La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.
Fluorescencia por consolidar excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) es un proceso de excitación-emisión de radiación que produce aumento de la señal y la mejora del contraste in vitro e in vivo. Porcentajes de combustible de muchos de los mismos principios subyacentes como la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), sin embargo, difiere en gran medida en las distancias de trabajo aceptables entre la fuente luminiscente y la entidad fluorescente. Mientras BRET se limita efectivamente a un máximo de 2 veces el radio de Förster, habitualmente menos de 14 nm, el combustible puede ocurrir a distancias de hasta micras o incluso cm en ausencia de un absorbente óptico. Aquí ampliamos sobre el fundamento y la aplicabilidad de FUEL mediante la revisión de los principios pertinentes que justifican el fenómeno y demostrar su compatibilidad con una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Además, la utilidad de COMBUSTIBLE de anticuerpos dirigidos se explora. Los ejemplos mostrados aquí demuestran que el combustible puede ser utilizado para la aplicaciones donde BRET no es posible, llenando el vacío espacial que existe entre BRET y de imagen animal completamente tradicional.
La modificación genética de organismos, tales como virus 1, 2, 3, bacterias o pequeños mamíferos 4 a cualquiera de inducir o bioluminiscencia expresan constitutivamente, ha sido muy exitoso y ampliamente demostrado 5-7. La bioluminiscencia, una reacción quimioluminiscente en vivo que implica los reactivos de origen natural, tiene la ventaja de la producción de luz sin la necesidad de una fuente de luz externa. Como tal, bioluminiscente de imágenes no sufre de los inconvenientes comunes de la señal de auto-y no específicos encontrados a partir de imágenes de fluorescencia 8. En consecuencia, la bioluminiscencia tiene una relación significativa de señal a ruido, ya que cualquier señal detectada se origina únicamente a partir de la fuente deseada. Mientras que muchos modelos han explotado el operón lux de Photorhabdus luminescens (máximo de emisión centrado entre 480 y 490 nm) para in vitro y en aplicaciones in vivo 9, su uso en pequeña mammALS ha sido problemática debido a la propia naturaleza de las condiciones de formación de imágenes; la existencia omnipresente de absorbentes ópticos, tales como la hemoglobina, y agentes de dispersión, tales como el tejido y el hueso, afectan en gran medida a longitudes de onda azul amarillas 3. La expresión de una luciferasa de luciérnaga ingeniería (máximo de emisión a 617 nm) se ha desarrollado e incorporado recientemente, proporcionando una herramienta que supera en gran medida la absorción óptica 10, pero todavía está sujeta a los efectos de dispersión.
En respuesta, se han producido varios intentos de desplazamiento al rojo de la señal emitida en la ventana óptica deseada de 650 a 900 nm, una región de absorción minimizado y dispersión, utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) 11-13. Como una herramienta para mejorar la detección de señal, BRET, que utiliza una fuente bioluminiscente como el donante y un fluoróforo añadido como aceptor, se ha encontrado un éxito limitado. Como ejemplo seminal de este fenómeno, "puntos cuánticos con iluminación propia4; (SIQDs) 14 consisten de modificación de Renilla reniformis luciferasas unidos a la capa de polímero de lisina externa puntos cuánticos de disponible en el mercado (puntos cuánticos). Después de la adición de sustrato, la reacción bioluminiscente resultante induce la emisión de fluorescencia de los puntos cuánticos, la generación de una producción significativa de fotones rojos. Sin embargo, estos SIQDs han aplicabilidad limitada para la visualización en vivo de eventos fisiológicamente relevantes. Esta aplicabilidad limitada es probablemente debido a la dificultad de unir la sonda dual para el órgano, célula o gen de interés, ya que los SIQDs no pueden ser codificados genéticamente y por lo tanto, requerirían una modificación secundaria de la cubierta de polímero. Para mejorar su aplicabilidad, SIQDs alternativas, cuando las luciferasas están vinculados directamente al núcleo luminiscente, recientemente se han empleado 15. La construcción de fuera del concepto SIQD, un sistema de BRET más aplicable se consiguió uniendo Cypridina luciferasa a una endocyanine tinte 16, que era capaz de dirigirse específicamente tumores en ratones, mientras que la producción de un cambio sustancial de color rojo de 460 nm a 675 nm. Para someterse a la transferencia de energía no radiante, BRET sigue las mismas restricciones primarias como su contraparte fluorescente: tiene que haber un fuerte solapamiento espectral entre la emisión de los donantes y los espectros de excitación del aceptor y la distancia de trabajo entre las dos mitades deben estar en el orden del radio de Förster (5-14 nm en función de la pareja donante-aceptante, con una distancia máxima efectiva de dos veces el radio Förster 17). Esta dependencia de la distancia limita en gran medida los tipos de eventos que se pueden observar utilizando BRET como un medio para mejorar la detección.
Recientemente se identificó un nuevo enfoque y demostrarse en tanto in vitro como en condiciones in vivo. Construido a partir de la fundación de BRET, Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) 18, 19 </sup> también requiere un fuerte solapamiento espectral entre la luminiscencia y componentes fluorescentes. Sin embargo, a diferencia de BRET, el combustible es un proceso completamente radiativo mediante el cual el fotón emitido desde la fuente luminiscente es absorbida por un fluoróforo ópticamente accesible, que posteriormente emite un fotón desplazada al rojo de acuerdo con el rendimiento cuántico fluoróforo. Similar a BRET, este enfoque también se puede utilizar para superar las limitaciones de formación de imágenes en presencia de absorbentes ópticos. El desplazamiento hacia el rojo resultante proporciona un aumento global y la especificidad en la señal detectada debido a una disminución en la atenuación y una reducción de los efectos de dispersión óptica. De combustible se ha informado de que se produzca entre Escherichia coli bioluminiscentes que expresan el operón lux y puntos cuánticos 18, 19. Si bien experimentalmente similar a los SIQDs, existe una diferencia fundamental: en el combustible, no es necesario para la fuente luminiscente de estar físicamente unido al fluoróforo, que permite FOr codificación genética de la sonda luminiscente. Debido a la detección exitosa de combustible entre bacterias luminiscentes y puntos cuánticos, es posible que esta técnica se podría aplicar a ambos superficial (piel) y el tejido profundo (pulmón, hígado) infecciones tales como Staphylococcus aureus y Klebsiellia pneumoniae.
Desde el informe de su significado experimental, combustible ha evolucionado para incluir un modelo matemático robusto 20 que se puede utilizar para predecir luminiscente aceptable y pares fluorescentes, y sus aplicaciones se han expandido para incluir su uso en la identificación de características fotofísicas tales como rendimiento cuántico. A continuación se describen algunas de las técnicas básicas de FUEL. En primer lugar, se muestra evidencia de este fenómeno sobre tanto a corto (m) y largo (cm) distancias de trabajo, que distingue fundamentalmente COMBUSTIBLE de BRET. En segundo lugar, expansión a partir de los posibles pares de combustible en el examen de una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Third, aplicaciones de combustible se investigan mediante la comparación de pares COMBUSTIBLE dirigidos y no dirigidos.
La manifestación fundamental de FUEL puede lograrse simplemente mediante la mezcla de bacterias luminiscentes con nanopartículas o puntos cuánticos fluorescentes. Las dos entidades serán separados físicamente y permanecen más allá de cualquier distancia RET eficiente. Más difícil es la optimización de la señal COMBUSTIBLE tanto in vitro como in vivo. En condiciones in vitro, con y sin un absorbedor óptico presente, por lo general la adición de un exceso fluoróforo será suficiente para maximizar la respuesta de combustible. Sin embargo, a altas concentraciones fenómenos tales como la atenuación estática o de colisión puede conducir a una pérdida de señal fluorescente. Realización de una serie de diluciones variando de forma independiente de la concentración de la fuente luminiscente y el fluoróforo ayudará a optimizar las concentraciones deseadas. El establecimiento y la optimización de combustible bajo las concentraciones in vivo es mucho más difícil y debe ser abordado en una base de caso por caso. Puede ser difícil para crear un condition donde la entidad fluorescente se puede acceder ópticamente por la fuente luminiscente. Como tal, comenzando con los compañeros de las inyecciones directas de los dos restos puede proporcionar información sobre el éxito de combustible bajo condiciones óptimas.
Existen protocolos estándar para las bacterias de etiquetado y células eucariotas con las entidades fluorescentes tales como la serie Alexa y puntos cuánticos. A menudo esto requiere funcionalización de la superficie o de la activación con anticuerpos, que puede conducir a efectos no deseados, como reducción de la viabilidad celular o la actividad metabólica alterada. Para superar esto, es importante para determinar la cantidad óptima de anticuerpo o agente de activación necesario que minimiza las perturbaciones celulares y aumentar al máximo el etiquetado fluorescente. El uso de puntos cuánticos es ventajoso debido a su amplia característicamente espectros de excitación, espectro de emisión estrecho y sintonizable, y la posibilidad de un gran desplazamiento de Stokes. Sin embargo, los puntos cuánticos pueden ser citotóxicos y pueden no ser deseable en algunos casos.
<pclase = "jove_content"> combustible es un fenómeno que está presente en muchos experimentos BRET 13 y es aplicable a una variedad de fuentes luminiscentes y fluorescentes. Hasta ahora, los fotones procedentes del combustible se consideraron el producto de interacciones no específicas o una señal de fondo desafortunado resultado de experimentos BRET mal diseñados. Es sólo con el tipo de experimentos se ha demostrado aquí que hemos sido capaces de identificar la utilidad de esta señal no deseada. En los ejemplos mostrados, las bacterias luminiscentes actúan como una fuente de excitación difusa capaz de provocar una respuesta fluorescente estándar a partir de una amplia variedad de entidades fluorescentes. Además, debido a la distancia de trabajo sustancial, es seguro concluir que mientras que el combustible se puede construir sin la aparición de BRET, en BRET en general no puede ser observado sin una contribución de FUEL. Es importante destacar que, debido a la falta de un requisito de la orientación, el combustible puede ser utilizado para cubrir la brecha espacial que existe entre BRET y Clas técnicas de imagen en los animales intactos onventional.The authors have nothing to disclose.
Los autores desean expresar su agradecimiento por el apoyo financiero de la Fundación Pasteur de Nueva York (JD, CS, CS), la EU-FP7 programa "Automation" (SLS), el Programa de Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) y el Proyecto IMNOS (a RT, SLS), la Fundación Conny-Maeve Charitable (SLS), European Masters in Molecular Imaging (a él), los programas de la Región Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) y DimMalInf (SLS, RT), la ANR Programa Grandes Investissement de l'avenir Infraestructuras Nacionales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vida Imaging (RT, SLS), Francia Bioimaging (JD, SLS) y la Institut Pasteur, París. Además, los autores desean agradecer a José Bengoechea y Herbert Schweizer para reactivos. Además, los autores les gustaría agradecer a Cindy Fevre que generó los anticuerpos.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |