De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Sporadiske DNA mutationer i kønscellerne kan føre til reduceret reproduktiv succes, og hvis arvet kan forårsage genetisk sygdom eller øget disposition til kræft i afkommet 1-3. Betydelige beviser viser, at en stor del af de novo mutationer nedarves fra fædrene kimcellelinje 4, og at antallet af mutationer i sit afkom positivt korreleret med faderlig alder på tidspunktet for undfangelsen 5. Jo højere andel af mandlige mutationer menes at være et resultat af forskellen i alder under gametogenese mellem kønnene, jo større antallet af sædcelledannende celledelinger, sammenlignet med antallet af oogenic celledelinger i den kvindelige kimcellelinje 2 og en gradvis nedgang i DNA reparere effektivitet med alderen hos mænd. Alle disse faktorer bidrager til en øget sandsynlighed for replikation fejl i den mandlige germlinie 6. Men for at virkningen af faderlig eksponering Environmental faktorer på hyppigheden af de novo mutationer er fortsat usikker. Ikke desto mindre er kendt et stort antal miljøskadelige stoffer at fremkalde kønscellemutationer hos gnavere 7, og der er stigende tegn på, at nogle af disse midler også kan påvirke den menneskelige kimcellelinje 8. På trods af disse bekymringer, kemikalier rutinemæssigt testet for deres evne til at fremkalde mutationer i somatiske celler til reguleringsmæssige formål, og det er almindeligt antaget, at somatiske kontrol er tilstrækkelig til at beskytte kimcellelinjen. Derfor er kemikalier kun sjældent bedømmes for deres evne til at inducere kønscellemutationer.
En af grundene kimcellemutagenicitet test har været stort set udeladt fra den lovgivningsmæssige beslutningsproces er en mangel på praktiske metoder. Traditionelle gnaver-baserede metoder, såsom de dominerende letale 9 og specifikke locus 10 test, vurderer kønsceller mutationsrater ved at score mutant fænotyper i embryoner eller afkomudsatte forældre. Disse analyser kræver brug af et meget stort antal dyr, tid og ressourcer til at erhverve statistisk meningsfulde resultater.
Selv om flere moderne metoder til kvantificering kønsceller mutation nylig er dukket op, mange lider mangler med hensyn til deres funktionalitet, effektivitet og biologiske relevans. For eksempel, gentag længde mutationer ved udvidet enkel tandemgentagelse (ESTR) loci kan kvantificeres på mandlige kimceller hjælp af et enkelt molekyle PCR tilgang 15. Dog kan udførelse af denne metode være teknisk udfordrende og besværlig, og i modsætning punktmutationer, den biologiske og sundhedsmæssige betydning af ændringer i gentagelse længden af den meget ustabile ESTR loci fortsat uklare 16. Moderne hele genom sekventering teknologier kan give et væld af biologisk meningsfuld data, når den anvendes på problemet med arvelige mutationer 4,17, men de høje omkostninger, høje fejlprocenter, der er forbundet validering påkrævetat bekræfte mutationer, og bioinformatik udfordringer stadig begrænse rutinemæssig anvendelse af denne mulighed i et lovmæssige forsøg kapacitet 18.
Heri beskriver vi en praktisk metode til at kvantificere inducerede mutationer direkte i kimceller transgene hanmus. Denne protokol er beskrevet for det transgene MutaMouse model, som har flere sammenkædede kopier af et rekombinant Agt10 fag-vektor, der indeholder en Escherichia coli-lacZ-reportergenet integreres i begge kopier af kromosom 3 19 (figur 1).
Denne protokol er også relevant for andre transgene gnavere (TGR) modeller baseret på de samme principper (BigBlue mus og rotte, eller lacZ plasmid mus mv.) Eller lidt forskellige reportergener (GPT delta mus og rotter, TGR modeller revideret i Lambert et al. 20). Denne metode er baseret på TGR mutationsanalyse beskrevet i en nylig udgivetog reviderede OECD test guideline 21 og vi uddybe de særlige overvejelser, der er nødvendige for at imødekomme vurdering af mutationer i den mandlige kimcellelinje på grund af de unikke egenskaber spermatogenesen. Kort fortalt analysen indebærer udsætte transgene hanmus til et mutagent stof, efterfulgt af en prøveudtagning tid, hvor præ-mutationelle læsioner er fastsat til stabile mutationer. På det valgte prøveudtagningstidspunkt musene aflivet og kimceller opsamles fra enten cauda epididymis eller sædkanalerne. Som diskuteret nedenfor kan mutagene effekter på forskellige faser af spermatogenesen bestemmes ved at vælge den tid mellem eksponering og prøvetagning. Transgene skær, som omfatter multiple kopier af λ faggenomet per celle, er isoleret fra kimcelle genomisk DNA og pakket ind i tomme λ fag capsider skaber infektiøse λ fagpartikler, der derefter bruges til at inficere en E. coli-vært. De inficerede bakterier dyrkes på selective medier, der kan skelne celler, der indeholder en vektor med en muteret kopi af lacZ fra celler, der huser vildtype lacZ. Den mutagene effekt af eksponering på den mandlige germline bestemmes ved at sammenligne hyppigheden af mutant transgener mellem kontrol og behandlede mus (figur 2, revideret i Lambert 20 et al.). Et stort antal af kimceller kan analyseres fra en enkelt mus, giver dette assay overlegen følsomhed i forhold til traditionelle metoder, samtidig med at antallet af forsøgsdyr. Og fordi ingen specialiseret udstyr eller uddannelse er nødvendig, denne analyse giver en praktisk og effektiv løsning for kønsceller mutation test i de fleste moderne toksikologiske / molekylærbiologiske laboratorier.
En væsentlig forudsætning for en effektiv anvendelse af TGR kimcellens mutation assay er en forståelse af den spermatogene cyklus (Figur 3). Tiden for mus kønsceller til fremskridt fra stEM celler i sædkanalerne til spermatogonier, spermatocytter, spermatider og til sidst til modne sædceller i epididymis (dvs.. spermatogenesen) er cirka 49 dage. Mutation kan forekomme på forskellige faser af denne cyklus, og er ofte sammensat specifik. To vigtige funktioner, der er af særlig relevans for mutagenese i mandlige kønsceller ophør af DNA-syntese under tidlig meiose, og den gradvise tab af DNA-reparation kapacitet 6 i slutningen af post-meiose, to processer, der er nødvendige for induktion og fiksering af de fleste mutationer.
På grund af disse unikke egenskaber spermatogenesen, er der tre kritiske eksperimentelle variabler for afviklingen af TGR kimcellens mutationsanalyse: (1) testforbindelsen administration tid; (2) prøveudtagning tid; og (3) udvælgelse af kimcellens befolkningen til at samle ind til analyse (figur 3 og tabel 1). Administration tid er experimental variabel, der bestemmer, hvor lang målceller eksponeres for prøveforbindelserne. Længden af tid til administration kan også anvendes til at målrette eksponeringer til specifikke celletyper eller faser af spermatogenesen. For eksempel kunne en enkelt dag indgivelse anvendes til at bestemme virkningerne af en akut eksponering på en bestemt celletype. Ligeledes kan eksponeringen være fokuseret til en hel spermatogene fase, for eksempel ved at målrette kun meiotisk delende spermatocytter eller mitotisk dividere spermatogonier hjælp en 2 ugers administration tid og en passende tid prøveudtagning. Kroniske og sub-kronisk administration tider anvendes til at vurdere virkningerne af eksponering lang sigt at sikre tilstrækkelig farmakokinetiske fordeling af testforbindelsen, eller tillade tilstrækkelig ophobning af mutationer fra svage mutagener (for eksempel 28 dages administration tid anbefalet i OECD test retningslinje).
Sampling tid er den kritiske variabel til bestemmelse af, hvorfase af spermatogenesen målcellerne var på tidspunktet for eksponering. Den tid prøveudtagning dikterer, hvor meget tid, og derfor hvor meget yderligere langs spermatogene cyklus, celler passere efter eksponering. For eksempel for at undersøge effekter i stamcelle spermatogonier udtages en prøve> 49 dage er påkrævet, hvis indsamling fuldt modnet sæd, eller> 42 dage, hvis indsamling af umodne kønsceller fra sædkanalerne at sikre, at alle indsamlede celler har haft tid nok til at udvikle sig fra udsatte stamceller. Det er vigtigt at bemærke, at en sampling tid på mindst 70 dage ville være at foretrække at vise en sand stamcelle effekt at give tilstrækkelig tid til farmakokinetisk fordeling af giftstoffet, til eliminering af celler eksponeret på senere faser af spermatogenesen, og at redegøre for en periode med midlertidig sterilitet, der kan opstå ~ 6 uger efter udsættelse for stærkt mutagene forbindelser 22. Tilsvarende vil en sampling tid på 21 dage, at sæd colleCTED fra cauda epididymis ville har netop afsluttet meiose på den sidste dag af eksponering.
Kønsceller kan opsamles som modne sædceller fra cauda epididymis, eller som en blanding af forskellige spermatogene celletyper fra sædkanalerne. Modne sædceller forbliver i cauda til ~ 3 dage, hvilket gør det muligt at bestemme med relativ nøjagtighed celletype eller fase af spermatogenesen hvorfra sæd stammer for enhver given eksperimentelle design. Således analyse af cauda sædceller tillader meget målrettede undersøgelser af trinspecifik mutationelle effekter. På den anden side, cellesuspensioner indsamlet fra sædkanalerne indeholde en blanding af forskellige kim celletyper i forskellige faser, og dermed tilbyde dårligere opløsning af spermatogene fase, hvor mutationer oprindelse. Desuden cellesuspensioner inddrives fra sædkanalerne tendens til at indeholde en overrepræsentation af spermatider, efterfulgt af spermatocytter, og verå få spermatogonier og stamceller (disse andele er repræsenteret ved gradueret hvide søjler i figur 3). Desuden kan suspensioner fremstillet ud fra de sædkanalerne også indeholde forskellige somatiske celler. Således, fordi så mange celletyper er til stede, mutationelle effekter kan være påvirket af en række ikke-målceller. Men indsamling af prøver fra sædkanalerne tilbyder en økonomisk mulighed for samtidig screening af flere kim celletyper, og nem integration af kønsceller analyse i standard OECD test-protokol til somatisk mutation.
For at gentage, afhængigt af behovene i investigator, administration tid, prøveudtagning tid og det opsamlede cellepopulation kan justeres for at afhøre virkningerne af eksponering i forskellige celletyper og i forskellige faser af spermatogenesen. Ved omhyggeligt at udvælge disse variabler, kan man udvikle til målrettede mekanistiske undersøgelser, eller for mere generel regulering testing formål.
For at opnå færdighed i analysen, anbefaler vi brug af en akut oral administration af 100 mg / kg N-ethyl-N-nitrosourinstof (ENU), efterfulgt af en 70 prøveudtagningsdagen tid som positiv kontrol. Analyse af cauda sædceller således målrettet spermatogonstamceller stamceller (figur 3), som typisk udviser en 4-5 fold stigning i mutanthyppigheden (MF) i forhold til kontroller efter denne stærkt mutagene dosis ENU. Det skal bemærkes, at denne dosis er kendt for at inducere sterilitet 6 uger efter behandling, og dermed kan det ikke være en egnet dosis for kortere måletider kontrol. Denne dosis vil også producere en påviselig forøgelse i MF i de fleste somatiske væv 20. De repræsentative resultater, der præsenteres nedenfor, blev genereret efter en akut 70 eksponering regime med tre doser af ENU op til og inklusive 100 mg / kg.
Sammenlignet med traditionelle metoder, TGR kimcellens mutationsanalyse giver en hurtigere, mere økonomiske og mere følsomme midler kvantificere induceret in vivo kønscellemutationer. Ved at vurdere transgen MF direkte i sperm, i modsætning til afkom, antal dyr, der er tid og ressourcer, der kræves for at vurdere mutagenicitet kønscellerne af en enkelt forbindelse, reduceres betydeligt. Med hensyn til følsomhed, var vi i stand til at påvise en signifikant 2,6 gange stigning i spermatogonier stamcelle MF efter udsættelse for 25 mg / kg ENU ved hjælp af kun 5 dyr pr. I modsætning hertil den specifikke locus-analysen var i stand til at opdage enhver betydelig ændring i MF på samme dosis ved hjælp af> 3.000 mus i den udsatte gruppe og> 500.000 kontrolmus 28.
Ud over sin egnethed til både mekanistiske og regulatoriske undersøgelser, denne metode giver mulighed for sammenlignende undersøgelser mellem somatiske og kønsceller Mutatipå raterne. Nylige undersøgelser tyder på, at for nogle agenter kønscellemutationer kan fremkaldes ved lavere koncentration end nødvendigt for somatisk mutation. For eksempel, langvarig udsættelse for N-hydroxymethylacrylamide, en metabolit af maden kræftfremkaldende acrylamid 12, øger hyppigheden af dominerende dødelige kønscellemutationer i mus uden at påvirke mikrokernetesten frekvens i de røde blodlegemer, en traditionel måling af somatiske celler cytogenetiske skader 13. Derudover eksponering af mus for både mainstream og sidestrømsemissioner tobaksrøg forårsager forhøjede mutationsfrekvenser på tandemgentagelse DNA loci i sædceller ved doser, som ikke øger blod micronucleus frekvens 14. Disse resultater udfordrer den antagelse, at somatiske genotoksicitetstestning er altid beskyttende overfor mikrobelinien og styrke efterspørgslen efter en mere effektiv og omkostningseffektive middel til at kvantificere kimcellens mutationshyppighed. Beviserne for præferentielle kimcellemutagener er dog stadig svag, Hovedsagelig på grund af mangel på tilgængelige data til at sammenligne mutationsrater i somatiske og kønscellevirkninger væv. TGR mutationsanalyse tillader parallel afprøvning og sammenligning af inducerede mutationsrater i flere væv, der anvender samme transgen. Således sammenlignende mutation test med TGR analysen vil hjælpe med at udfylde datahuller omkring muligheden for at præferentielle kønscelleeffekter.
Samtidig vurdering af somatiske og kønsceller mutation til lovmæssige forsøg vil også forbedre effektiviteten ved at reducere antallet af dyr, der kræves. OECD guideline for somatisk mutation anbefaler en 28 dages administration tid, efterfulgt af en tre dages prøveudtagning (28 + 3). Analyse af cauda sædceller kan give dårlig følsomhed på dette tidspunkt, da den er rettet mod celler mest udsat under spermatocyte og sædcelleantal faser af spermatogenesen (Figur 3). Celler i disse faser ikke syntetisere DNA og gradvist mister deres evne til DNA-reparation 6 </ Sup>. Desuden vil prøveudtagning cauda sædceller på dette tidspunkt ikke at påvise mutationer, der forekommer i spermatogonia og stamceller. Således til integration i design 28 + 3, OECD guideline anbefaler indsamling af kønsceller fra sædkanalerne. Denne blandede population indeholder celler afledt af DNA-syntese og reparation dygtige celletyper, herunder stamceller og udsættes tværs størstedelen af sædcelledannende faser. Men på grund af den blandede natur af disse celler, sædkanaler celleanalyse ikke giver fase-specifikke oplysninger. Desuden er der bekymring for, at tilstedeværelsen af ikke-target-celler kan påvirke den observerede MF (f.eks falsk positive kimcellemutagen opkald på grund af forurening af muterede somatiske celler, eller fortynding af en muteret kim celle signal fra DNA-reparation-manglende kønsceller) . I øjeblikket er der ikke tilstrækkelige data til at konkludere, om resultaterne fra sædkanalerne celler ved 28 + 3 tilbyde den samme følsomhed og specificitet as cauda sperm på senere tidspunkter. Vores laboratorium er i øjeblikket sammenligne inducerede MFIer i sædkanalerne celler og cauda sæd opsamlet efter forskellige prøveudtagning for at løse dette punkt. Vi bemærker, at OECD guideline antyder en alternativ prøveudtagning tid på 28 dage for langsomt delende væv, såsom leveren, der kan også være egnet til kønsceller analyse. Ikke desto mindre er de foreliggende data er stadig utilstrækkelig, og vi er i øjeblikket ude af stand til at anbefale en enkelt eksperimentelle design til samtidig analyse af somatiske celler og kimceller hjælp af TGR mutationsanalyse til lovmæssige forsøg.
Et kendetegn ved dette assay, der bør bemærkes, er, at mutationsbegivenheder vurderes på et ikke-murint transgen. Men der er rigeligt med beviser for, at den transgen reagerer på miljømæssige mutagener på en lignende måde til endogene gener 20. Hertil kommer, fordi de præcise oprindelse af uafhængige mutationsbegivenheder er vanskelige atløse, er resultaterne generelt rapporteret som en mutant frekvens (i modsætning til en mutation frekvens). Den aktuelle Mutationsfrekvensen kan løses, hvis resultater er korrigeret for klonal ekspansion (dvs.. Deling og formering af en enkelt muteret celle, der kan bidrage til den observerede hyppighed af transgene mutanter) ved DNA-sekventering. Sekventering af de mutante transgener kan udføres for at karakterisere lacZ mutationer og identificere mutanter, der kan være afledt fra klonale ekspansion arrangementer, selv om dette gør det betydeligt tiden og omkostningerne for analysen. I tillæg til lacZ-genet, theλgt10 transgene vektor rummer en alternativ temperaturafhængige mutation reportergen: en variant af λ cll-genet, som er kortere (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) og lettere at sekventere 29. Sekventering tillader også analyse af den inducerede mutation spektrum, der giver indsigt i mutatioudg mekanisme af den pågældende forbindelse. Et ekstremt eksempel på klonal ekspansion er forekomsten af en "jackpot" mutation (dvs.., Transgene mutationer på et meget tidligt stadie af et organ udvikling, der bidrager til en dramatisk forhøjet MF, undertiden flere hundrede til flere tusinde gange større end baggrunden). Dyr eller væv med en "jackpot" mutation bør fjernes fra analysen.
Assayet, som vi har beskrevet, er bredt anvendelig til andre TGR modeller såsom BigBlue mus og rotter, og lacZ-plasmid mus, som alle harbor lignende mutation reporter vektorerne (gennemgået i 20). Langt størstedelen af kønscellevirkninger undersøgelser udført til dato, der anvender lignende metoder har fokuseret næsten udelukkende på velbeskrevne mutagener såsom ENU og stråling (revideret i 30). Det forventes, at med den nylige løsladelse af OECD test guideline for TGR analysen, vil denne analyse væremere populært for kemisk screening og lovgivningsmæssige evaluering. Inkorporering af TGR kimcellens mutationsanalyse i et lovmæssige forsøg batteri vil udfylde det eksisterende hul ved at tillade en effektiv vurdering af mutation induktion i kønsceller 11. Desuden kan dette assay anvendes til at måle MF i stort set alle væv, hvilket giver et egnet middel til at sammenligne de relative følsomheder af somatiske celler og kimceller til induktion af mutationer af miljøskadelige stoffer ved identiske genetiske mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MutaMouse | Covance | – | |
E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |