De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Sporadiske DNA mutasjoner i germline kan føre til redusert reproduktiv suksess, og hvis arvet, kan føre til genetisk sykdom eller økt predisposisjon for kreft hos avkommet 1-3. Betydelige bevis viser at en stor andel av de novo mutasjoner er arvet fra fars germline 4, og at antall mutasjoner i avkom er positivt korrelert med faderlig alder på tidspunktet for unnfangelsen fem. Jo høyere andelen av hann mutasjoner antas å være et resultat av forskjellen i alder under gametogenesis mellom kjønn, jo større antallet av spermatogenesecelledelsammenlignet med antallet av oogenic celledelinger i den kvinnelige kimlinje 2, og en progressiv nedgang i DNA reparere effektivitet med alderen hos menn. Alle disse faktorer bidrar til en økt sannsynlighet for replikasjonsfeil i den mannlige kimlinje 6. Men til virkningen av faderlig eksponering Environmental faktorer på hyppigheten av de novo mutasjoner er fortsatt usikker. Ikke desto mindre er kjent et stort antall miljømessige midler for å indusere bakteriecelle-mutasjoner i gnagere 7, og det er bevis på at noen av disse midler kan også påvirke den menneskelige kimlinje 8.. På tross av disse problemer, er kjemikalier rutinemessig testet for deres evne til å indusere mutasjoner i somatiske celler for reguleringsformål, og det er generelt antatt at somatiske tester som er tilstrekkelig til å beskytte den kimlinje. Derfor blir kjemikalier bare sjelden målt for deres evne til å indusere bakteriecelle-mutasjoner.
En grunn til kimcellemutagenitet testing stor grad har vært utelatt fra den regulatoriske beslutningsprosessen er en mangel på praktiske metoder. Tradisjonelle gnager-baserte metoder, slik som de dominerende dødelige 9 og spesifikke locus 10 tester, anslå bakterie celle mutasjon priser ved å score mutante fenotyper i embryoer eller avkom aveksponerte foreldre. Disse analyser krever at det brukes et meget stort antall dyr, tid og ressurser for å skaffe statistisk meningsfulle resultater.
Selv om flere moderne metoder for å kvantifisere bakterie celle mutasjon har nylig dukket opp, mange lider mangler i form av deres praktiske, effektivitet og biologisk relevans. For eksempel, gjenta lengde mutasjoner ved utvidet enkel tandem repeat (ESTR) loci kan kvantifiseres i mannlige kjønnsceller ved hjelp av en enkelt molekyl PCR tilnærming 15. Imidlertid kan gjennomføringen av denne metoden være teknisk utfordrende og arbeidskrevende, og i motsetning til punktmutasjoner, det biologiske og helse betydningen av endringer i repetisjons lengden på svært ustabil ESTR loci fortsatt uklare 16. Moderne hele genomsekvensering teknologier kan gi et vell av biologisk menings data når den brukes til problemet med arvelige mutasjoner 4,17, men de høye kostnadene, høye feilrater, krevde forbundet valideringå bekrefte mutasjoner, og bioinformatikk utfordringer fortsatt begrense rutinemessig anvendelse av dette alternativet i en regulerende testing kapasitet 18.
Heri beskrives en praktisk metode for å kvantifisere induserte mutasjoner direkte i kjønnsceller av transgene hannmus. Denne protokollen er beskrevet for den transgene MutaMouse modell som har flere sammenkjedede kopier av et rekombinant λgt10 fag-vektor inneholdende en Escherichia coli-lacZ-reporter-genet integrert i begge kopier av kromosom 3 19 (figur 1).
Denne protokollen er også relevant for andre transgene gnagere (TGR) modeller basert på de samme prinsippene (BigBlue mus og rotter, eller lacZ plasmid mus, etc.) Eller litt forskjellige reporter gener (GPT delta mus og rotter, TGR-modellene i Lambert et al. 20). Denne metoden er basert på den TGR mutasjonsanalyse er beskrevet i en nylig utgittog revidert OECD TG 21 og vi utdype de spesielle hensyn som kreves for å imøtekomme vurdering av mutasjoner i den mannlige germline grunn av de unike egenskapene til spermatogenesen. I korthet innebærer analysen utsette transgene hannmus til en mutagen substans, etterfulgt av en samplingstids der pre-mutasjons lesjoner er festet til stabile mutasjoner. På den valgte prøvetaking tid, mus avlives og kjønnsceller er hentet fra enten cauda bitestikkel eller sædkanaler. Som diskutert nedenfor, kan mutagene virkninger ved forskjellige faser av spermatogenesen bestemmes ved å velge tiden mellom eksponering og prøvetaking. Transgene innsatser, bestående av flere kopier av λ phage genomet per celle, er isolert fra bakteriecellen genomisk DNA og pakket inn i fag-λ tomme kapsider lage infeksiøse λ fag-partikler som deretter brukes til å infisere en E. coli vert. De infiserte bakterier dyrkes på selective medier som kan skille celler som inneholder en vektor med en mutert kopi av lacZ fra celler som villtype lacZ. Den mutagene virkningen av eksponering på hann kimlinje bestemmes ved å sammenligne hyppigheten av mutante transgener mellom kontroll og behandlede mus (figur 2, er gjennomgått i Lambert et al. 20). Et stort antall av kjønnsceller kan bli analysert fra en enkelt mus, noe som gir denne analysen overlegen sensitivitet enn tradisjonelle metoder, og samtidig redusere antallet dyr som kreves. Og fordi ingen spesialisert utstyr eller opplæring er nødvendig, gir denne analysen en praktisk og effektiv alternativ for bakterie celle mutasjonstesting i de fleste moderne toksikologi / molekylærbiologiske laboratorier.
En viktig forutsetning for effektiv anvendelse av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse er en forståelse av spermatogenic syklus (figur 3). Tiden for mus kjønnsceller til fremgang fra stem celler i sædkanaler til spermatogonier, spermatocytter, spermatider, og til slutt å modne sædceller i bitestiklene (ie. spermatogenesen) er ca 49 dager. Mutasjon kan oppstå på ulike faser av denne syklusen og er ofte sammensatte bestemt. To viktige funksjoner som er av særlig relevans for mutagenese i mannlige kjønnsceller er opphør av DNA-syntese under tidlig meiose, og den progressive tap av DNA-reparasjon kapasitet 6 i slutten av post-meiose, to prosesser som er nødvendige for induksjon og fiksering av fleste mutasjoner.
På grunn av disse unike egenskaper av spermatogenese, er det tre viktige eksperimentelle variabler for gjennomføring av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse: (1) testforbindelsen administrasjonstid; (2) den samplingstid; og (3) valget av bakterie cellepopulasjon for å samle inn for analyse (Figur 3 og Tabell 1). Administrasjonstid er experimental variabel som bestemmer hvor lenge målceller blir utsatt for testforbindelsene. Lengden av administrasjonstiden kan også anvendes til å målrette eksponeringer til spesifikke celletyper eller faser av spermatogenesen. For eksempel kan en enkelt dag administrering brukes til å bestemme virkningene av en akutt eksponering på en bestemt celletype. På samme måte kan eksponeringen være fokusert til en hel spermatogenic fase, for eksempel ved å målrette bare meiotically dele spermatocytter, eller mitotisk dele spermatogonier ved hjelp av en 2 ukers administrasjonstid og en passende prøvetaking. Kroniske og sub-kronisk administrering ganger brukes for å vurdere virkningene av langtidseksponering, for å sikre tilstrekkelig farmakokinetiske fordeling av testforbindelsen, eller tillate tilstrekkelig akkumulering av mutasjoner fra svake mutagenene (for eksempel 28 dagers administrasjon tid anbefales i OECD-test retningslinje).
Samplingstiden er kritisk variabel for å bestemme ved hvilkenfase av spermatogenesen målcellene var ved tidspunktet for eksponering. Prøvetakings tid bestemmer hvor mye tid, og derfor hvor mye videre langs spermatogenic syklus, cellene passerer gjennom etter eksponering. For eksempel, for å undersøke effekter i stamcellespermatogonier, en sampling Tid> 49 dager er nødvendig hvis samle fullt modnet sperm, eller> 42 dager hvis samle umodne kjønnsceller fra sædkanaler, for å sikre at alle innsamlede cellene har hatt nok tid til å utvikle seg fra utsatt stammer celler. Det er viktig å merke seg at en sampling på minst 70 døgn ville være å foretrekke for å demonstrere en virkelig stamcelle effekt for å gi tilstrekkelig tid for farmakokinetisk fordeling av toksikanten, for eliminering av celler eksponert i senere faser av spermatogenese, og for å utgjøre en periode på midlertidig sterilitet som kan oppstå ~ 6 uker etter eksponering for sterkt mutagene forbindelser 22. Likeledes vil en prøvetakingstiden på 21 dager at spermier collected fra cauda bitestikkelen ville ha nettopp fullført meiose på den siste dagen av eksponering.
Kjønnsceller kan samles som modne sædceller fra cauda bitestikkelen, eller som en blanding av ulike spermatogenic celletyper fra sædkanaler. Modne sædceller forbli i cauda for ~ 3 dager, noe som gjør det mulig å bestemme med relativ nøyaktighet på celletypen eller fase av spermatogenesen hvorfra sperm stammer for en gitt eksperimentell design. Dermed analyse av cauda sperm tillatelser svært målrettede undersøkelser av scenespesifikke mutasjons effekter. På den annen side, cellesuspensjoner som er samlet fra de sædkanaler inneholde en blanding av forskjellige bakterie celletyper i forskjellige faser av utvikling, og dermed gi dårligere oppløsning av spermatogenic fase hvor mutasjoner stammer. I tillegg er cellesuspensjoner gjenvunnet fra de sædkanaler en tendens til å inneholde en overrepresentasjon av spermatider, etterfulgt av spermatocytter, og very noen spermatogoniene og stamceller (disse mengder er representert ved graderte hvite streker i Figur 3). Videre kan suspensjoner fremstilt fra sædkanaler også inneholde ulike somatiske celler. Således, fordi så mange typer celler er til stede, mutasjons effekter kan påvirkes av en rekke ikke-målceller. Men prøvetaking fra sædkanaler tilbyr et økonomisk alternativ for samtidig screening flere bakterie celletyper, og enkel integrasjon av bakterie celle analyse inn i standard OECD testprotokoll for somatisk mutasjon.
For å gjenta, avhengig av behovene til etterforsker, administrasjonstid, prøvetaking tid og samlet cellepopulasjon kan justeres for å avhøre effekten av eksponering i ulike celletyper og i ulike faser av spermatogenesen. Ved å nøye velge disse variablene, kan eksperimenter være utformet for målrettet mekanistiske studier, eller for mer generalisert regulatoriske testing formål.
For å oppnå ferdigheter i analysen, anbefales det bruk av en akutt oral administrering av 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosourea (NOR), etterfulgt av en 70 dagers samplingstid som positiv kontroll. Analyse av cauda sperm rettet således spermatogonial stamceller (figur 3), som typisk oppviser en 4-5 gangers økning i mutantfrekvens (MF) over kontrollene etter dette svært mutagen dose av NOR. Det bør bemerkes at denne dosen er kjent for å indusere sterilitet 6 uker etter eksponering, slik at det kan ikke være en egnet kontrolldose for kortere samplingstider. Denne dosen vil også produsere en påvisbar økning i MF i de fleste somatiske vev 20. De representative resultatene som presenteres nedenfor ble generert etter en akutt +70 eksponering diett med tre doser av NOR opp til og med 100 mg / kg.
Sammenlignet med tradisjonelle metoder, gir TGR bakterie celle mutasjonsanalyse en raskere, mer økonomisk og mer sensitive hjelp av kvantifisering indusert in vivo bakterie celle mutasjoner. Ved vurderingen av transgenet MF direkte i sæd, i motsetning til avkom, antall dyr, er tid og ressurser som kreves for å vurdere kimlinje mutagenisitet for en enkelt forbindelse reduseres vesentlig. Når det gjelder følsomhet, var vi i stand til å oppdage en betydelig 2,6 ganger økning i spermatogonier stamcelle MF etter eksponering for 25 mg / kg NOR med bare fem dyr per gruppe dose. I kontrast, den spesifikke locus analysen var ikke i stand til å oppdage noen vesentlig endring i MF på denne samme dose ved hjelp av> 3000 mus i den eksponerte gruppen og> 500.000 kontroll mus 28.
I tillegg til sin egnethet for både mekanistiske og regulatoriske undersøkelser, gir denne metoden en mulighet for sammenlignende studier mellom somatiske og kjønnsceller Mutatipå priser. Nylige bevis antyder at for noen agenter kjønnscelle mutasjoner kan induseres ved lavere konsentrasjon enn det som kreves for somatisk mutasjon. For eksempel, forlenget eksponering for N-hydroxymethylacrylamide, en metabolitt av maten carcinogen akrylamid 12, øker frekvensen av dominerende dødelige bakteriecelle mutasjoner i mus uten å påvirke mikrokjernefrekvensen i røde blodceller, en tradisjonell måling av somatiske celle cytogenetisk skade 13. I tillegg eksponering av mus til både mainstream og sidestream tobakksrøyk årsaker forhøyede mutasjons frekvenser ved tandem gjenta DNA loci i sperm ved doser som ikke øker blod mikrokjernefrekvens 14. Disse funnene utfordrer antagelsen om at somatiske gentoksisitet testing er alltid beskyttende av germline, og forsterke etterspørselen etter en mer effektiv og kostnadseffektiv måte å kvantifisere bakterie celle mutasjon frekvens. Men, er fortsatt svak bevisene for fortrinnsrett bakterie celle mutagener, Hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelig data for å sammenligne mutasjon priser i somatiske og bakterie celle vev. Den TGR mutasjonsanalyse tillater parallell testing og sammenligning av indusert mutasjon priser i flere vev ved hjelp av den samme transgenet. Dermed komparativ mutasjon testing med TGR analysen vil bidra til å fylle datahull rundt muligheten for fortrinnsrett bakterie celle effekter.
Samtidig vurdering av somatiske og bakterie celle mutasjon for regulatoriske testing vil også forbedre effektiviteten ved å redusere antall dyr som kreves. OECD-retningslinjen for somatisk mutasjon innstiller en 28 dagers administrasjon tid, etterfulgt av en tre dagers samplingstid (28 + 3). Analyse av cauda sædceller kan gi dårlig sensitivitet på dette tidspunkt, siden det er rettet mot cellene eksponert for det meste i løpet av spermatocyte og spermatid faser av spermatogenesen (figur 3). Celler i disse fasene ikke syntetisere DNA og gradvis miste sin kapasitet for DNA-reparasjon 6 </ Sup>. Videre, ville samplings cauda sperm på dette tidspunkt ikke klarer å påvise mutasjoner som forekommer i spermatogoniene og stamceller. Derfor, for integrering i 28 + 3 design, anbefaler OECD retningslinje samle kjønnsceller fra sædkanaler. Denne blandet populasjon inneholder celler avledet fra DNA-syntese og reparasjon dyktig celletyper, inkludert stamceller og er utsatt over flertallet av spermatogenese faser. Imidlertid, på grunn av den blandede naturen av disse celler, sædkanaler celle analyse gir ikke fasespesifikk informasjon. Videre er det bekymring for at tilstedeværelsen av ikke-målceller kan påvirke observerte MF (f.eks falske positive kimcellemutagen anrop på grunn av forurensning av muterte somatiske celler, eller fortynning av et mutert bakterie cellesignal fra DNA-reparasjon-manglende kimceller) . Foreløpig er det ikke tilstrekkelig med data for å konkludere om resultatene fra sædkanaler celler på 28 + 3 tilbyr samme sensitivitet og spesifisitet ens cauda sperm på senere tidspunkter. Vårt laboratorium sammenligner for tiden indusert MFs i sædkanaler celler og cauda sperm samlet etter ulike prøvetakingstider for å løse dette punktet. Vi merker oss at OECD Guideline antyder en alternativ samplingstid på 28 dager for langsomt skille vev så som lever som også kan være egnet for bakteriecelleanalyse. Likevel er tilgjengelig data fortsatt utilstrekkelig og vi er nå i stand til å anbefale en enkelt eksperimentell design for samtidig analyse av somatiske celler og kjønnsceller ved hjelp av TGR mutasjonsanalyse for regulatoriske testing.
Et karakteristisk trekk ved denne analysen som bør bemerkes er at mutasjonshendelser vurderes på en ikke-transgen murin. Men det er rikelig med bevis som tyder på at transgenet reagerer på miljø mutagener på en lignende måte til endogene gener 20. I tillegg, fordi den nøyaktige opprinnelse uavhengige mutasjonshendelser er vanskelige åløse, er resultatene generelt rapportert som en mutant frekvens (i motsetning til en mutasjonsfrekvens). Selve mutasjonsfrekvens kan løses hvis resultater er korrigert for klonal ekspansjon (dvs.. Delingen og multiplikasjon av en eneste mutert celle som kan bidra til den observerte frekvensen for transgene mutanter) ved DNA-sekvensering. Sekvensering av de mutante transgener kan bli utført for å karakterisere lacZ-mutasjoner, og identifisere mutanter som kan være avledet fra klonal ekspansjon hendelser, selv om dette øker i betydelig grad tiden og kostnadene for analysen. I tillegg til lacZ-genet, havner theλgt10 transgen vektor en alternativ temperaturavhengig mutasjon-reporter-genet: en variant av λ cII-genet, som er kortere (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) og lettere å sekvensere 29. Sekvense muliggjør også analyse av indusert mutasjon spektrum, og gir innsikt i mutational mekanismen av forbindelsen i spørsmålet. Et ekstremt eksempel på klonal ekspansjon er forekomsten av en "jackpot" mutasjon (ie., Transgene mutasjoner på et svært tidlig stadium av et organ utvikling som bidrar til en dramatisk forhøyet MF, noen ganger hundrevis til tusenvis av ganger større enn bakgrunnen). Dyr eller vev med en "jackpot"-mutasjon bør fjernes fra analysen.
Analysen som vi har beskrevet er bredt anvendelig på andre TGR modeller som BigBlue mus og rotte, og lacZ-plasmid-mus, alle av hvilke havnen lignende mutasjon rapportør vektorer (gjennomgått i 20). De aller fleste av bakterie celle studier utført hittil som bruker lignende metoder har fokusert nesten utelukkende på godt karakteriserte mutagener som NOR og stråling (anmeldt i 30). Det er forventet at med den siste utgaven av OECD TG for TGR analysen, vil dette assay blistadig mer populært for kjemisk screening og regulatoriske evaluering. Innlemmelse av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse i en regulatorisk testing batteri vil fylle det eksisterende gapet ved å tillate effektiv vurdering av mutasjons induksjon i kjønnsceller 11. Videre kan denne analysen anvendes for å måle MF i praktisk talt en hvilken som helst vev, som gir et egnet middel for å sammenligne de relative sensitiviteter av somatiske celler og kimceller til induksjon av mutasjoner av forurensninger ved identiske genetiske endepunkter.
The authors have nothing to disclose.
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MutaMouse | Covance | – | |
E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |