प्रासंगिक सिद्धांतों के सर्वेक्षण और fluorophores और एंटीबॉडी लक्षित स्थितियों की एक भीड़ के साथ अपनी संगतता का प्रदर्शन करके luminescence (ईंधन) से अनबाउंड उत्तेजना से प्रतिदीप्ति की नींव और प्रयोज्यता विस्तार.
Luminescence (ईंधन) से अनबाउंड उत्तेजना प्रतिदीप्ति इन विट्रो और इन विवो में वृद्धि के संकेत और विपरीत वृद्धि का उत्पादन एक विकिरणवाला उत्तेजना उत्सर्जन प्रक्रिया है. Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट), अभी तक के रूप में ही अंतर्निहित सिद्धांतों के कई ईंधन के शेयरों में काफी luminescent स्रोत और फ्लोरोसेंट इकाई के बीच स्वीकार्य काम दूरी में अलग है. ब्रेट प्रभावी रूप से 2 बार फोरस्टर त्रिज्या, आमतौर पर कम से कम 14 एनएम का अधिकतम करने के लिए सीमित है, ईंधन एक ऑप्टिकल अवशोषक के अभाव में माइक्रोन की दूरी पर या यहाँ तक कि सेमी हो सकता है. यहाँ हम घटना के पीछे प्रासंगिक सिद्धांतों की समीक्षा करके ईंधन की नींव और प्रयोज्यता पर विस्तार और fluorophores और फ्लोरोसेंट नैनोकणों की एक विस्तृत विविधता के साथ अपनी संगतता प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, एंटीबॉडी लक्षित ईंधन की उपयोगिता का पता लगाया है. यहाँ दिखाए गए उदाहरण ईंधन Appl के लिए उपयोग किया जा सकता है कि सबूत प्रदानब्रेट ब्रेट और पारंपरिक पूरे पशु इमेजिंग के बीच मौजूद है कि स्थानिक शून्य को भरना संभव नहीं है, जहां ications.
ऐसे वायरस 1, 2, बैक्टीरिया 3, या छोटे स्तनपायी जीवों की आनुवंशिक संशोधन 4 प्रेरित या अनिवार्यता से एक्सप्रेस bioluminescence या तो अत्यधिक सफल रहा है और व्यापक रूप से 5-7 का प्रदर्शन किया है. Bioluminescence, स्वाभाविक रूप से अभिकर्मकों शामिल vivo में chemiluminescent प्रतिक्रिया, एक बाहरी प्रकाश स्रोत की आवश्यकता के बिना प्रकाश उत्पादन का लाभ दिया है. जैसे, bioluminescent इमेजिंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग 8 से मिला ऑटो और गैर विशिष्ट संकेत के आम कमियों से ग्रस्त नहीं है. किसी भी पता चला संकेत इरादा स्रोत से केवल निकलती बाद नतीजतन, bioluminescence एक महत्वपूर्ण संकेत करने वाली शोर अनुपात है. कई मॉडल में इन विट्रो और इन विवो अनुप्रयोगों 9 में लिए Photorhabdus luminescens से लक्स operon (480 और 490 एनएम के बीच केंद्रित उत्सर्जन अधिकतम) का शोषण किया है, वहीं छोटे mamm में इसके उपयोगए एल एस के कारण इमेजिंग शर्तों के बहुत ही प्रकृति के लिए समस्याग्रस्त किया गया है; ऑप्टिकल ऐसे हीमोग्लोबिन के रूप में अवशोषक,, और इस तरह के ऊतक और हड्डी के रूप में बिखरने एजेंटों, सर्वव्यापी अस्तित्व, दृढ़ता से पीले रंग तरंग दैर्ध्य से 3 नीले प्रभावित करते हैं. एक इंजीनियर जुगनू luciferase (उत्सर्जन अधिकतम 617nm पर) की अभिव्यक्ति हाल ही में बहुत ऑप्टिकल अवशोषण 10 पर काबू, लेकिन अभी भी प्रभाव बिखरने के अधीन है कि एक उपकरण प्रदान करने, विकसित और शामिल किया गया है.
जवाब में, लाल शिफ्ट bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) 11-13 का उपयोग कर, 650-900 एनएम, कम से कम अवशोषण और बिखराव का एक क्षेत्र के वांछित ऑप्टिकल खिड़की में उत्सर्जित संकेत करने के कई प्रयास किए गए हैं. संकेत का पता लगाने को बढ़ाने के लिए एक उपकरण के रूप में, स्वीकर्ता के रूप में दाता और एक जोड़ा fluorophore के रूप में एक bioluminescent स्रोत का उपयोग करता है जो ब्रेट, सीमित सफलता मिल गई है. इस घटना के एक लाभदायक उदाहरण, "आत्म रोशन क्वांटम डॉट्स के रूप में4; (SIQDs) 14 से मिलकर Renilla बाहरी बहुलक लाइसिन परत करने के लिए बाध्य luciferases reniformis संशोधित के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्वांटम डॉट्स (QDs). सब्सट्रेट अलावा पर, जिसके परिणामस्वरूप bioluminescent प्रतिक्रिया लाल फोटॉनों की एक महत्वपूर्ण उत्पादन पैदा करने, QDs से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन लाती है. हालांकि, इन SIQDs physiologically प्रासंगिक घटनाओं के विवो दृश्य में करने के लिए प्रयोज्यता सीमित है. इस सीमित प्रयोज्यता कारण SIQDs आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग नहीं किया जा सकता और इसलिए बहुलक खोल के एक माध्यमिक संशोधन की आवश्यकता होगी के बाद से, अंग, सेल या हित के जीन को दोहरी जांच जोड़ने की कठिनाई होने की संभावना है. उनकी प्रयोज्यता में सुधार, luciferases luminescent कोर करने के लिए सीधे बाध्य कर रहे हैं, जहां वैकल्पिक SIQDs,, हाल ही में 15 नियोजित किया गया है. SIQD अवधारणा के बंद का निर्माण, एक और अधिक लागू ब्रेट प्रणाली एक में करने के लिए Cypridina luciferase संलग्न द्वारा प्राप्त किया गया था675 एनएम के लिए 460 एनएम से एक बड़ा लाल पारी जबकि उत्पादन विशेष रूप से चूहों में ट्यूमर को निशाना बनाने में सक्षम था जो डाई 16, docyanine. गैर विकिरणवाला ऊर्जा हस्तांतरण गुजरना करने के लिए, ब्रेट अपनी फ्लोरोसेंट समकक्ष के रूप में एक ही प्राथमिक बाधाओं निम्नानुसार है: दाता उत्सर्जन और स्वीकर्ता उत्तेजना स्पेक्ट्रा और दो moieties के बीच काम दूरी के बीच एक मजबूत वर्णक्रमीय ओवरलैप होना चाहिए के आदेश पर होना चाहिए फोरस्टर त्रिज्या (5-14 एनएम दो बार फोरस्टर त्रिज्या 17 का एक प्रभावी अधिकतम दूरी के साथ, दाता स्वीकर्ता जोड़ी पर निर्भर करता है). इस दूरी निर्भरता काफी पता लगाने में वृद्धि करने के लिए एक साधन के रूप में ब्रेट उपयोग कर देखा जा सकता है कि घटनाओं के प्रकारों की सीमा.
हाल ही में एक नया दृष्टिकोण में इन विट्रो और इन विवो परिस्थितियों में दोनों की पहचान की और तहत प्रदर्शन किया गया. ब्रेट, luminescence (ईंधन) से 18, 19 अपार उत्तेजना से प्रतिदीप्ति की नींव बंद बिल्डिंग </sup> भी luminescent और फ्लोरोसेंट घटकों के बीच एक मजबूत वर्णक्रमीय ओवरलैप की आवश्यकता है. हालांकि, ब्रेट विपरीत, ईंधन luminescent स्रोत से उत्सर्जित फोटोन बाद में fluorophore मात्रा उपज के अनुसार एक लाल स्थानांतरित फोटान उत्सर्जन करता है जो एक ऑप्टिकली सुलभ फ्लोरोफोरे, द्वारा अवशोषित कर लेता है जिससे एक पूरी तरह से विकिरण प्रक्रिया है. ब्रेट करने के लिए समान है, इस दृष्टिकोण भी ऑप्टिकल अवशोषक की उपस्थिति में इमेजिंग की बाधाओं को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. परिणामस्वरूप लाल बदलाव के कारण क्षीणन में कमी और ऑप्टिकल बिखरने प्रभाव की कमी करने का पता चला संकेत में एक समग्र वृद्धि और विशिष्टता प्रदान करता है. ईंधन लक्स operon और QDs 18, 19 व्यक्त bioluminescent कोलाई के बीच होने की सूचना दी गई है. SIQDs को प्रयोगात्मक इसी तरह की है, जबकि एक बुनियादी अंतर मौजूद है: luminescent स्रोत के लिए अनुमति देता है जो fluorophore, करने के लिए शारीरिक रूप से बाध्य होने के लिए ईंधन में, यह आवश्यक नहीं हैluminescent जांच की आनुवंशिक एन्कोडिंग आर. कारण luminescent बैक्टीरिया और QDs के बीच ईंधन के सफल का पता लगाने के लिए, यह इस तकनीक सतही (त्वचा) और गहरी ऊतक (फेफड़े, जिगर) ऐसे Staphylococcus aureus और Klebsiellia निमोनिया जैसे संक्रमण दोनों के लिए लागू किया जा सकता है कि संभव है.
इसके प्रयोगात्मक महत्व की रिपोर्ट के बाद से, ईंधन स्वीकार्य luminescent और फ्लोरोसेंट जोड़े भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मजबूत गणितीय मॉडल 20 में शामिल करने के लिए विकसित किया गया है, और उसके आवेदन जैसे क्वांटम उपज के रूप में photophysical विशेषताओं की पहचान करने में उपयोग में शामिल करने के लिए विस्तार किया है. हम ईंधन के बुनियादी तकनीकों में से कुछ का वर्णन नीचे दिया. सबसे पहले, हम कम (माइक्रोन) और लंबी (सेमी) दोनों के ऊपर मौलिक ब्रेट से ईंधन जो अलग काम दूरी, इस घटना के लिए सबूत दिखा. दूसरा, हम fluorophores और फ्लोरोसेंट नैनोकणों की एक विस्तृत विविधता का परीक्षण करके संभव ईंधन जोड़े पर विस्तार. Thirडी, ईंधन अनुप्रयोगों लक्षित और गैर लक्षित ईंधन जोड़े की तुलना द्वारा जांच कर रहे हैं.
ईंधन की मौलिक प्रदर्शन बस फ्लोरोसेंट नैनोकणों या QDs साथ luminescent बैक्टीरिया के मिश्रण से प्राप्त किया जा सकता है. दो संस्थाओं शारीरिक रूप से अलग कर दिया और किसी भी कुशल रेत दूरी से बाहर रहना हो जाएगा. और ज्यादा मुश्किल में इन विट्रो और इन विवो दोनों में ईंधन संकेत अनुकूलन है. इन विट्रो शर्तों के तहत, के साथ और एक ऑप्टिकल अवशोषक उपस्थित बिना दोनों, आमतौर पर अतिरिक्त fluorophore के अलावा ईंधन प्रतिक्रिया को अधिकतम करने के लिए पर्याप्त होगा. हालांकि, इस तरह स्थिर या collisional शमन के रूप में उच्च सांद्रता घटना पर फ्लोरोसेंट संकेत का नुकसान हो सकता है. स्वतंत्र रूप से luminescent स्रोत और फ्लोरोफोरे की एकाग्रता अलग से एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के प्रदर्शन वांछित सांद्रता का अनुकूलन करने में मदद मिलेगी. विवो सांद्रता में के तहत स्थापना और ईंधन के अनुकूलन और अधिक कठिन है और एक मामले दर मामले के आधार पर ध्यान देने की जरूरत. यह एक सह बनाने के लिए मुश्किल हो सकता हैndition फ्लोरोसेंट इकाई luminescent स्रोत से ऑप्टिकली पहुँचा जा सकता है. जैसे, दो moieties के प्रत्यक्ष सह इंजेक्शन के साथ शुरुआत इष्टतम शर्तों के तहत ईंधन की सफलता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
मानक प्रोटोकॉल ऐसे एलेक्सा श्रृंखला और QDs के रूप में फ्लोरोसेंट संस्थाओं के साथ लेबलिंग बैक्टीरिया और कोशिकाओं के लिए मौजूद हैं. अक्सर यह कम सेल व्यवहार्यता या बदल चयापचय गतिविधि की तरह अवांछित प्रभाव पैदा कर सकते हैं जो एंटीबॉडी के साथ सतह functionalization या सक्रियण की आवश्यकता है. इस पर काबू पाने के लिए, यह एंटीबॉडी या सक्रियण एजेंट के इष्टतम राशि फ्लोरोसेंट लेबलिंग जबकि अधिकतम कि सेलुलर perturbations कम से कम जरूरत निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. QDs के उपयोग की वजह से उनकी विशेषता से व्यापक उत्तेजना स्पेक्ट्रा, संकीर्ण और tunable उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, और एक बड़े स्टोक्स बदलाव की संभावना से लाभप्रद है. हालांकि, QDs साइटोटोक्सिक हो सकता है और कुछ मामलों में वांछित नहीं हो सकता है.
<pवर्ग = "jove_content"> ईंधन कई ब्रेट प्रयोगों 13 में मौजूद है और luminescent और फ्लोरोसेंट स्रोतों की विविधता के लिए लागू है कि एक घटना है. अब तक, ईंधन से उत्पन्न फोटॉनों गैर विशिष्ट बातचीत या खराब डिजाइन ब्रेट प्रयोगों से उत्पन्न एक दुर्भाग्यपूर्ण पृष्ठभूमि संकेत के उत्पाद पर विचार किया गया. यह हम इस अवांछित संकेत की उपयोगिता की पहचान करने में सक्षम थे कि यहाँ का प्रदर्शन प्रयोगों के प्रकार के साथ ही है. पता चला उदाहरणों में, luminescent बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट संस्थाओं की एक विस्तृत विविधता से एक मानक फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया जानने में सक्षम फैलाना उत्तेजना स्रोत के रूप में कार्य. इसके अलावा, के कारण पर्याप्त दूरी काम करने के लिए, यह ईंधन ब्रेट की घटना के बिना निर्माण किया जा सकता है, जबकि सामान्य ब्रेट में ईंधन से एक योगदान के बिना नहीं देखा जा सकता है कि समाप्त करने के लिए सुरक्षित है. महत्वपूर्ण बात है, की वजह से एक को लक्षित आवश्यकता की कमी के कारण, ईंधन ब्रेट और सी के बीच मौजूद है कि स्थानिक अंतर को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैonventional पूरे पशु इमेजिंग तकनीक.The authors have nothing to disclose.
लेखकों जद, आह ((SLS के लिए), यूरोपीय संघ के FP7 कार्यक्रम "स्वचालन", Institut कार्नोट कार्यक्रम 11 (जद, सीएस, सीएस के लिए) न्यूयॉर्क के पाश्चर फाउंडेशन की ओर से वित्तीय सहायता के लिए उनके प्रति आभार का विस्तार करना होगा , एआर, आरटी, SLS) और आर टी, SLS के लिए परियोजना IMNOS (), Conny-Maeve चैरिटेबल फाउंडेशन (एसएलएस), आण्विक इमेजिंग में यूरोपीय मास्टर्स (आईटी), क्षेत्र Ile डी फ्रांस कार्यक्रमों MODEXA (एसएलएस), तिल (SLS) और DimMalInf (SLS, आर टी), Biologie-Sante एन ANR कार्यक्रम Grandes Investissement डी ल AVENIR इंफ्रास्ट्रक्चर्स Nationales: फ्रांस LifebioImaging (FLI) फ्रांस जीवन इमेजिंग (आर टी, SLS), फ्रांस Bioimaging (जद, SLS) और Institut पाश्चर, पेरिस. इसके अलावा, लेखकों अभिकर्मकों के लिए, जोस Bengoechea और हर्बर्ट Schweizer धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, लेखकों एंटीबॉडी उत्पन्न जो सिंडी Fevre धन्यवाद देना चाहूंगा.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |