के अनुप्रयोगों के साथ MTT और FOMT के महत्व पर चर्चा की.

    पिछले MTT और FOMT प्रयोगों के शुरू करने के विचार

    किसी भी प्रयोग के उपयोग के लिए चुंबकीय मनका का एक प्रकार का चयन करने के लिए एक आवश्यकता है. एक कई वाणिज्यिक उपलब्ध streptavidin लेपित superparamagnetic मोती, उदाहरण के लिए, 0.25 मीटर त्रिज्या मोती, 0.5 माइक्रोन त्रिज्या मोती, या 1.4 माइक्रोन त्रिज्या मोती (ओं के बीच चयन कर सकते हैं) सामग्री तालिका ee. बड़ा मोती (लगभग मात्रा के रूप में स्केलिंग) छोटे मोतियों की तुलना में वृद्धि हुई चुंबकीय क्षण होगा और इसलिए उनके उपयोग उच्च बलों के आवेदन की सुविधा होगी (हमारे उपकरणों में हासिल की विशिष्ट बलों के लिए, 1 टेबल देखें). मार्कर मोती का उपयोग कोणीय ट्रैकिंग वांछित है, जब हम आम तौर पर 1.4 मीटर त्रिज्या के साथ काम करते हैं और (इसी लगाव प्रोटोकॉल के लिए पैरा 1.9 देखें) मार्कर मोती के रूप में 0.5 माइक्रोन त्रिज्या गैर चुंबकीय biotinylated मोती का उपयोग करें. छोटे मोतियों का उपयोग विशेष रूप से मनका रोटेशन τ के लिए विशेषता timescale के रूप में सी अपने वसंत निरंतर γ / कश्मीर θ से अधिक प्रणाली के खींचें के अनुपात के बराबर होती है, FOMT के लिए सिफारिश की है; महत्वपूर्ण बात, ~ आर मनका 3, यानी त्रिज्या की तीसरी शक्ति के रूप में साथ कोणीय माप समय के पैमाने तराजू के लिए प्रासंगिक घूर्णी खींचें गुणांक (के लिए 2 टेबल देखेंलक्षण समय कई FOMT में मनका डीएनए संयोजन और MTT माप) के लिए तराजू. लागू किया जा सकता है कि अधिक से अधिक बल में उनके साथ कटौती बेलनाकार चुंबकों 27 के एक से फ़्लिप ढेर का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है. बहरहाल, FOMT माप में यह कभी कभी सबसे अच्छा प्राप्त अस्थायी समाधान और अधिकतम लागू बल के बीच समझौता करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

    इसके अतिरिक्त, एक प्रयोग एक चुंबक विन्यास का चयन की आवश्यकता है. पारंपरिक चुंबकीय चिमटी विन्यास (चित्रा 1 ए) में, हम आम तौर पर मैग्नेट 4 के बीच एक 0.5 या 1 मिमी के अंतराल के साथ खड़ी अभिविन्यास में 5x5x5 मिमी घन मैग्नेट की एक जोड़ी का उपयोग करें. मैग्नेट एक्स (y) अक्ष के साथ स्थान दिया गया है जब, यह मुख्य रूप से एक्स (y) अक्ष के साथ निर्देश दिया है कि एक चुंबकीय क्षेत्र पैदावार. FOMT प्रयोगों के लिए, एक cylindrically के आकार का चुंबक जिसका केंद्र चुंबकीय क्षेत्र में मुख्य रूप से निर्देशित है पर चयन किया गया हैZ अक्ष (चित्रा 1 बी). अभ्यास में, हम 6 मिमी की कुल मोटाई के लिए तीन तरह के cylindrically मैग्नेट के आकार, 6 मिमी की एक व्यास और एक 2 मिमी व्यास केंद्रीय छेद के साथ प्रत्येक के एक ढेर का उपयोग करें. उच्च खींच बलों वांछित रहे हैं, नीचे चुंबक विपरीत आकर्षण संस्कार के साथ खड़ी है, जिसमें एक "से फ़्लिप ढेर" चुंबक विन्यास पसंद किया जाता है. MTT विन्यास (चित्रा 1C) को प्राप्त करने के लिए, हम FOMT विन्यास, 4 मिमी व्यास और 7 मिमी की ऊंचाई के साथ आम तौर पर एक ठोस सिलेंडर के मुख्य चुंबक ढेर की ओर करने के लिए एक अतिरिक्त चुंबक जोड़ें. , हमारे उपकरणों में हासिल की अधिक से अधिक बलों चुंबक विन्यास पर निर्भर देखने के लिए कैसे 1 टेबल देखने के लिए.

    MTT और FOMT प्रयोगों के संरेखण

    चुंबकीय मोतियों एक (लगभग) समान रूप से सतह functionalized है के बाद से (आमतौर पर streptavidin) और क्रियाशील n दोनों की कुर्की के बादucleic एसिड tethers और मार्कर मोती (मामले में मार्कर मनका आधारित कोणीय ट्रैकिंग कार्यरत है) पगहा और / या मार्कर मनका चुंबकीय मनका के लिए देते हैं, जहां समाधान में सरल ऊष्मायन के माध्यम से, एक नियंत्रण नहीं करता तब होती है. चुंबकीय मोती बाहरी क्षेत्र की दिशा के साथ संरेखित करने के लिए जाता है कि एक वरीय आकर्षण संस्कार धुरी है. हम वरीय आकर्षण संस्कार अक्ष उत्तरी और दक्षिणी ध्रुवों के रूप में मोती की सतह intersects अंक जहां निरूपित, तो डीएनए पगहा करीब भूमध्य रेखा से जुड़ा हुआ है, जहां मोती बंद करने के लिए या थोड़ा की तुलना में बड़ा एक त्रिज्या के साथ एक परिपत्र वलय बाहर ट्रेस करेगा FOMT में मनका त्रिज्या; इसके विपरीत, दक्षिण ध्रुव के करीब से जुड़े रहे हैं मोती समीकरण 3-5 का उपयोग चक्र की फिटिंग रोकना कर सकते हैं, जो FOMT में बहुत छोटे त्रिज्या के साथ एक परिपत्र वलय पर उतार चढ़ाव हो जाएगा. हम साधारण गोलाकार ज्यामिति द्वारा भूमध्य रेखा के पास संलग्न की संभावना बिल्कुल खंभे पर एक लगाव से ज्यादा बड़ा है कि ध्यान दें; इसलिए, सबसे बीईएडीएस सीमित किया जाएगा (एक्स, वाई) आधारित कोणीय ट्रैकिंग सफलतापूर्वक बाहर किया जा सकता है कि इस तरह के.

    इसी प्रकार का एक तर्क मापकला मार्कर आधारित कोणीय नज़र रखने के लिए मार्कर मोतियों की कुर्की के लिए रखती है. मार्कर मनका कोण पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है कि चुंबकीय मनका की छवि में एक विषमता पैदा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मार्कर मनका मनका (यानी सीधे ऊपर या नीचे पर) के उत्तर या दक्षिण ध्रुव पर बिल्कुल जुड़ा हुआ है, तो जिसके परिणामस्वरूप छवि अभी भी rotationally सममित है और कोणीय ट्रैकिंग प्रोटोकॉल में विफल रहता है. हालांकि, एक ही गोलाकार ज्यामिति तर्क से, एक मार्कर मनका डंडे से एक में सीधे संलग्न करने के लिए मौका अपेक्षाकृत छोटा है; हम अभ्यास में सबसे मार्कर मोती कोणीय ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए एक पर्याप्त विषमता दे पाते हैं. अंत में, हम पारंपरिक चुंबकीय चिमटी में क्षेत्र दिशा (एक्स, वाई) विमान में है कि ध्यान दें; इसलिए, मनका के पसंदीदा आकर्षण संस्कार अक्ष वीं में पंक्ति में होगाई (एक्स, वाई) विमान और उत्तर और दक्षिण डंडे, ऊपर के रूप में परिभाषित, मनका के पक्ष में होने की संभावना नहीं के खंभे के ऊपर और नीचे में हैं जहां FOMT या MTT, में स्थिति. जा रहे हैं

    FOMT प्रयोगों में, एक महत्वपूर्ण कदम रेडियल चुंबकीय क्षेत्र मनका से निकटता में नगण्य है कि इस तरह बेलनाकार चुंबक के संरेखण है. इस संरेखण एक समय में एक ही मनका के लिए किया जाता है. FOMT में मनका गति समान रूप से एक परिपत्र वलय पर वितरित किया जाता है कि क्या न्यायाधीश, माप समय 20 · τ सी से अधिक होना चाहिए. Τ सी 8 KBP डीएनए और एक 0.5 मिमी त्रिज्या मनका के लिए ~ 45 सेकंड के बराबर होती है, माप समय संरेखण के अंतिम चरण में ~ 900 सेकंड है. 1.9 KBP डीएनए की तुलना, उपयोग और 0.25 मिमी त्रिज्या मोती के लिए τ सी बीस गुना तक ~ 2 सेकंड (भी 2 टेबल देखें) कम कर देता है.

    एफ के दौरान ट्रैकिंग के लिए गंभीर कदम और विचारOMT और MTT प्रयोगों

    मनका के विमान में उतार चढ़ाव को ट्रैक करने के लिए अपने (एक्स, वाई) की स्थिति यानी, हम बाद के समय के अंतराल में 35, 36 पर एक मनका द्वारा प्रदर्शित तीव्रता प्रोफाइल के एक पार सहसंबंध विश्लेषण को रोजगार. यह कुछ नैनोमीटर 20 की शुद्धता के लिए उप पिक्सेल संकल्प पर बाहर किया जा सकता है. Z में मनका के प्रस्ताव को ट्रैक करने के लिए, हम आम तौर पर न्यूक्लिक एसिड 20 से जुड़ी मनका के विवर्तन के छल्ले इमेजिंग जबकि उद्देश्य के फोकल प्लेन (OFP) सही ऊर्ध्वाधर दिशा में स्थानांतरित कर दिया है, जिसमें प्रथम, Gosse और Croquette द्वारा बनाया गया एक विधि का उपयोग करें . इस तरीके में, एक अंशांकन प्रोफाइल मनका और OFP 19 के बीच की दूरी को मनका के विवर्तन पैटर्न correlating उत्पन्न होता है. इस अंशांकन प्रोफाइल interpolated जाता है, मनका के ऊर्ध्वाधर विस्थापन भी कुछ एनएम 20 तक की शुद्धता के साथ मापा जा सकता है.हम और अधिक परिष्कृत ट्रैकिंग एल्गोरिदम 37, 38 के साथ ही कई मोती 5, 6, 37 की ट्रैकिंग समानांतर उनके आवेदन का वर्णन है कि अतिरिक्त संदर्भ पाठक देखें.

    कोणीय निर्देशांक में (एक्स, वाई) पदों के रूपांतरण पर निर्भर करता है कि कोणीय ट्रैकिंग का उपयोग करते हैं, हम के रूप में आगे बढ़ने के लिए सलाह. मनका उपयोग, एक परिपत्र वलय बाहर निशान, जिसमें एक समय का पता लगाने से (एक्स मैं, वाई मैं) के पदों (जहां मैं बाद में माप अंक अर्थ इंडेक्स) वृत्त केंद्र (एक्स 0, y 0) और त्रिज्या आर सर्कल फिट करने के लिए कम करके (चित्रा 2A):

    (3)

    योग सभी डेटा बिंदुओं पर चलाता है. Fitti के बादएनजी एक्स 0, y 0, और आर सर्कल, का उपयोग कर समय का पता लगाने में प्रत्येक डेटा बिंदु के ध्रुवीय निर्देशांक (नि. मैं, θ मैं) का निर्धारण:

    (4)

    (5)

    एक चरण ± की छलांग π जहां उपयुक्त जोड़ने के लिए, यानी कोण θ "खोलना" को ध्यान रखना चाहिए कि नोट. (नि., θ) निर्देशांक (एक्स, वाई) से ढाले और रूपांतरण के लिए कस्टम लिखा कोड अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है. FOMT में, मनका एक परिपत्र वलय बाहर निशान का पता लगाने में जो एक समय मोटे संरेखण (cf. कदम 3.3) को प्राप्त करने और मनका के थर्मल उतार चढ़ाव की रिकॉर्डिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. MTT, थर्मल fluctu मेंations परिपत्र वलय को ट्रेस करने के लिए अपर्याप्त हैं; इसके बजाय, समीकरण 3-5 का उपयोग वृत्त फिट करने के लिए कई मुड़ता द्वारा घुमाया मैग्नेट (आमतौर पर 0.1 हर्ट्ज पर) धीरे धीरे कर रहे हैं, जहां एक समय का पता लगाने का उपयोग करें.

    हम (MTT के लिए, यह एक कोणीय ट्रैकिंग मार्कर (चित्रा 1C, चित्रा -1, चित्रा 3 ए) के माध्यम से या कोणीय निर्देशांक में (एक्स, वाई) पदों के रूपांतरण के माध्यम से यानी उचित कोणीय ट्रैकिंग दृष्टिकोण, का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ध्यान दें चित्रा -1, चित्रा 2 बी). आम तौर पर (एक्स, वाई) की दशा और मार्कर मोतियों के उपयोग से कोणीय ट्रैकिंग के accuracies तुलना कर रहे हैं, यह रूप में वर्णित है कि crosstalk, (एक्स, वाई) में और कोण में एक मनका के उतार चढ़ाव के बीच होता है एहसास करने के लिए महत्वपूर्ण है जैनसेन एट अल 32: इस प्रकार, (एक्स, वाई) के पदों से कोणीय ट्रैकिंग प्रदान की ही मान्य है (एक्स में ब्राउनियन उतार चढ़ाव, वाई) समन्वय कोणीय में अनिश्चितता, और (एक्स, वाई) ट्रैकिंग ओर चुंबक की स्थिति के समायोजन के माध्यम से घूर्णी जाल कठोरता की ट्यूनिंग की आवश्यकता हो सकती इसके समुचित उपयोग करने के लिए केवल negligibly योगदान करते हैं. आमतौर पर, उच्च जाल कठोरता का उपयोग मार्कर मोती का उपयोग कोणीय ट्रैकिंग का उपयोग आवश्यक है. मार्कर मोती का उपयोग (कदम 1.9 में अनुलग्नक प्रोटोकॉल देखें) प्रयोग करने योग्य tethers की संख्या कम कर सकते हैं जो एक अतिरिक्त लगाव कदम की आवश्यकता है. मार्कर मनका आधारित ट्रैकिंग का उपयोग करते हैं, यह एक मार्कर मनका अच्छे परिणाम के लिए भूमध्य रेखा के पास जुड़ा हुआ है है जो चुंबकीय मोतियों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

    FOMT और MTT का महत्व मौजूदा तरीकों और अनुप्रयोगों की तुलना में दृष्टिकोण

    ऊपर में, हम आसानी से MTT या FOMT में साधन कन्वर्ट करने के लिए चुंबक विन्यास को संशोधित, एक, पारंपरिक मीट्रिक टन से शुरू कर सकते हैं कैसे पता चला है. यह सीधा एमodification, एक कोणीय ट्रैकिंग मार्कर का उपयोग वांछित है जब कोणीय ट्रैकिंग की शुरूआत के साथ हो सकता है, जो इस पर निर्भर करता है, टोक़ लागू टोक़ उपाय, या मोड़ मापने के लिए उपयोगकर्ता परमिट के रूप में, दोनों विन्यास का एक तत्काल मजबूत बिंदु है हाथ में प्रयोग. परिचय में उल्लेख किया है, FOMT और भी समानांतर माप 5, की क्षमता से लाभ विशेष रूप से MTT के साथ, विशेष रूप से उनकी सादगी, मीट्रिक टन की मौजूदा ताकत के कई से MTT लाभ दोनों 6 (इन दी रूप में आसानी से FOMT में हासिल नहीं कर रहे हैं बेलनाकार चुंबक के केंद्र के लिए सम्मान के साथ पगहा के संरेखण की आवश्यकता). विशेष रूप से, MTT और FOMT अन्य तकनीकों, विशेष रूप से नैनो गढ़े कणों 22, 39, 40, जटिल ऑप्टिकल डिजाइन 41, या सीमित भीतर अतिरिक्त मोतियों की शुरूआत (डीएनए) अणु 42 के साथ इसके विपरीत, की आवश्यकता नहीं है. ओवहाँ तकनीक है फिर भी इस तरह के उच्च अस्थायी समाधान 27, 43, 44 के रूप में अन्य लाभ प्रदान कर सकता है. डीएनए पर आणविक मोटर्स के व्यवहार दोनों से प्रभावित है और स्थानीय मोड़ और टोक़ के लिए परिणाम है के रूप में FOMT और MTT दोनों जीनोम प्रसंस्करण के अध्ययन में भविष्य अनुप्रयोगों का पता लगाना चाहिए. अतिरिक्त अनुप्रयोगों डीएनए नैनो 27 के उभरते हुए क्षेत्र में या जैविक प्रसंस्करण 7, 45 में सक्रिय रोटरी मोटर्स के व्यापक क्षेत्र में पाया जा सकता है.

    M270 (नि. मनका = 1.4 माइक्रोन) MyOne (नि. मनका = 0.5 माइक्रोन) Ademtech (नि. मनका = 0.25 माइक्रोन)
    परम्परागत मीट्रिक टन (घन 5 एक्स 5 एक्स 5 मिमी 3 मैग्नेट की जोड़ी, 1 मिमी खाई, ऊर्ध्वाधर संरेखण) 70 पी.एन. 8 पी.एन. 1.6 पी.एन.
    FOMT या MTT * (तीन बेलनाकार चुंबकों के ढेर, 6 मिमी व्यास, 2 मिमी व्यास जीएपी) 9 पी.एन. 1 पी.एन. 0.2 पी.एन.
    FOMT या MTT * (तीन बेलनाकार चुंबकों के ढेर, 6 मिमी व्यास, 1 मिमी व्यास जीएपी) 18 पी.एन. 2 पी.एन. 0.4 पी.एन.
    FOMT या MTT * (पिछले एक साथ तीन बेलनाकार चुंबकों के ढेर से फ़्लिप, 1 मिमी व्यास जीएपी) ~ 50 पी.एन. 9 पी.एन. 1.8 पी.एन.

    * MTT में छोटे पक्ष चुंबक की उपस्थिति खींच बल पर एक नगण्य प्रभाव पड़ता है

    तालिका 1. अधिकतम बलों आम तौर पर विभिन्न चुंबक विन्यास और मनका प्रकार के लिए हासिल की.

    आर मनका = 1.4 माइक्रोन आर मनका = 0.5 माइक्रोन आर मनका =0.25 माइक्रोन
    घर्षण गुणांक * 120 पी.एन. · एनएम · सेकंड 5.5 पी.एन. · एनएम · सेकंड 0.7 पी.एन. · एनएम · सेकंड
    लक्षण समय के पैमाने: FOMT, 10 KBP डीएनए ** 1200 सेकंड 55 सेकंड 7 सेकंड
    लक्षण समय के पैमाने: FOMT, 1 KBP डीएनए 120 सेकंड 5.5 सेकंड 0.7 सेकंड
    लक्षण समय के पैमाने: MTT, कश्मीर क्ष = 100 पी.एन. · एनएम / रेड 1.2 सेकंड 0.06 सेकंड 0.007 सेकंड
    लक्षण समय के पैमाने: MTT, कश्मीर क्ष = 1000 पी.एन. · एनएम / रेड 0.12 सेकंड 0.006 सेकंड = 6 मिसे 0.0007 एस = 0.7 मिसे

    * "भूमध्य रेखा" के माध्यम से एक धुरी के बारे में रोटेशन के लिए घर्षण गुणांक (चित्रा 1 बी में दिखाया स्थिति यानी), 14 द्वारा दिए · पी · घंटे · घंटे बफर का चिपचिपापन है जहां आर मनका 3,.
    ** FOMT में, घूर्णी जाल कठोरता डीएनए की मरोड़ कठोरता, कश्मीर क्ष द्वारा दिया जाता है, डीएनए = सी · सी प्रभावी मरोड़ हठ लंबाई है जहां कश्मीर बी टी एल / सी,, (यहां 80 एनएम मान लिया एक मध्यवर्ती बल शासन, एफ ~ 1 पीएन) और एल सी की विशेषता है जो डीएनए, आधार जोड़ी प्रति 0.34 एनएम की लंबाई समोच्च है.

    तालिका 2. घर्षण गुणांक और विशेषता समय FOMT और MTT के लिए तराजू.

    Disclosures

    इस काम के लिए संबंधित पेटेंट संदर्भ PCT/NL2011/050446 के तहत दायर किया गया है.

    Acknowledgments

    इस काम के टीयू डेल्फ्ट, वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO), इस मामले पर फंडामेंटल रिसर्च फाउंडेशन के लिए, और यूरोपीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

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    References

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    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

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