De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Germline में छिटपुट डीएनए उत्परिवर्तन कम प्रजनन सफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और, विरासत में मिला है, तो वंश 1-3 में कैंसर के लिए आनुवांशिक बीमारी या बढ़ गड़बड़ी हो सकती है. पर्याप्त सबूत डी नोवो म्यूटेशन का एक बड़ा हिस्सा पैतृक germline 4 से विरासत में मिला रहे हैं कि यह दर्शाता है, और संतानों में म्यूटेशन की संख्या सकारात्मक गर्भाधान 5 के समय पैतृक उम्र के साथ जोड़ा जाता है. पुरुष म्यूटेशन की उच्च अनुपात लिंगों के बीच gametogenesis दौरान उम्र में अंतर का एक परिणाम माना जा रहा है, महिला germline 2 में oogenic कोशिका विभाजन की संख्या के साथ तुलना में spermatogenic कोशिका विभाजन की बड़ी संख्या है, और डीएनए में एक प्रगतिशील गिरावट पुरुषों में उम्र के साथ दक्षता में सुधार. इन सभी कारकों के पुरुष germline 6 में प्रतिकृति त्रुटियों की एक वृद्धि की संभावना के लिए योगदान करते हैं. हालांकि, पैतृक जोखिम के प्रभाव वातावरण कोनए सिरे से परिवर्तन की आवृत्ति पर nmental कारकों अनिश्चित बनी हुई है. फिर भी, पर्यावरण एजेंटों की एक बड़ी संख्या कृन्तकों 7 में जर्म सेल म्यूटेशन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, और इन एजेंटों में से कुछ भी मानव germline 8 को प्रभावित कर सकते हैं कि बढ़ते सबूत नहीं है. इन चिंताओं के बावजूद, रसायन नियमित नियामक उद्देश्यों के लिए दैहिक कोशिकाओं में उत्परिवर्तन के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए जांच की जाती है और यह आम तौर पर दैहिक परीक्षण germline की रक्षा करने के लिए पर्याप्त हैं कि माना जाता है. इसलिए, रसायन केवल शायद ही कभी रोगाणु सेल म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.
एक कारण यह रोगाणु सेल mutagenicity परीक्षण काफी हद तक विनियामक निर्णय लेने की प्रक्रिया से हटा दिया गया है व्यावहारिक तरीकों की कमी है. ऐसे प्रमुख 9 घातक और विशिष्ट लोकस 10 परीक्षण के रूप में पारंपरिक कृंतक आधारित विधियों, भ्रूण या की संतानों में उत्परिवर्ती phenotypes स्कोरिंग द्वारा रोगाणु सेल उत्परिवर्तन दर का अनुमानउजागर माता पिता. ये assays सांख्यिकीय सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए जानवरों, समय और संसाधनों की एक बहुत बड़ी संख्या के उपयोग की आवश्यकता है.
रोगाणु सेल उत्परिवर्तन बढ़ाता के लिए कई आधुनिक तरीकों हाल ही में उभरा है हालांकि, कई उनकी व्यावहारिकता, दक्षता, और जैविक प्रासंगिकता के संदर्भ में कमियों पीड़ित हैं. उदाहरण के लिए, विस्तारित सरल मिलकर दोहराएँ (ESTR) loci में लंबाई म्यूटेशन दोहराने एक अणु पीसीआर दृष्टिकोण 15 का उपयोग करते हुए पुरुष रोगाणु कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, इस पद्धति का निष्पादन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कठिन हो सकता है, और बिंदु उत्परिवर्तन के विपरीत, अत्यधिक अस्थिर ESTR loci के दोहराने की लंबाई में परिवर्तन के जैविक और स्वास्थ्य महत्व स्पष्ट नहीं 16 में रहते हैं. पैतृक म्यूटेशन 4,17 की समस्या के लिए आवेदन किया है जब आधुनिक पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों जैविक रूप से सार्थक डेटा का खजाना प्रदान कर सकते हैं, लेकिन उच्च लागत, उच्च त्रुटि दर, जुड़े सत्यापन आवश्यकम्यूटेशन की पुष्टि, और जैव सूचना विज्ञान की चुनौतियों को अभी भी एक नियामक परीक्षण क्षमता 18 में इस विकल्प की दिनचर्या आवेदन सीमित करने के लिए.
इस के साथ साथ, हम ट्रांसजेनिक पुरुष चूहों के जर्म कोशिकाओं में सीधे प्रेरित म्यूटेशन बढ़ाता के लिए एक व्यावहारिक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल गुणसूत्र 3 19 (चित्रा 1) के दोनों प्रतियों में एकीकृत एक Escherichia कोलाई lacZ रिपोर्टर जीन युक्त पुनः संयोजक λgt10 फेज वेक्टर के कई concatenated प्रतियां है जो ट्रांसजेनिक MutaMouse मॉडल, के लिए वर्णित है.
इस प्रोटोकॉल भी एक ही सिद्धांत (BigBlue माउस और चूहे, या lacZ प्लाज्मिड माउस, आदि.) या थोड़ा अलग रिपोर्टर जीन (GPT डेल्टा माउस और चूहे पर आधारित अन्य ट्रांसजेनिक कृंतक (TGR) मॉडल के लिए प्रासंगिक है, TGR मॉडल लैम्बर्ट एट में समीक्षा अल. 20). इस पद्धति का एक हाल ही में जारी में वर्णित TGR उत्परिवर्तन परख पर आधारित हैऔर ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश 21 संशोधित और हम क्योंकि शुक्राणुजनन के अद्वितीय विशेषताओं के पुरुष germline में म्यूटेशन के आकलन को समायोजित करने के लिए आवश्यक विशेष विचार पर प्रकाश डालेंगे. संक्षेप में, परख पूर्व mutational घावों स्थिर म्यूटेशन में तय कर रहे हैं, जहां एक नमूने समय के बाद mutagenic पदार्थ को ट्रांसजेनिक पुरुष चूहे, उजागर करना शामिल है. चुना नमूना समय, चूहों euthanized हैं और रोगाणु कोशिकाओं पुच्छ अधिवृषण या बीजदार नलिकाओं या तो से एकत्र कर रहे हैं. नीचे चर्चा की, शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में mutagenic प्रभाव जोखिम और नमूना संग्रह के बीच समय का चयन करके निर्धारित किया जा सकता है. सेल प्रति λ फेज जीनोम की कई प्रतियां शामिल ट्रांसजेनिक सम्मिलित, जर्म सेल जीनोमिक डीएनए से अलग और फिर एक ई संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि संक्रामक λ फेज कण पैदा खाली λ फेज capsids में पैक कर रहे हैं कोलाई मेजबान. संक्रमित बैक्टीरिया selec पर हो रहे हैंजंगली प्रकार lacZ शरण कोशिकाओं से lacZ की एक उत्परिवर्तित प्रतिलिपि के साथ एक वेक्टर युक्त कोशिकाओं भेद कर सकते हैं कि सक्रिय मीडिया. पुरुष germline पर जोखिम की mutagenic प्रभाव (लैम्बर्ट एट अल. 20 में समीक्षा चित्रा 2,) नियंत्रण और इलाज चूहों के बीच उत्परिवर्ती transgenes की आवृत्ति की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है. रोगाणु कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता जानवरों की संख्या कम है, जबकि पारंपरिक तरीकों पर इस परख बेहतर संवेदनशीलता देने, एक माउस से assayed किया जा सकता है. कोई विशेष उपकरण या प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और, क्योंकि इस परख सबसे आधुनिक विष विज्ञान / आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में जर्म सेल उत्परिवर्तन के परीक्षण के लिए एक व्यावहारिक और कुशल विकल्प प्रदान करता है.
TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख के प्रभावी आवेदन के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता spermatogenic चक्र (चित्रा 3) की समझ है. अनुसूचित जनजाति से प्रगति करने के लिए माउस रोगाणु कोशिकाओं के लिए समयअंत में spermatogonia, spermatocytes, spermatids, और बीजदार नलिकाओं में उन्हें कोशिकाओं (यानी. शुक्राणुजनन) लगभग 49 दिनों का है अधिवृषण में शुक्राणु परिपक्व करने के लिए. म्यूटेशन इस चक्र के विभिन्न चरणों में होते हैं और अक्सर यौगिक विशिष्ट है सकते हैं. पुरुष रोगाणु कोशिकाओं में mutagenesis के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं कि दो प्रमुख विशेषताएं जल्दी अर्धसूत्रीविभाजन दौरान डीएनए संश्लेषण की समाप्ति, और देर के बाद अर्धसूत्रीविभाजन दौरान डीएनए की मरम्मत की क्षमता 6 की प्रगतिशील हानि की प्रेरण और निर्धारण के लिए आवश्यक हैं कि दो प्रक्रियाओं हैं सबसे म्यूटेशन.
क्योंकि शुक्राणुजनन की इन अनूठी विशेषताओं की, TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख के संचालन के लिए तीन महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चर रहे हैं: (1) परीक्षण परिसर प्रशासन समय; (2) नमूने समय; और (3) रोगाणु सेल की आबादी का चयन विश्लेषण (चित्रा 3 और 1 टेबल) के लिए इकट्ठा करने के लिए. प्रशासन समय experime हैलंबे समय से लक्ष्य कोशिकाओं परीक्षण यौगिकों को उजागर कर रहे हैं कि कैसे निर्धारित करता है कि ntal चर. प्रशासन समय की लंबाई भी विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या शुक्राणुजनन के चरणों के जोखिम को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक ही दिन प्रशासन एक विशेष सेल प्रकार पर एक तीव्र जोखिम के प्रभावों का निर्धारण किया जा सकता है. इसी तरह, जोखिम केवल meiotically विभाजित spermatocytes को लक्षित, या mitotically एक 2 सप्ताह प्रशासन समय और एक उपयुक्त नमूने समय का उपयोग spermatogonia विभाजित करके उदाहरण के लिए, एक पूरे spermatogenic चरण के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. पुरानी और उप जीर्ण प्रशासन बार परीक्षण परिसर के पर्याप्त फार्माकोकाइनेटिक वितरण सुनिश्चित करने, या 28 दिन प्रशासन समय ओईसीडी परीक्षण में सिफारिश उदाहरण के लिए कमजोर उत्परिवर्तजन से म्यूटेशन की पर्याप्त संचय (अनुमति देने के लिए, लंबी अवधि के जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है दिशानिर्देश).
नमूने समय का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण चर रहा है, जिस परशुक्राणुजनन के चरण लक्ष्य कोशिकाओं जोखिम के समय में थे. नमूने समय कितना समय पैदा करती है, और इसलिए कितना आगे spermatogenic चक्र के साथ, कोशिकाओं प्रदर्शन के बाद के माध्यम से गुजरती हैं. उदाहरण के लिए, स्टेम सेल spermatogonia में प्रभाव की जांच के लिए एक नमूना समय> 49 दिन> 42 दिनों के लिए पूरी तरह से परिपक्व शुक्राणु एकत्रित यदि आवश्यक है, या सब एकत्र कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय दिया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, बीजदार नलिकाओं से अपरिपक्व रोगाणु कोशिकाओं को इकट्ठा अगर उजागर से विकसित कोशिकाओं उपजा है. यह कम से कम 70 दिनों का एक नमूना समय शुक्राणुजनन के बाद के चरणों में उजागर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए, विषैला की फार्माकोकाइनेटिक वितरण के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध कराने के लिए एक सच्चे स्टेम सेल प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए बेहतर होगा, और के लिए खाते में है कि नोट करना महत्वपूर्ण है अत्यधिक mutagenic यौगिकों 22 को प्रदर्शन के बाद ~ 6 सप्ताह हो सकता है कि अस्थायी बाँझपन की अवधि. इसी प्रकार, 21 दिनों के नमूने समय है कि शुक्राणु Colle सुनिश्चित करेगीपुच्छ अधिवृषण से cted सिर्फ जोखिम के अंतिम दिन पर अर्धसूत्रीविभाजन पूरा कर लिया जाएगा.
जर्म कोशिकाओं पुच्छ अधिवृषण से, या बीजदार नलिकाओं से विभिन्न spermatogenic प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण के रूप में परिपक्व शुक्राणु के रूप में एकत्र किया जा सकता है. परिपक्व शुक्राणु सापेक्ष सटीकता शुक्राणु किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए उत्पन्न जिसमें से शुक्राणुजनन की सेल प्रकार या चरण के साथ निर्धारित करने के लिए यह संभव बनाने, ~ 3 दिन के लिए पुच्छ में रहते हैं. इस प्रकार, पुच्छ शुक्राणु परमिट का विश्लेषण अत्यधिक चरण विशिष्ट mutational प्रभाव की जांच को निशाना बनाया. दूसरी ओर, बीजदार नलिकाओं से एकत्र सेल निलंबन विकास के विभिन्न चरणों में विभिन्न रोगाणु सेल प्रकार के एक मिश्रण होते हैं, और इस तरह उत्परिवर्तन उत्पन्न जिसमें spermatogenic चरण के गरीब संकल्प प्रदान करते हैं. इसके अलावा, बीजदार नलिकाओं से बरामद सेल निलंबन एक spermatocytes द्वारा पीछा spermatids का अधिक प्रतिनिधित्व,, और देखें शामिल करने के लिए करते हैंवाई कुछ spermatogonia और स्टेम सेल (इन अनुपात चित्रा 3 में स्नातक की उपाधि सफेद सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं). इसके अलावा, बीजदार नलिकाओं से तैयार निलंबन भी विभिन्न दैहिक कोशिकाओं को नियंत्रित कर सकते. इतने सारे कोशिकाओं प्रकार मौजूद हैं, क्योंकि इस प्रकार, mutational प्रभाव गैर लक्ष्य कोशिकाओं की एक किस्म से प्रभावित किया जा सकता है. हालांकि, बीजदार नलिकाओं से नमूने एकत्र करने के लिए एक साथ कई रोगाणु सेल प्रकार, और दैहिक उत्परिवर्तन के लिए मानक ओईसीडी परीक्षण प्रोटोकॉल में जर्म सेल विश्लेषण के आसान एकीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक किफायती विकल्प प्रदान करता है.
अन्वेषक, प्रशासन समय, नमूने समय और एकत्र सेल की आबादी की जरूरतों पर निर्भर करता है, दोहराना करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में और शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में जोखिम के प्रभावों से पूछताछ करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. ध्यान से इन चर का चयन करके, प्रयोगों, या अधिक सामान्यीकृत विनियामक परीक्षण के लिए लक्षित यंत्रवत अध्ययनों के लिए तैयार किया जा सकता हैप्रयोजनों आईएनजी.
परख में प्रवीणता प्राप्त करने के लिए, हम एक 70 दिन नमूने समय के रूप में सकारात्मक नियंत्रण द्वारा पीछा / किलो एन एथिल-N-nitrosourea 100 मिलीग्राम (ENU) की एक तीव्र मौखिक प्रशासन के उपयोग, सलाह देते हैं. पुच्छ शुक्राणु का विश्लेषण इस प्रकार आम तौर पर ENU के इस अत्यधिक mutagenic खुराक के बाद नियंत्रण खत्म उत्परिवर्ती आवृत्ति (एमएफ) में 4-5 गुना वृद्धि का प्रदर्शन जो spermatogonial स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 3), लक्ष्य. यह इस प्रकार यह छोटा नमूना समय के लिए एक उपयुक्त नियंत्रण खुराक नहीं हो सकता है, इस खुराक बाँझपन 6 सप्ताह जोखिम पोस्ट प्रेरित करने के लिए जाना जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस खुराक भी सबसे दैहिक ऊतकों 20 में म्यूचुअल फंड में एक detectable वृद्धि का उत्पादन होगा. नीचे प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम के लिए और 100 मिलीग्राम / किग्रा सहित ENU की तीन खुराक का उपयोग करते हुए एक तीव्र +70 जोखिम आहार निम्नलिखित उत्पन्न किया गया.
पारंपरिक तरीकों की तुलना में, TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख विवो रोगाणु सेल उत्परिवर्तन में प्रेरित बढ़ाता का एक तेज, और अधिक किफायती, और अधिक संवेदनशील साधन प्रदान करता है. वंश, पशुओं की संख्या के लिए विरोध के रूप में, शुक्राणु में सीधे transgene म्यूचुअल फंड का आकलन करके, समय और किसी एक यौगिक के germline mutagenicity का आकलन करने के लिए आवश्यक संसाधन काफी कम है. संवेदनशीलता के मामले में, हम खुराक समूह में केवल 5 पशुओं का उपयोग कर 25 मिलीग्राम / किग्रा ENU के संपर्क में निम्नलिखित spermatogonia स्टेम सेल म्यूचुअल फंड में एक महत्वपूर्ण 2.6 गुना वृद्धि का पता लगाने में सक्षम थे. इसके विपरीत, विशिष्ट ठिकाना परख का उपयोग कर इस एक ही खुराक में म्यूचुअल फंड में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन> उजागर समूह में 3,000 चूहों और> 5,00,000 नियंत्रण चूहों 28 का पता लगाने में असमर्थ था.
दोनों यंत्रवत और विनियामक जांच के लिए इसकी उपयुक्तता के अलावा, इस विधि दैहिक और रोगाणु लाइन mutati के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान करता हैदरों पर. हाल ही में सबूत दैहिक उत्परिवर्तन के लिए आवश्यकता से कुछ एजेंटों के लिए रोगाणु सेल उत्परिवर्तन कम एकाग्रता में प्रेरित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एन hydroxymethylacrylamide के लिए लंबे समय तक निवेश, खाद्य कैसरजन acrylamide 12 की एक metabolite, लाल रक्त कोशिकाओं में micronucleus आवृत्ति, दैहिक सेल सितोगेनिक क नुकसान 13 की एक पारंपरिक उपाय को प्रभावित किए बिना चूहों में प्रमुख घातक रोगाणु सेल उत्परिवर्तन की आवृत्ति बढ़ जाती है. साथ ही, रक्त micronucleus आवृत्ति 14 में वृद्धि नहीं करते कि खुराक में शुक्राणु में मिलकर दोहराएँ डीएनए loci में दोनों मुख्यधारा और sidestream तंबाकू के धुएं कारणों बुलंद उत्परिवर्तन आवृत्तियों के लिए चूहों का जोखिम. इन निष्कर्षों दैहिक genotoxicity परीक्षण हमेशा germline की रक्षात्मक है कि इस धारणा को चुनौती, और रोगाणु सेल उत्परिवर्तन आवृत्ति यों के लिए एक अधिक कुशल और लागत प्रभावी साधन के लिए मांग को सुदृढ़. हालांकि, तरजीही रोगाणु सेल उत्परिवर्तजन के लिए सबूत अभी भी कमजोर हैकाफी हद तक वजह से दैहिक और रोगाणु सेल के ऊतकों में उत्परिवर्तन दरों की तुलना के लिए उपलब्ध डेटा की कमी की. TGR उत्परिवर्तन परख समानांतर परीक्षण और उसी transgene का उपयोग कर कई ऊतकों में प्रेरित उत्परिवर्तन दरों की तुलना की अनुमति देता है. इस प्रकार, तुलनात्मक उत्परिवर्तन तरजीही रोगाणु सेल प्रभाव की संभावना आसपास के डेटा अंतराल को भरने में मदद मिलेगी TGR परख का उपयोग परीक्षण.
नियामक के परीक्षण के लिए दैहिक और रोगाणु सेल उत्परिवर्तन के एक साथ आकलन भी आवश्यक जानवरों की संख्या कम दक्षता में सुधार होगा. दैहिक उत्परिवर्तन के लिए ओईसीडी दिशानिर्देश एक तीन दिन नमूने समय (+3 28) के बाद 28 दिन प्रशासन समय, की सिफारिश की. यह शुक्राणुजनन की spermatocyte और spermatid चरणों (चित्रा 3) के दौरान ज्यादातर उजागर कोशिकाओं को लक्षित करता है के बाद से पुच्छ शुक्राणु का विश्लेषण, इस समय बिंदु पर गरीब संवेदनशीलता प्रदान कर सकता है. इन चरणों में कोशिकाओं के डीएनए synthesize और उत्तरोत्तर डीएनए की मरम्मत 6 के लिए अपनी क्षमता खो नहीं है </ Sup>. इसके अलावा, इस समय बिंदु पर नमूना पुच्छ शुक्राणु spermatogonia और स्टेम कोशिकाओं में होने वाली म्यूटेशन का पता लगाने में विफल हो जाएगा. इस प्रकार, 28 + 3 डिजाइन में एकीकरण के लिए, ओईसीडी दिशानिर्देश बीजदार नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को इकट्ठा करने की सिफारिश की. इस मिश्रित आबादी डीएनए संश्लेषण और स्टेम सेल सहित मरम्मत प्रवीण प्रकार की कोशिकाओं से व्युत्पन्न सेल शामिल हैं, और spermatogenic चरणों का बहुमत भर में सामने आ रहे हैं. हालांकि, इन कोशिकाओं के मिश्रित प्रकृति के कारण, बीजदार tubules सेल विश्लेषण चरण में विशेष जानकारी प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, गैर लक्ष्य कोशिकाओं की उपस्थिति में मनाया शेयरों में प्रभावित कर सकते हैं कि चिंता का विषय है (उदाहरण के कारण डीएनए की मरम्मत की कमी जर्म कोशिकाओं से एक उत्परिवर्तित रोगाणु सेल संकेत के उत्परिवर्तित दैहिक कोशिकाओं के संक्रमण, या कमजोर पड़ने के लिए झूठी सकारात्मक रोगाणु सेल उत्परिवर्तजन कॉल) . वर्तमान में समाप्त करने के लिए पर्याप्त डाटा नहीं है कि क्या 28 + 3 प्रस्ताव एक ही संवेदनशीलता और विशिष्टता एक पर बीजदार नलिकाओं कोशिकाओं से परिणामबाद में समय बिंदुओं पर है पुच्छ शुक्राणु. हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में इस बात का पता करने के लिए विभिन्न नमूने समय के बाद एकत्र बीजदार नलिकाओं कोशिकाओं और पुच्छ शुक्राणु में प्रेरित किया गया म्यूचुअल फंड की तुलना है. हम ओईसीडी दिशानिर्देश ऐसे भी रोगाणु सेल विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है कि जिगर के रूप में धीरे धीरे विभाजित ऊतकों के लिए 28 दिनों का एक वैकल्पिक नमूने समय से पता चलता है कि ध्यान दें. फिर भी, उपलब्ध आंकड़ों अभी भी अपर्याप्त है और हम दैहिक कोशिकाओं और विनियामक परीक्षण के लिए TGR उत्परिवर्तन परख का उपयोग जर्म कोशिकाओं का एक साथ विश्लेषण के लिए एक एकल प्रायोगिक डिजाइन की सिफारिश करने में असमर्थ हैं.
ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस परख की एक विशेषता mutational घटनाओं में एक गैर murine transgene पर मूल्यांकन कर रहे हैं. हालांकि, transgene अंतर्जात जीन 20 के लिए एक समान फैशन में पर्यावरण उत्परिवर्तजन का जवाब सुझाव है कि पर्याप्त सबूत नहीं है. इसके अलावा, क्योंकि स्वतंत्र mutational घटनाओं की सटीक मूल करने के लिए मुश्किल हो जाता हैहल, परिणाम आम तौर पर (एक उत्परिवर्तन आवृत्ति के विपरीत) एक उत्परिवर्ती आवृत्ति के रूप में सूचित कर रहे हैं. परिणाम डीएनए अनुक्रमण द्वारा (transgene म्यूटेंट का मनाया आवृत्ति में योगदान कर सकते हैं कि एक एकल उत्परिवर्तित सेल यानी. विभाजन और गुणा) क्लोनल विस्तार के लिए सही कर रहे हैं अगर वास्तविक उत्परिवर्तन आवृत्ति हल किया जा सकता है. इस समय और विश्लेषण की लागत को काफी कहते हैं, हालांकि उत्परिवर्ती transgenes की अनुक्रमण, lacZ म्यूटेशन की विशेषताएँ, और क्लोनल विस्तार घटनाओं से प्राप्त किया जा सकता है कि म्यूटेंट की पहचान करने के लिए किया जा सकता है. छोटा (294 3021 बी.पी. lacZ बनाम बीपी, चित्रा 1) और 29 दृश्य के लिए आसान है जो λ सीआईआई जीन, का एक संस्करण: lacZ जीन के अलावा, theλgt10 ट्रांसजेनिक वेक्टर एक विकल्प के तापमान पर निर्भर उत्परिवर्तन-रिपोर्टर जीन बंदरगाहों. अनुक्रमण भी mutatio में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, प्रेरित उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम का विश्लेषण परमिटसवाल में परिसर के अंतिम तंत्र. क्लोनल विस्तार का एक चरम उदाहरण एक "खजाना" उत्परिवर्तन की घटना है (यानी., Transgene एक नाटकीय रूप से ऊंचा म्यूचुअल फंड के लिए योगदान है कि एक अंग के विकास का एक बहुत ही प्रारंभिक चरण में म्यूटेशन, कभी कभी सैकड़ों पृष्ठभूमि से अधिक समय के हजारों करने के लिए). एक "खजाना" उत्परिवर्तन के साथ जानवरों या ऊतकों विश्लेषण से हटा दिया जाना चाहिए.
हम वर्णन किया है कि परख ऐसी (20 में समीक्षा) समान उत्परिवर्तन संवाददाता वैक्टर बंदरगाह जो सभी के BigBlue माउस और चूहे, और lacZ प्लाज्मिड माउस के रूप में अन्य TGR मॉडल के लिए मोटे तौर पर लागू है. इसी तरह के तरीकों को रोजगार उस तारीख को आयोजित रोगाणु सेल के अध्ययन के विशाल बहुमत ऐसे ENU और (30 में समीक्षा) विकिरण के रूप में लगभग विशेष रूप से पर अच्छी तरह से विशेषता उत्परिवर्तजन ध्यान केंद्रित किया है. यह TGR परख के लिए ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश की हाल ही में रिलीज के साथ, इस परख हो जाएगा कि उम्मीद हैरासायनिक स्क्रीनिंग और नियामक मूल्यांकन के लिए तेजी से लोकप्रिय. एक विनियामक परीक्षण बैटरी में TGR रोगाणु सेल उत्परिवर्तन परख का निगमन रोगाणु कोशिकाओं 11 में उत्परिवर्तन प्रेरण के कुशल मूल्यांकन की अनुमति से मौजूदा खाई को भरने जाएगा. इसके अलावा, इस परख समान आनुवंशिक समापन पर पर्यावरण एजेंटों द्वारा म्यूटेशन की प्रेरण के लिए दैहिक कोशिकाओं और रोगाणु कोशिकाओं के रिश्तेदार संवेदनशीलता की तुलना के लिए एक उपयुक्त साधन उपलब्ध कराने, वास्तव में किसी भी ऊतक में म्यूचुअल फंड को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MutaMouse | Covance | – | |
E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |