Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.
Lüminesans (yakıt) ikinci, bağlanmamış Uyarma floresans in vitro ve in vivo olarak artan bir sinyal ve kontrast üreten bir ışıma uyarma emisyonu bir süreçtir. Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (Bret), henüz aynı temel ilkeleri birçok YAKIT hisseleri büyük ölçüde Işıklı kaynağı ve floresan varlık arasında kabul edilebilir çalışma mesafeleri farklıdır. BRET etkili bir şekilde 2 kez Förster yarıçapı, genel olarak en az 14 nm'lik bir maksimum sınırlı olsa da, yakıt bir optik emme yokluğunda um kadar mesafelerde cm ya da oluşabilir. Burada fenomen arkasındaki ilgili ilkeleri gözden YAKIT temeli ve uygulanabilirliği üzerine genişletmek ve floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede ile uyumluluğunu göstermek. Ayrıca, antikor hedefli YAKIT yarar keşfedilmeden. Burada gösterilen örnek YAKIT Appl için kullanılabilir olduğunu kanıtlarBRET BRET ve geleneksel bütün hayvan görüntüleme arasında bulunan uzaysal boşluğu doldurmak mümkün değildir ications.
Bu tür virüsler, 1, 2, 3 bakteri ya da küçük memeliler gibi organizmaların genetik modifikasyon 4 neden olan veya yapısal olarak ifade biyoluminesans ya da, son derece başarılı olmuştur ve yaygın olarak 5-7 göstermiştir. Bio-ışıldama, doğal olarak meydana gelen reaktif içeren bir in vivo kemilüminesan reaksiyon, harici bir ışık kaynağı için gerek kalmadan ışık üretme avantajına sahiptir. Bu nedenle, biyolojik olarak ışık veren görüntüleme flüoresan görüntüleme 8 mesafede oto-ve spesifik olmayan sinyalin ortak sakıncaları muzdarip değildir. Tespit edilen bir sinyal amaçlanan kaynağından kaynaklanan sadece tarihi Sonuç olarak, biyoışıldama önemli bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Birçok model in vitro ve in vivo uygulamaları için 9'da Photorhabdus luminescens, lux operon'u (480 ve 490 nm arasında ortalanmış emisyon maksimum) yararlanan da, küçük bir memeli konakçının olarak kullanımıals nedeniyle görüntüleme koşulların doğası sorunlu olmuştur; optik hemoglobin gibi emiciler, ve bu doku ve kemik gibi saçılma ajanların pervading varlığı, güçlü sarı dalga boylarındaki 3 mavi etkiler. Işlenmiş bir ateşböceği lusiferaz (617nm emisyon en az) ait ekspresyon son zamanlarda büyük ölçüde optik absorpsiyon 10 üstesinden gelir, ama yine de etkiler saçılma tabi olan bir araç sağlayan, geliştirilmiş ve dahil edilmiştir.
Buna karşılık, kırmızı-shift biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) 11-13 kullanılarak, 650-900 nm, minimize emilim ve dağılım bir bölgenin istenilen optik penceresinin içine yayılan sinyal birden girişimleri olmuştur. Sinyal algılama geliştirmek için bir araç olarak, alıcı olarak donör ve ilave floroforun olarak biyolüminesens kaynağını kullanan Bret, sınırlı başarı buldu. Bu olayın bir seminal örneği, "kendini aydınlatıcı kuantum noktalar olarak4; (SIQDs) 14 oluşur Renilla dış polimer-lizin tabakaya bağlanmış lusiferazlar reniformis modifiye piyasada mevcut kuantum noktaları (QDS). Ayrıca alt-tabaka üzerine, sonuçtaki biyolüminesans reaksiyon kırmızı bir foton önemli üretim üreten, QDS gelen floresan emisyon neden olur. Bununla birlikte, bu SIQDs fizyolojik olarak ilgili olayların vivo görselleştirme için uygulanabilirliği sınırlıdır. Bu sınırlı uygulanabilirlik nedeniyle SIQDs genetik olarak kodlanmış edilemez ve bu nedenle polimer kabuğun ikinci bir değişiklik gerektirir, çünkü, organ, hücre veya ilgi duyulan gen için çift sonda bağlama zorluğu muhtemeldir. Bunların uygulanabilirliğini geliştirmek için, lusiferazların parlak iç ye direkt olarak bağlı olan alternatif SIQDs, yakın zamanda 15, kullanılmıştır. SIQD kavramının kapalı bina, bir daha uygulanabilir Bret sistem bir in'e Cypridina lüsiferoz ekleyerek elde edildi675 nm ile 460 nm arasında önemli bir kırmızı bir değişim üretirken özellikle farelerde tümörler hedefleme yeteneğine sahip olduğunu boya 16, docyanine. -Olmayan ışıma enerji transferi geçmesi, Bret onun floresan muadili olarak aynı birincil kısıtlamaları aşağıdaki gibidir: donör emisyon ve alıcı uyarım spektrumları ve iki yarımlar arasında çalışma mesafesi arasında güçlü bir spektral örtüşme olmalıdır sırasına olmalıdır Förster yarıçapı (5-14 nm iki Förster yarıçapı 17 etkili bir maksimum mesafe ile, verici-alıcı çifti bağlı olarak). Bu mesafe bağımlılık büyük ölçüde artırmak için bir algılama aracı olarak Bret kullanılarak gözlemlenebilir olay türlerini kısıtlar.
Son zamanlarda yeni bir yaklaşım, in vitro ve in vivo koşullarında hem de tanımlanmış ve altında gösterilmiştir. Bret, Lüminesans (yakıt) 18, 19, bağlanmamış Uyarma tarafından Floresans temel kapalı Binası </sup> Ayrıca, ışık veren ve floresan bileşenler arasında kuvvetli bir örtüşme spektral gerektirir. Bununla birlikte, farklı BRET, yakıt parlak kaynağından yayılan foton sonradan flüorofor kuantum verimi göre kırmızı kaydırılmış foton yayan bir optik olarak erişilebilir bir florofor, tarafından emilir ve böylece tamamen ışınımsal bir süreçtir. BRET benzeyen, bu yaklaşım aynı zamanda optik emicilerin mevcudiyetinde görüntüleme kısıtların üstesinden gelmek için kullanılabilir. Elde edilen kırmızı kayma zayıflama nedeniyle bir azalma ve optik saçılma etkilerin azalmasına bulgulanan sinyal içinde genel bir artış ve özgüllük sağlar. YAKIT lux operon ve QDS 18, 19 ifade eden biyolüminesans Escherichia coli arasında meydana bildirilmiştir. SIQDs deneysel benzer olsa da, temel bir fark var: Işıklı kaynak fo sağlar florofora, fiziksel sınır olduğu için YAKIT, bu gerekli değildirparlak prob genetik kodlama r. Nedeniyle, ışık yayan bakterilerin ve QDS arasında yakıtın başarılı tespiti için, bu teknik, yüzeysel (deri) ve derin doku (akciğer, karaciğer), örneğin Staphylococcus aureus ve Klebsiellia pneumoniae gibi enfeksiyonlar hem de uygulanabilir mümkündür.
Deneysel önemi rapordan bu yana, YAKIT kabul Işıklı ve floresan çiftleri tahmin etmek için kullanılır olabilir sağlam bir matematiksel model 20 içerecek şekilde gelişti ve uygulamaları gibi kuantum verimi gibi fotofiziksel özelliklerinin belirlenmesinde kullanımını kapsayacak şekilde genişlettik. Biz YAKIT temel bazı teknikler aşağıda açıklanmaktadır. Öncelikle, kısa (um) ve uzun (cm) hem de üzerinde temelden Bret YAKIT ayıran çalışma mesafeleri, bu olay için kanıt gösterebilir. İkincisi, biz floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede inceleyerek olası YAKIT çiftleri üzerine genişletmek. Third, YAKIT uygulamaları hedefli ve hedefli olmayan YAKIT çiftleri karşılaştırılarak incelenmiştir.
Yakıtın temel gösterilmesi sadece flüoresan nanopartiküller ya da QDS ile lüminesan bakteri karıştırılarak elde edilebilir. İki kişiler fiziksel olarak ayrılmış ve herhangi bir etkili RET mesafe ötesinde kalır edilecektir. Daha zor in vitro ve in vivo hem de YAKIT sinyal iyileştirmedir. In vitro koşullar altında, ve bir optik absorber mevcut olmadan, hem de genellikle aşırı fluorofor eklenmesinin YAKIT tepkisini maksimuma çıkarmak için yeterli olacaktır. Ancak, bu tür statik veya çarpışma su verme gibi yüksek konsantrasyonlarda olgulara floresan sinyalinin bir kaybına yol açabilir. Bağımsız bir şekilde, ışık yayan kaynağı ve fluorofor konsantrasyonu değiştirilerek bir seyreltme serisi yapılması istenen konsantrasyonları optimize etmek için yardımcı olacaktır. Vivo konsantrasyonlarda altında kurulması ve yakıt optimizasyonu çok daha zordur ve bir vaka-by-case bazında ele alınması gerekiyor. Bir co oluşturmak zor olabilirndition floresan varlık ışıldayan kaynağı tarafından optik ulaşılabilir nerede. Bu nedenle, her iki kısımların doğrudan eş enjeksiyonu ile başlayan ve optimal koşullar altında YAKIT başarısı ile ilgili bilgiler sağlayabilir.
Standart protokoller örneğin Alexa serisi ve QDS gibi floresan elemanlar ile etiketleme bakteri ve ökaryotik hücreler için vardır. Genellikle bu azalması hücre canlılığı veya değiştirilmiş metabolik aktivite gibi istenmeyen etkilere yol açabilir antikorlarla yüzey işlevselleştirilmesini veya aktivasyon gerektirir. Bunun üstesinden gelmek için, bu antikor veya aktivasyon maddesinin optimal miktarı flüoresan etiketleme maksimize ederken, hücresel bozulmaları en aza indirir gerekli belirlemek için önemlidir. QDS kullanılması nedeniyle tipik olarak geniş uyarma spektrumları, dar ve ayarlanabilir emisyon spektrumları ve büyük bir Stokes kayması olasılığı avantajlıdır. Bununla birlikte, QDS sitotoksik olabilir ve bazı durumlarda arzu edilir olmayabilir.
<pclass = "jove_content"> YAKIT birçok Bret deneylerde 13 bulunur ve Işıklı ve floresan çeşitli kaynaklardan için geçerli bir olgudur. Şimdiye kadar, yakıt edilen fotonlar, spesifik olmayan etkileşimleri ya da kötü tasarlanmış deneylerden elde edilen BRET talihsiz bir arka plan sinyalinin ürün olarak kabul edildi. Biz bu istenmeyen sinyalin programını belirlemek mümkün Burada gösterilen deney türü ile sadece. Gösterilen örneklerde, ışık yayan bakteriler floresan birimlerinin çeşitli standart bir floresan tepkisi ortaya çıkarma yeteneğine sahip bir yaygın uyarım kaynağı olarak hareket ederler. Üstelik, önemli bir çalışma mesafesine, bu YAKIT BRET oluşumu olmadan inşa edilebilir olsa da, genel olarak BRET yakıt katkısı olmadan gözlemlenemeyen sonucuna güvenlidir. Önemli bir şekilde, bir hedef ihtiyacının olmaması nedeniyle, yakıt BRET ve c arasında bulunan uzaysal açığı için kullanılabilironventional bütün hayvan görüntüleme teknikleri.The authors have nothing to disclose.
Yazarlar JD, AH ((SLS), AB-FP7 programı "Otomasyon", Institut Carnot Programı 11 (JD, CS, CS) New York Pasteur Vakfı'nın maddi destek için şükranlarını sunarım , AR, RT, SLS) ve RT, SLS Projesi IMNOS (), Conny-Maeve Vakfı (SLS), Moleküler Görüntüleme European Masters (BT), Bölge Ile de France programları MODEXA (SLS), SUSAM (SLS) ve DimMalInf (SLS, RT), Biologie-Santé en ANR Program Grandes Investissement de L'Avenir Altyapılar Nationales: Fransa LifebioImaging (FLI) Fransa Yaşam Görüntüleme (RT, SLS), Fransa Biyogörüntüleme (JD, SLS) ve Institut Pasteur, Paris. Ayrıca, yazarlar reaktifler için, José Bengoechea ve Herbert Schweizer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar antikorları oluşturulan Cindy FEVRE teşekkür etmek istiyorum.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Escherichia coli expressing the luxABCDE operon | kindly provided by José A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer | ||
Klebsiella pneumoniae 52145 | 52145 is a serotype K2 reference strain | ||
Luria Bertani (LB) | standard growth media | ||
Q-Tracker 705 | Life Sciences | Q21061MP | |
Q-Tracker 800 | Life Sciences | Q21071MP | |
Alexa 555 | Life Sciences | S21381 | |
Alexa 568 | Life Sciences | S11226 | |
Alexa 633 | Life Sciences | S21375 | |
Alexa 700 | Life Sciences | S21383 | |
Non-fluorescent microspheres | Polysciences, Inc | 15913 | |
Pink microspheres | Life Sciences | F8887 | 40nm diameter |
yellow microspheres | Life Sciences | F8888 | 40nm diameter |
Ivis Spectrum | PerkinElmer | ||
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO | Thermo Scientific Pierce | 21425 | |
HABA assay kit | Thermo Scientific Pierce | 28005 | |
Bradford assay | Bio-Rad | 500-0201 |