De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.
De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic λgt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.
Sporadiska DNA mutationer i könsceller kan leda till minskad reproduktionsframgång och, om ärftlig, kan orsaka genetisk sjukdom eller förhöjd predisposition för cancer hos avkomman 1-3. Betydande bevis visar att en stor andel av de novo mutationer ärvs från faderskönsceller 4, och att antalet mutationer hos avkomman är positivt korrelerad med faderlig ålder vid tidpunkten för befruktningen 5. Den högre andelen manliga mutationer tros vara ett resultat av åldersskillnaden under gametogenes mellan könen, det större antalet spermatogenescykler celldelningar jämfört med antalet oogenic celldelningar i den kvinnliga könsceller 2, och en progressiv minskning av DNA reparera effektiviteten med åldern hos män. Alla dessa faktorer bidrar till en ökad sannolikhet för replikering fel i den manliga könsceller 6. Men för att effekterna av faderns exponering Environmental faktorer på hur ofta de novo mutationer fortfarande osäker. Ändå är många miljöfarliga ämnen kända för att inducera könscells mutationer i gnagare 7, och det finns fler bevis för att en del av dessa medel kan också påverka människans könsceller 8. Trots dessa farhågor är kemikalier rutinmässigt testas för sin förmåga att framkalla mutationer i kroppsceller i regleringssyfte och det är allmänt antas att somatiska tester är tillräckliga för att skydda könsceller. Därför är kemikalier endast sällan utvärderas för sin förmåga att inducera könscells mutationer.
En anledning könscellsmutagena tester har till stor del saknas i tillsyns beslutsprocessen är en brist på praktiska metoder. Traditionella gnagare baserade metoder, som till exempel de dominerande dödliga 9 och specifika locus 10 tester, uppskatta könsceller mutationshastigheter genom poängsättning muterade fenotyper i embryon eller avkommaexponerade föräldrar. Dessa analyser kräver användning av ett mycket stort antal djur, tid och resurser för att förvärva statistmeningsfulla resultat.
Även om flera moderna metoder för kvantifiering av könsceller mutation har nyligen dykt upp, många lider brister när det gäller deras genomförbarhet, effektivitet, och biologisk relevans. Exempelvis upprepa längd mutationer vid expanderad enkel tandemupprepning (ESTR) loci kan kvantifieras i manliga könsceller med användning av en enda molekyl PCR strategi 15. Däremot kan utförandet av denna metod vara tekniskt utmanande och mödosam, och till skillnad från punktmutationer, den biologiska och hälsomässiga betydelse för förändringar i upprepningslängden av den mycket instabila ESTR loci fortfarande oklara 16. Moderna hela genomet sekvenseringsteknologier kan ge en mängd biologiskt meningsfulla uppgifter när de appliceras på problemet med ärftliga mutationer 4,17, men den höga kostnaden, hög felfrekvens, tillhörande validering krävsatt bekräfta mutationer, och bioinformatiska utmaningar fortfarande begränsa rutinmässig tillämpning av denna möjlighet i ett lagstadgade tester kapacitet 18.
Häri beskriver vi en praktisk metod för att kvantifiera inducerade mutationer direkt i könscellerna hos transgena möss av hankön. Detta protokoll beskrivs för den transgena MutaMouse modell, som har multipla sammankedjade kopior av en rekombinant λgt10 fagvektor innehållande en Escherichia coli-lacZ-rapportörgenen integrerad i båda kopiorna av kromosom 3 19 (fig 1).
Detta protokoll är också relevant för andra transgena gnagare (TGR) modeller baserade på samma principer (BigBlue mus och råtta, eller lacZ plasmid mus, osv.) Eller något olika reportergener (gpt delta mus och råtta, TGR-modeller omdömet i Lambert et al. 20). Denna metod är baserad på TGR mutationsanalys som beskrivs i en nyligen släpptoch reviderade OECD-testriktlinje 21 och vi vidareutveckla de särskilda överväganden som krävs för att rymma utvärdering av mutationer i den manliga könsceller på grund av de unika egenskaperna hos spermatogenes. I korthet innebär analysen utsätta transgena hanmöss till en mutagen substans, följt av en provtagningstid där pre-mutations lesioner är fästade i stabila mutationer. Vid den valda samplingstiden, möss avlivas och könsceller samlas antingen från cauda epididymis eller sädeskanalerna. Som diskuteras nedan, kan mutagena effekter vid olika faser av spermatogenesen bestämmas genom val av tid mellan exponering och provtagning. Transgena skär, som omfattar flera kopior av λ faggenom per cell, är isolerade från könsceller iskt DNA och packas in i tomma λ fag kapsider skapar smitt λ fagpartiklar som sedan används för att infektera ett E. coli-värd. De infekterade bakterierna odlas på selectiva medier som kan skilja celler som innehåller en vektor med en muterad kopia av lacZ från celler som vildtyp lacZ. Den mutagena effekten vid exponering på den manliga könsceller bestäms genom att jämföra frekvensen av muterade transgener mellan kontroll och behandlade möss (Figur 2, granskas i Lambert et al. 20). Ett stort antal könsceller kan analyseras från en enda mus, vilket ger denna analys överlägsen känslighet jämfört med traditionella metoder, samtidigt som man minskar det antal djur som behövs. Och eftersom ingen specialiserad utrustning eller utbildning krävs, ger denna analys ett praktiskt och effektivt alternativ för könsceller mutation testning i de flesta moderna toxikologi / molekylärbiologiska laboratorier.
En viktig förutsättning för en effektiv tillämpning av TGR könsceller mutation analys är en förståelse för den spermatogenescykler cykeln (Figur 3). Tiden för musen könsceller till framsteg från stem celler i sädeskanalerna till spermatogonier, spermatocyter, spermatider och slutligen mogna spermier i bitestiklarna (dvs. spermatogenes) är ca 49 dagar. Mutation kan ske vid olika stadier i denna cykel och ofta förening specifikt. Två viktiga funktioner som är av särskild betydelse för mutagenes i manliga könsceller är upphörandet av DNA-syntes under tidig meios och progressiv förlust av DNA-reparation kapacitet 6 under sen efter meios, två processer som krävs för induktion och fixering av flesta mutationer.
På grund av dessa unika egenskaper spermatogenesen, finns det tre viktiga experimentella variabler för genomförandet av TGR könsceller mutation assay: (1) testföreningen administrationstiden; (2) samplingstiden; och (3) val av könsceller befolkningen att samlas för analys (figur 3 och tabell 1). Administrering tid är experimental variabel som bestämmer hur långa målceller exponeras för testföreningarna. Längden på administreringstiden kan också användas för att rikta exponeringar mot specifika celltyper eller faser av spermatogenes. Till exempel kan en enda dag administrering användas för att bestämma effekterna av en akut exponering på en särskild celltyp. På samma sätt kan exponeringen fokuseras till en hel spermatogenescykler fas, till exempel genom att rikta bara meiotiskt delande spermatocyter eller mitotiskt dela spermatogonier med hjälp av en 2 veckors administration tid och en lämplig samplingstiden. Kroniska och under kronisk administration tider används för att bedöma effekterna av långvarig exponering, för att säkerställa tillräcklig farmakokinetiska fördelning av testföreningen, eller tillåta tillräcklig ansamling av mutationer från svaga mutagener (t.ex. 28 dagars administrationstiden rekommenderas i OECD test riktlinje).
Samplingstiden är kritisk variabel för att bestämma vid vilkenfasen av spermatogenes målcellerna var i vid tidpunkten för exponering. Tids provtagning dikterar hur mycket tid, och därmed hur mycket vidare längs spermatogenescykler cykeln cellerna passera efter exponering. Till exempel, för att undersöka effekter i stamcells spermatogonier, en provtagningstid> 49 dagar krävs om att samla fullt mognat spermier, eller> 42 dagar, om insamling av omogna könsceller från sädeskanalerna, för att säkerställa att alla insamlade celler har haft tillräckligt med tid för att utvecklas från utsatta stamceller. Det är viktigt att notera att en provtagningstid om minst 70 dagar skulle vara bättre att visa en sann stamcellseffekt att ge tillräcklig tid för farmakokinetiska distribution av giftet, för eliminering av celler som exponeras vid senare faser av spermatogenes, och ta hänsyn till en period av tillfällig sterilitet som kan inträffa ~ 6 veckor efter exponering för starkt mutagena föreningar 22. På samma sätt skulle en provtagningstid på 21 dagar så att spermier colleCTED från cauda epididymis hade just avslutat meios på den sista dagen av exponering.
Könsceller kan samlas in som mogna spermier från cauda epididymis, eller som en blandning av olika spermatogenescykler celltyper från sädeskanalerna. Mogna spermier kvar i cauda för ~ 3 dagar, vilket gör det möjligt att med relativ noggrannhet celltypen eller fas av spermatogenes som sperman härstammar för varje given experimentell design. Således analys av cauda spermier tillstånd välriktade undersökningar av scenspecifika mutationseffekterna. Å andra sidan, cellsuspensioner uppsamlade från sädeskanalerna innehålla en blandning av olika bakterie-celltyper i olika utvecklingsfaser, och därmed erbjuda sämre upplösning av spermatogenescykler fas där mutationer har sitt ursprung. Dessutom cellsuspensioner återvunnits från sädeskanalerna tenderar att innehålla en överrepresentation av spermatider, följt av spermatocyter och very få spermatogonier och stamceller (dessa andelar representeras av graderade vita staplar i figur 3). Dessutom kan suspensioner framställda från sädeskanalerna även innehålla olika somatiska celler. Således, eftersom så många celltyper är närvarande, mutations effekter kan påverkas av en mängd icke-målceller. Men att samla prover från sädeskanalerna ger ett ekonomiskt alternativ för att samtidigt screena flera könscellstyper och enkel integrering av könsceller analys i standarden OECD testprotokoll för somatisk mutation.
För att upprepa, beroende på behoven av utredaren, administrationstid, samplingstiden och den uppsamlade cellpopulationen kan justeras för att förhöra effekterna av exponering i olika celltyper och vid olika faser av spermatogenes. Genom att noggrant välja dessa variabler kan experiment utformas för riktade mekanistiska studier, eller för mer generaliserad föreskrivna provningsing ändamål.
För att uppnå kunskaper i analysen, rekommenderar vi användning av en akut oral administrering av 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosourea (ENU), följt av en 70 dagars provtagningstid som positiv kontroll. Analys av cauda spermier riktar alltså spermatogoniala stamceller (Figur 3), som normalt uppvisar en 4-5 faldig ökning av mutationsfrekvens (MF) över kontrollerna efter denna mycket mutagen dos ENU. Det bör noteras att denna dos är känd för att inducera sterilitets 6 veckor efter exponering, så det inte kan vara en lämplig kontroll dos för kortare samplingstider. Denna dos kommer också att producera en detekterbar ökning av MF i de flesta somatiska vävnader 20. De representativa resultat som presenteras nedan genererades efter en akut 70 exponeringsbehandling med användning av tre doser av ENU upp till och med 100 mg / kg.
Jämfört med traditionella metoder ger TGR könsceller mutation assay ett snabbare, mer ekonomiska, och känsligare metoder att kvantifiera inducerad in vivo könsceller mutationer. Genom att bedöma transgen MF direkt i spermier, i motsats till avkomma, antalet djur, är tid och resurser som krävs för att bedöma könsceller mutagenicitet varje enskild förening betydligt. När det gäller känslighet, kunde vi upptäcka en signifikant 2,6-faldig ökning av spermatogonier stamcells MF efter exponering för 25 mg / kg ENU med endast fem djur per dos grupp. Däremot den specifika locus analysen kunde inte upptäcka någon väsentlig förändring av MF vid samma dos med hjälp av> 3.000 möss i den exponerade gruppen och> 500.000 kontrollmöss 28.
Förutom dess lämplighet för både mekanistiska och regulatoriska utredningar, ger denna metod en möjlighet för jämförande studier mellan somatisk och könsceller Mutatiom priser. De senaste rönen visar att för vissa agenter könsceller mutationer kan induceras vid lägre koncentration än vad som krävs för somatisk mutation. Till exempel långvarig exponering för N-hydroxymethylacrylamide, en metabolit av cancerframkallande livsmedels akrylamid 12, ökar frekvensen av dominerande dödliga könscells mutationer hos möss utan att påverka mikrokärnfrekvens i röda blodkroppar, ett traditionellt mått på somatisk cell cytogenetisk skada 13. Dessutom exponeras möss till både vanliga och sidoström tobaksrök ger förhöjda mutationsfrekvenser vid tandem upprepa DNA loci i spermier vid doser som inte ökar blodmikrokärnfrekvens 14. Dessa resultat utmanar antagandet att somatiska genotoxicitetstester alltid skyddande av könsceller, och stärka efterfrågan på ett effektivare och kostnadseffektivt sätt att kvantifiera könsceller mutationsfrekvensen. Dock är fortfarande svag bevisen för förmånskönscellsmutagener, Främst på grund av bristen på tillgängliga data för att jämföra mutationshastigheter på somatiska och könscellvävnader. Den TGR mutationstest möjliggör parallell testning och jämförelse av inducerade mutationshastigheter i flera vävnader med samma transgenen. Således jämförande mutation testning med hjälp av TGR-analysen skulle hjälpa fylla uppgiftsluckor kring möjligheten till förmånliga groddceller.
Samtidig bedömning av somatiska och könsceller mutation för lagstadgade tester skulle också förbättra effektiviteten genom att minska antalet djur som krävs. OECD riktlinje för somatisk mutation rekommenderar en 28 dagars administration tid, följt av en tre dagars provtagningstid (28 + 3). Analys av cauda spermier kan erbjuda svaga känslighet vid denna tidpunkt, eftersom den riktar celler som utsätts oftast under spermatocyte och spermatid faser spermatogenes (Figur 3). Celler i dessa faser inte syntetisera DNA och gradvis förlorar sin förmåga till DNA-reparation 6 </ Sup>. Dessutom skulle provtagning cauda spermier vid denna tidpunkt inte upptäcker mutationer uppträder i spermatogonier och stamceller. Således, för att integreras i det 28 + 3 designen rekommenderar OECD riktlinje samla könsceller från sädeskanalerna. Denna blandade populationen innehåller celler som härrör från DNA-syntes och reparations kompetenta celltyper, inkluderande stamceller, och exponeras över flertalet spermatogenescykler faser. Men på grund av den blandade karaktären av dessa celler, sädeskanalerna cellanalys ger inte fas-specifik information. Dessutom finns det oro för att närvaron av icke-målceller kan påverka den observerade MF (t.ex. falskt positiva mutagena samtal på grund av kontaminering av muterade somatiska celler, eller utspädning av en muterad könscell signal från DNA-reparation-brist könsceller) . För närvarande finns det inte tillräckligt med data för att avgöra om resultaten från sädeskanalerna celler vid 28 + 3 erbjuder samma känslighet och specificitet as cauda spermier vid senare tidpunkter. Vårt laboratorium är för närvarande jämföra inducerade MFs i sädeskanalerna celler och cauda sperma som samlats in efter olika provtagningstider för att ta itu med denna fråga. Vi noterar att OECD riktlinje föreslår en alternativ provtagningstiden på 28 dagar för långsamt delande vävnader såsom levern som också kan vara lämpliga för könsceller analys. Ändå finns uppgifter fortfarande otillräckliga och vi är för närvarande inte rekommendera en enda experimentell design för samtidig analys av somatiska celler och könsceller med hjälp av TGR mutationsanalys för lagstadgade tester.
Ett kännetecken för denna analys som bör noteras är att mutationshändelser bedöms på ett icke-mus-transgen. Men det finns gott om bevis för att transgenen reagerar på miljömutagener i ett liknande sätt till endogena gener 20. Dessutom, eftersom de exakta ursprunget oberoende mutationshändelser är svåra attlösa, är resultaten i allmänhet rapporteras som en mutant frekvens (i motsats till en mutationsfrekvens). Själva mutationsfrekvensen kan lösas om resultaten korrigeras för klonal expansion (dvs. Den division och multiplikation av ett enda muterad cell som kan bidra till den observerade frekvensen av transgena mutanter) genom DNA-sekvensering. Sekvensering av de muterade transgener kan utföras för att karakterisera de lacZ-mutationer, och identifiering av mutanter som kan vara härledda från klonal expansion händelser, även om detta ökar avsevärt till tiden och kostnaden för analysen. Förutom den lacZ-gen, härbärgerar theλgt10 transgen vektor en alternativ temperaturberoende mutation-reportergen: en variant av λ cll-genen, som är kortare (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) och lättare att sekvensera 29. Sekvense tillåter också analysen av den inducerade mutationsspektrum, som ger inblick i mutational mekanism av föreningen i fråga. Ett extremt exempel på klonal expansion är förekomsten av en "jackpot" mutation (dvs., Transgen mutationer vid ett mycket tidigt skede av ett organ utveckling som bidrar till en dramatiskt förhöjd MF, ibland hundratals till tusentals gånger större än bakgrunden). Djur eller vävnader med "jackpot" mutation bör tas bort från analysen.
Den analys som vi har beskrivit i stort sett tillämpas på andra TGR modeller som BigBlue mus och råtta, och lacZ plasmiden musen, som alla hyser liknande mutation reporter vektorer (granskas i 20). De allra flesta studier könsceller som hittills som använder liknande metoder har fokuserat nästan uteslutande på väl karakteriserade mutagener såsom ENU och strålning (över 30). Det förväntas att med den senaste utgåvan av testet OECD-för TGR-analysen, kommer denna analys attallt populärare för kemisk screening och reglerande utvärdering. Införlivandet av könsceller mutation assay TGR till ett lagstadgade tester batteri kommer att fylla den nuvarande luckan genom att tillåta en effektiv bedömning av mutations induktion i könsceller 11. Dessutom kan denna analys användas för att mäta MF i praktiskt taget alla vävnader, vilket ger ett lämpligt medel för att jämföra de relativa känsligheter somatiska celler och könsceller för induktion av mutationer av miljöfarliga ämnen vid identiska genetiska slutpunkter.
The authors have nothing to disclose.
This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MutaMouse | Covance | – | |
E.coli (lacZ–/galE–) | Covance | – | See reference 25 in manuscript |
Chloroform | Caledon | 3001-2-40 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) | Gibco | 14190-250 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8 | Sigma-Aldrich | 03690 FLUKA | |
Isoamyl alcohol | Caledon | 2/10/7900 | |
Lennon LB broth base | Invitrogen | 12780-029 | |
Stainless steel mesh filter | Sigma-Aldrich | S3770 | |
Transpack packaging extract | Agilent Technologies | 200220 | |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) | Commercial Alcohols | – | |
Ampicilin | Gibco | 11593-027 | prepare 20 mg/ml in dH2O |
Kanamycin | Gibco | 11815-024 | prepare 5 mg/ml in dH2O |
Phenol | Invitrogen | 15509-097 | Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction |
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) | Sigma-Aldrich | P6501 | dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide |
Proteinase K | Invitrogen | 25530-031 | prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample |
Sodium acetate (NaAc) | Fisher Scientific | BP333-500 | prepare 3M solutution, pH 5.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4390 | prepare 10% solution in dH2O |
1 M MgSO4 | 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
20% maltose solution | 20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4·7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4ᵒC up to 6 months | ||
Bottom agar | Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC before pouring into Petri plates | ||
LB Broth | 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool | ||
Saline sodium citrate (SSC) | 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 | ||
SM Buffer | 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year | ||
TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 | ||
Top agar, mutant plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM | ||
Top agar, titre plates | Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50ᵒC. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L |