Summary
Combinato imaging ottico e μCT in un modello murino di infezione impianto ortopedico, utilizzando un ceppo ingegnerizzato bioluminescente di Staphylococcus aureus, purché la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente la dinamica della infezione batterica, così come la risposta infiammatoria corrispondente e cambiamenti anatomici nel osso.
Abstract
L'imaging multimodale è emerso come un approccio tecnologico comune utilizzato sia nella ricerca preclinica e clinica. Tecniche avanzate che combinano in vivo imaging ottico e μCT consentono la visualizzazione di fenomeni biologici in un contesto anatomico. Queste modalità di imaging possono essere particolarmente utile per studiare le condizioni che l'osso impatto. In particolare, le infezioni impianti ortopedici sono un importante problema clinico in chirurgia ortopedica. Queste infezioni sono difficili da trattare perché biofilm batterici si formano sui materiali impiantati chirurgicamente stranieri, con conseguente infiammazione persistente, osteomielite ed eventuale osteolisi dell'osso che circonda l'impianto, che si traduce in ultima analisi in impianto allentamento e fallimento. Qui, un modello murino di un impianto protesico ortopedico infetto è stato utilizzato che ha coinvolto il posizionamento chirurgico di un impianto con fili di Kirschner in un canale endomidollare del femore in modo tale che l'estremità dell'impianto eXtended nell'articolazione del ginocchio. In questo modello, i topi LysEGFP, un ceppo di topi che ha neutrofili EGFP-fluorescenti, sono stati impiegati in combinazione con un bioluminescente ceppo Staphylococcus aureus, che emette luce naturale. I batteri sono stati inoculati nelle articolazioni del ginocchio dei topi prima di chiudere il sito chirurgico. In vivo bioluminescenti e di imaging fluorescente è stato utilizzato per quantificare la carica batterica e la risposta infiammatoria dei neutrofili, rispettivamente. Inoltre, l'imaging μCT è stata eseguita sulla stessa topi in modo che la posizione 3D del bioluminescente e segnali ottici fluorescenti potrebbe essere co-registrate con le immagini μCT anatomiche. Per quantificare i cambiamenti nel tessuto osseo nel corso del tempo, il volume esterno delle ossa dei femori distali sono stati misurati in punti temporali specifici utilizzando un processo di segmentazione contorno a base semi-automatico. Nel loro insieme, la combinazione di immagini in vivo bioluminescenti / fluorescente con immagini μCT può essere particolarmente utile fo il monitoraggio non invasivo della infezione, risposta infiammatoria e cambiamenti anatomici in osso nel tempo.
Introduction
Multimodalità tecniche di imaging preclinico che prevedono la combinazione di informazioni ottiche e anatomiche consentono la visualizzazione e il monitoraggio dei fenomeni biologici in 3D 1-4. Dal momento che l'imaging μCT permette la visualizzazione squisita dell'anatomia ossea, utilizzando immagini μCT in concomitanza di con imaging ottico rappresenta una combinazione unica che potrebbe essere particolarmente utile per i processi che coinvolgono l'osso biologia 5-7 indagando. Un esempio potrebbe essere quello di utilizzare queste tecniche per studiare le infezioni impianti ortopedici, che rappresentano una complicazione disastroso seguito di interventi chirurgici ortopedici 8,9. Batteri biofilm si formano sugli oggetti estranei impiantati che promuovono la sopravvivenza dei batteri fungendo da barriera fisica che impedisce alle cellule immunitarie di rilevamento delle infezioni e blocca gli antibiotici di accedere ai batteri 10,11. L'infezione cronica e persistente del tessuto articolare (artrite settica) und dell'osso (osteomielite) induce il riassorbimento osseo che porta ad un allentamento della protesi ed eventuale guasto 8,9. Questo risultato osteolisi periprotesica è associata ad un aumento della morbilità e della mortalità 12,13.
Nel nostro lavoro precedente, bioluminescenti in vivo e di imaging fluorescente è stato utilizzato insieme con i raggi X e micro-tomografia computerizzata di immagini (μCT) in un modello di infezione protesica articolare ortopedica nei topi 14-19. Questo modello ha coinvolto ponendo un titanio fili di Kirschner (filo K) in modo tale che l'estremità tagliata dell'impianto esteso nel ginocchio dai femori di topi 14-19. Un inoculo di Staphylococcus aureus (ceppo bioluminescente Xen29 o Xen36) è stato poi pipettati sulla superficie dell'impianto in ginocchio prima che il sito chirurgico è stato chiuso 14-19. In vivo imaging ottico è stato utilizzato per rilevare e quantificare i segnali bioluminescenti, che corrispondeva alla number dei batteri nel tessuto infetto articolazioni e delle ossa 14-19. Inoltre, in vivo imaging di fluorescenza di topi LysEGFP, che possiedono neutrofili fluorescenti 20, è stato utilizzato per quantificare il numero di neutrofili che emigrarono per le articolazioni del ginocchio infette contenenti gli impianti K-wire 14,19. Infine, le modalità di imaging anatomiche, tra cui imaging ad alta risoluzione a raggi X e l'imaging μCT, consentiti rispettivi 2D e 3D di immagini anatomiche dell'osso colpito tutta la durata di infezione cronica, che avremmo arbitrariamente finire tipicamente tra 2 e 6 settimane postoperatorie 16 , 18. Utilizzando questo modello, l'efficacia della terapia antimicrobica locale e sistemica, le risposte immunitarie protettive e alterazioni anatomiche patologiche in osso potrebbe essere valutata 14-18. In questo manoscritto, i protocolli dettagliati per le modalità di imaging ottico e μCT in questo ortopedica protesica modello di infezione articolare sono stati forniti da representatiSistema di studiare processi biologici nel contesto anatomico dell'osso ve. Questi includono le procedure chirurgiche per modellare un ortopedico infezione protesi articolare nei topi, 2D e 3D in procedure di imaging ottico in vivo (per rilevare i segnali bioluminescenti batteriche e segnali neutrofili fluorescenti), μCT acquisizione di imaging e di analisi e co-registrazione di immagini ottiche 3D con il immagini μCT.
Protocol
Dichiarazione etica: Tutti gli animali sono stati trattati in stretta conformità con le buone pratiche animale come definito nei regolamenti federali secondo quanto stabilito nel Animal Welfare Act (AWA), la Guida 1996 per la cura e l'uso di animali da laboratorio e la politica PHS per la Humane cura e l'uso di animali da laboratorio e tutto il lavoro animale è stato approvato dalla cura degli animali Johns Hopkins and Use Committee (protocollo #: MO12M465).
1. Preparazione del Inoculo di Mid-logaritmiche Batteri Bioluminescenti
- Streak bioluminescenti S. aureus ceppo Xen29 (o un altro ceppo bioluminscent come Xen36) su piastre di agar soia trittico (trittico brodo di soia agar [1,5%]).
NOTA: S. aureus Xen29 21 è un S. geneticamente ceppo aureus che contiene un operone lux modificato derivato dalla Photorhabdus luminescens, che è integrato in un plasmide nativo stabile si trovano in questo ceppo batterico. Questi motorebatteri Ered costitutivamente emettono luce da cellule vive e metabolicamente attive. - Crescere le colonie su piastre da essi incubando a 37 ° C per circa 16 ore (O / N).
- Selezionare CFU batterica singolo e la cultura in agitando TSB liquido (240 rpm) per circa 16 ore (O / N).
- Eseguire una sub-cultura con 1/50 diluizione del O / N cultura per ottenere la metà del logaritmiche batteri fase di crescita (durata circa 2 ore).
- Pellet, risospendere e lavare i batteri 3x in PBS.
- Stimare l'inoculo batterico (1 x 10 3 CFU in 2 ml di PBS), determinando l'assorbanza densità ottica a 600 nm.
- Verificare il CFU nel inoculo dopo coltura dei batteri O / N su piastre.
2. mouse Procedure chirurgiche
NOTA: Per queste esperimento, utilizzare un dodici settimana vecchio maschio topi LysEGFP. Questi topi possee proteina fluorescente verde (EGFP) che esprimono le cellule mieloidi (che consistono in mostly neutrofili) 20. Mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico e dopo la preparazione chirurgica con betadine e il 70% di alcool mettendo ogni mouse su un telino sterile sulla cima di una superficie dura acqua circolante rilievo di riscaldamento. Utilizzare camice, guanti sterili, mascherina e sterilizzare gli strumenti.
- Anestetizzare il mouse con una inalazione 2% di isoflurano. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Valutare il livello appropriato di anestesia osservando la frequenza respiratoria, il tono muscolare, pizzico punta, riflesso corneale e il colore delle mucose. Coprire i topi con un telo chirurgico sterile con un foro al sito chirurgico sul ginocchio destro. Il mouse dovrebbe ottenere misure di sostegno di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea mentre sotto anestesia. Caldo 37 ° C l'acqua che circola in una coperta a camicia d'acqua calda o acqua circolante plastica dura workstation riscaldata (ProStation, Patterson, scientifico) sono buoni modi per prevenire l'ipotermia.
- Iniettare buprenorphine (formulazione a rilascio prolungato) (2,5 mg / kg) per via sottocutanea poco prima di un intervento chirurgico. Ulteriori dosi di buprenorfina-rilascio prolungato possono essere somministrati a intervalli di 3 giorni, se necessario per l'analgesia.
- Shave il ginocchio operativo e preparare utilizzando tre scrub alternati con betadine e il 70% di alcol.
- Eseguire un'incisione mediana della cute sovrastante l'articolazione ginocchio destro. Estendere l'incisione cutanea in modo che il meccanismo estensore può essere ben definito.
- Eseguire un artrotomia parapatellare mediale e sublux il quadricipite-rotuleo meccanismo tendine estensore lateralmente con una pinza Adson.
NOTA: Questo porta la gola intercondiloidea del femore in vista. - Risma manualmente il canale endomidollare con un ago 25 G seguita da un ago 23 G.
Nota: Per evitare danni al femore, una piattaforma di stabilizzazione può essere utilizzato. Questo dovrebbe essere importante per la tecnica per ridurre una frattura accidentale del femore. - Inserire un titanio Kirsc medico-gradohner fili (diametro 0,8 mm) utilizzando una tecnica press-fit, che comporta spingendo manualmente utilizzando un supporto del perno, in una direzione retrograda nel canale endomidollare.
NOTA: Titanio fili di K sono state usate come c'erano meno artefatti visto sulle immagini μCT titanio con fili di K rispetto ad acciaio inox fili di K 16. - Tagliare l'estremità del filo di Kirschner con frese perno in modo che l'estremità tagliata del filo K estende circa 1 mm nella cavità articolare del ginocchio.
- Usando una micropipetta, pipetta 2 ml di 1 x 10 3 CFU di bioluminescenti S. aureus Xen29 sulla punta dell'impianto all'interno dello spazio articolare del ginocchio.
NOTA: più volume porta alla contaminazione dei tessuti più ampio e meno di imaging discreto.
NOTA: Nel controllo di topi non infetti, aggiungere 2 ml di soluzione salina sterile, senza batteri. - Ridurre il complesso quadricipite-rotuleo torna alla linea mediana con pinze e chiudono il tessuto sottocutaneo sovrastante e pelle con assorbibilesuture sottocuticolare.
NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. - Alla fine degli esperimenti, eutanasia tutti gli animali che utilizzano anidride carbonica inalazione secondo i Animal Care and Use Committee linee guida Johns Hopkins. Verificare la morte osservando l'animale non riesce a recuperare entro 10 minuti dopo la fine dell'esposizione anidride carbonica e dislocazione cervicale.
3. 2D Optical Imaging (In vivo bioluminescente e Fluorescent Imaging)
- Anestetizzare LysEGFP topi (ad esempio, 2% isoflurano inalazione) e metterli con lato ventrale in una camera di imaging.
- Eseguire in vivo bioluminescenti immagini utilizzando l'intero animale ottica IVIS Spectrum nel sistema di imaging in vivo. In primo luogo, controllare luminescenti e confermare la scelta di un f apertoselezione iltro, campo di vista (FOV) C - 13 centimetri, e scorrere verso il basso tempo di esposizione su Auto (impostazione esposizione automatica). Esposizione automatica regola automaticamente tempo di acquisizione (velocità dell'otturatore), binning (binning pixel digitale), e f-stop (apertura) dello strumento per ottimizzare l'intensità del segnale, evitando la saturazione. Quindi fare clic su Acquisisci per acquisire l'immagine bioluminescente.
NOTA: Per l'imaging in vivo bioluminescenti, topi di immagini tra 1-5 min. - Eseguire sequenziale imaging fluorescente vivo selezionando la casella accanto a fluorescente. Scegliere il filtro di eccitazione 465 nm e 520 nm filtro per le emissioni. Scorrere verso il basso tempo di esposizione su Auto e selezionare FOV C (punto 3.2.1). Quindi fare clic su Acquisisci per acquisire l'immagine di fluorescenza.
NOTA: per imaging in vivo fluorescente, topi di immagini tra 0,5 sec. - Quantificare i segnali in vivo bioluminescenti come flusso totale (fotoni / sec) in una regione di interesse (ROI) con Living software Immagine di primo espandendo laSezione Strumenti ROI della tavolozza degli strumenti.
- Selezionare l'icona Circle e il numero di ROI che corrisponde al numero di animali sottoposti nel FOV. Ridimensionare il ROI per comprendere la regione di interesse cioè, il modello di diffusione bioluminescente raccolti.
- Apparirà selezionare ROI misura in Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti e la finestra di misurazione del ROI. I valori totali Radiance (fotoni / sec) rappresentano la somma di pixel bioluminescenti all'interno della ROI generato.
- Scegliere Seleziona tutto e schede COPY nell'angolo in basso a destra di questa finestra sarà trasferire le informazioni negli appunti e consentire incollatura in programmi successivi per l'analisi.
- Quantificare i segnali fluorescenti in vivo la totale efficienza radiante ([fotoni / sec] / [W / cm 2]) all'interno di una regione circolare di interesse (ROI) utilizzando Vivere software immagine.
- All'interno della finestra del software Living Immagine, espandere Strumenti di ROI nella tavolozza degli strumenti. Selezionarel'icona Circle e il numero di ROI che corrisponde al numero di animali sottoposti nel FOV.
- Ridimensionare il ROI per comprendere la regione di interesse corrispondente strettamente al segnale bioluminescente dal precedente acquisizione dell'immagine.
- Apparirà selezionare ROI misura in Strumenti ROI nella tavolozza degli strumenti e la finestra di misurazione del ROI.
NOTA: Totale efficienza radiante (fotoni [/ s] / [W / cm 2]) rappresenta le somme di pixel fluorescenti all'interno della ROI. - Selezionare Tutte e Copia schede nell'angolo in basso a destra di questa finestra sarà trasferire le informazioni negli appunti e consentire incollatura in programmi successivi per l'analisi.
4. μCT Image Acquisition
- Mettere i topi LysEGFP anestetizzati in una camera di imaging.
NOTA: Questa camera di imaging è progettato per adattarsi sia nel sistema di imaging IVIS Spectrum e l'FX Quantum in vivo μCT sistema di imaging per consentireco-registrazione delle immagini ottiche e μCT. - Aprire il software CT e selezionare il menu di preset 60 millimetri FOV std dinamico dal menu a discesa.
- Inserire il grande coperchio foro e il braccio adattatore per la navetta di imaging nello strumento.
- Posizionare la navetta di imaging del mouse nel braccio adattatore quindi spingere il braccio nel foro e chiudere la porta. Attivare Live Mode (il pulsante Occhio sul pannello di controllo) e posizionare il soggetto nella posizione 0 ° e 90 ° gantry con l'asse X e controlli asse Y per centrare l'animale nella finestra di acquisizione X. Quindi spegnere modalità Live facendo clic sul pulsante Eye.
- Acquisire un'immagine di scansione dinamica con il FOV 60 millimetri facendo clic sul pulsante CT Scan (accanto al pulsante modalità Live). Esportare l'immagine acquisita in formato DICOM e conservare in un luogo che può essere letta più tardi.
NOTA: La dose approssimativa sarà 26 mGy per scansione. Un FOV 30 millimetri può essere utilizzato se si desidera una migliore risoluzione.
5.3D Optical Image Acquisition, la Formazione e μCT Co-registrazione
- Collocare l'inserto navetta di imaging del mouse nella Spectrum posizionando la navetta di imaging contenente il mouse in questo inserto e garantire il mouse non si muove.
- Utilizzando Vivere Immagine, selezionare Imaging guidata nel Pannello di controllo di acquisizione per avviare la procedura guidata di installazione. Per iniziare, scegliere bioluminescenza, poi DLIT, e quindi selezionare il giornalista "Batteri" dal menu a discesa ed i filtri di emissione appropriati per il modello sarà scelto automaticamente, in questo caso, 500-620 nm.
- Selezionare Avanti, quindi designare i parametri di acquisizione e le informazioni oggetto nella finestra finale. In particolare, Imaging Oggetto sarà mouse, Impostazioni auto saranno selezionati permettendo autoexposure per massimizzare la qualità del segnale, evitando la saturazione, e il campo visivo sarà impostato a C - 13 centimetri.
- Selezionare Fine nella finestra finale e la finestra sequenza del pannello Acquisizione sarà unutomatically popolato con la sequenza DLIT. Ci sarà una immagine acquisita per filtro di emissione scelto e esposizione automatica sceglierà le impostazioni ottimali ad ogni lunghezza d'onda, come per le selezioni guidata Imaging. La sequenza generata comprende anche una immagine luce strutturata necessaria per la generazione di superfici soggette tramite lo strumento topografia della superficie di seguito dettagliato.
- Selezionare Acquisisci sequenza di acquisire i dati DLIT.
- Dopo l'acquisizione delle immagini è completa, generare la topografia della superficie. Inizia ampliando la scheda topografia della superficie sotto la tavolozza degli strumenti.
- Avanti, selezionare l'orientamento che rifletta accuratamente la parte dell'animale di fronte alla telecamera o la parte superiore dello strumento IVIS. Quindi fare clic su Genera Surface. Raccolto regione del FOV che contiene l'animale.
- Quindi utilizzare la maschera viola per definire i limiti dell'animale.
NOTA: Lo strumento di mascheratura utilizza il contrasto di colore così gli animali con pelliccia scura o la pelle non mascherare adeguatamente dalla stage. - Selezionare Fine e la superficie apparirà automaticamente. Salva il risultato nella scheda topografia della superficie quindi chiudere la scheda, come avremo più bisogno.
- Ricostruire la posizione della sorgente ottica 3D utilizzando le diffuse algoritmi di ricostruzione ottici implementati in Living Immagine 22 espandendo la scheda DLIT Ricostruzione 3D.
- Immagini acquisite per la sequenza DLIT sono mostrati.
NOTA: Il software verifica automaticamente la qualità dei dati acquisiti e verrà deselezionare le immagini considerate troppo debole o se la saturazione è presente. Selezionare Avvio sul lato in basso a destra. - Se necessario, si può regolare la soglia per ciascuna immagine bioluminescente con un doppio clic e utilizzando il cursore soglia sul lato sinistro inferiore.
NOTA: questo è principalmente quello di includere segnale di minore intensità e la cautela deve essere praticata quando thresholding maggiore, come ciò può regolare l'intensità complessiva della sorgente ricostruito finale.
- Immagini acquisite per la sequenza DLIT sono mostrati.
- Aprire il browser DICOM facendo clic sull'icona 3D nella barra degli strumenti nella parte superiore del software (terzo da sinistra) e cercare l'immagine Quantum FX acquisita in precedenza.
- Caricare questa immagine nella scheda Vista 3D Living immagine facendo doppio clic sul file per l'importazione.
NOTA: Il fiduciale deve essere rilevato e risultato nell'immagine μCT automaticamente essere registrato con l'immagine ottica 3D.
- Caricare questa immagine nella scheda Vista 3D Living immagine facendo doppio clic sul file per l'importazione.
- Deselezionare la topografia della superficie di visualizzazione mappa espandendo Strumenti ottici 3D nella tavolozza degli strumenti e deselezionando la casella di controllo Visualizza etichettata Oggetto Surface nella scheda Surface.
- Creare manualmente una tabella di ricerca per visualizzare lo scheletro e l'impianto K-wire che sono visibili nell'immagine μCT mediante l'istogramma nella scheda Volume del 3D Multi-Modality sezione Strumenti della tavolozza degli strumenti.
- L'istogramma rappresenta la distribuzione delle intensità voxel nei dati volumetrici 3D e l'opacità del colore. Per determinare dove il particolare tessuto di interesse è nell'istogramma, utilizzare lo strumento cursore alla soglia del rendering fino a quando il tessuto o la struttura è visibile.
- Quindi fare clic destro dell'istogramma per generare punti e formare una curva per isolare quella zona dell'istogramma. Questo sarà ripetuto per ogni struttura - scheletro seguita dal l'impianto K-fili e può essere salvata come una tabella di ricerca per le future analisi.
- I componenti possono essere colore codificato se lo si desidera con un doppio clic su qualsiasi punto generato nell'istogramma e selezionando il colore desiderato dalla finestra pop up.
6. μCT Immagine visualizzazione e l'analisi
- Utilizzando il software Quantum FX, selezionare l'immagine di interesse e lanciare Viewer. Selezionate lo strumento rotazione e riorientare l'immagine di visualiZE l'asse longitudinale del femore. Selezionare lo strumento di misura e misurare la lunghezza del femore.
- Avviare il Visualizzatore 3D per generare rendering 3D. Regolare la soglia per mostrare i cambiamenti in anatomia ossea associati con l'infezione dell'impianto.
- Applicare piani di ritaglio in modo che il rendering 3D è limitata alla sezione trasversale desiderata della zona di interesse nel femore distale.
- Avviare il pacchetto software Analizza 11.0. Caricare il file * .vox che è stato utilizzato per creare rendering 3D.
- Avviare lo strumento Calcolatrice immagine. Utilizzare lo strumento della 'Regione Pad' per ritagliare l'immagine (rimuovere gli aerei che non includono il femore).
- Avviare lo strumento Sezioni Oblique. Utilizzare l'opzione 3 punti per trovare punti a metà del femore, grande trocantere e l'estremità del perno. Effettuare questi punti un piano obliquo e generare un'immagine con nuove fette.
- Avviare la Regione strumento di interesse. Visualizzare le fette transassiali. Regolare l'impostazione min e maxs per visualizzare l'osso corticale. Creare contorni per le fette corrispondenti per qualche fetta (con un intervallo approssimato di 5 fette) per le fette corrispondenti al 25% distale del femore. Utilizzare lo strumento 'Regioni Propaga' per interpolare tra questi contorni e creare una regione 3D di interesse. Salva questa regione di interesse come mappa oggetto.
- Avviare lo strumento 'Opzioni campione'. Selezionare la casella di controllo per la mappa oggetto che è stato appena creato e selezionare i pulsanti per le opzioni appropriate. Fare clic sul pulsante 'Configura log Stats' per confermare che sia selezionata la casella di controllo 'Volume'. Fare clic sul pulsante "Immagini di esempio" per effettuare le misurazioni effettive.
- Esportare le misurazioni del volume in un programma di analisi dei dati. Normalizzare i volumi ossei esterni da momenti successivi al primo punto temporale ripreso con la formula: Δ Volume (%) = ([Volume (giorno X) - Volume (giorno 2)] / [Volume (giorno 2)]) x 100 .
NOTA: In questa formula, la "X" variabile rappresenta il punto di tempo di interesse. Il numero risultante rappresenterà il cambiamento nella dimensione esterna del volume di osso del femore distale nel tempo. - Per visualizzare la regione 3D di interesse sulla parte superiore dell'osso, caricare l'immagine TC nello strumento 'Volume Rendering'. Caricare la carta oggetto contenente la regione di interesse in 3D. Vai a 'View''Objects "e impostare il' originale 'di essere' On '. Aprire la finestra 'Anteprima'. Avviare il menu 'Render Tipi' e selezionare 'compositing Object'.
- Fare clic sul pulsante 'Threshold' e strumento e regolare le soglie per mostrare la mappa ossa e oggetto. Utilizzare lo stesso intervallo di soglia fissa per tutti i punti di tempo. Fare clic sul pulsante 'rotazione' e impostare l'orientamento ad essere una vera visione antero-laterale. Fare clic su 'Render' per generare il rendering finale. Salvare la resa dalla principale 'VolumeRender 'finestra.
Representative Results
In bioluminescenti vivo e di imaging fluorescente
Nel presente studio, il protocollo è descritto per questo modello precedentemente pubblicata di un'infezione protesi articolare ortopedica in topi 14-19, che comporta il posizionamento chirurgico di un impianto in titanio K-filo che si estende da un canale endomidollare nel femore nel giunto spazio di 14-19. S. aureus ceppo bioluminescente Xen29 (1 x 10 3 CFU in 2 ml PBS) è stato dispensato direttamente sulla parte superiore del titanio dell'impianto fine del ginocchio prima di chiudere il sito chirurgico 16. Per visualizzare e quantificare il carico batterico e neutrofili afflusso non invasiva in topi anestetizzati LysEGFP, tutta imaging ottico animali in vivo è stata eseguita in sequenza di immagini i segnali bioluminescenti dai batteri e segnali EGFP fluorescenza dei neutrofili infiltranti utilizzando l'intero animale ottica IVIS Spectrum in vivosistema di imaging in tre giorni postoperatori (ad esempio, giorni 2, 14 e 28). I segnali bioluminescenti di topi Xen29-infettati sono rimasti al di sopra dei segnali di topi sham-infettati per tutta la durata dell'esperimento (Figura 1A, C), 16 di fondo. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che i segnali in vivo bioluminescenti strettamente approssimato del numero di ex vivo CFU isolati dal / tessuto osseo articolare e aderente agli impianti 17,18. Inoltre, i segnali EGFP fluorescenti erano più alti rispetto ai topi sham-infettati in momenti iniziali, ma si avvicinarono i livelli di fondo nel corso di infezione (Figura 2B, C) 16.
3D co-registrazione di segnali ottici in vivo con immagini μCT
Per visualizzare i segnali ottici (segnali cioè, bioluminescenti batterica e EGFP fluorescenti) nel contesto anatomico delle articolazioni post-chirurgica del ginocchio in 3D, le immagini ottiche generate utilizzando il sistema di imaging IVIS Spectrum sono stati co-registrate con le immagini μCT generati utilizzando il sistema di imaging Quantum FX μCT. Questa co-registrazione potrebbe essere realizzato perché la camera di imaging del mouse può essere inserito o macchina per verificare che i topi erano nella stessa esatta orientazione. Per verificare questa precisione, i risultati sono stati confrontati con l'acquisizione di un'immagine eseguita usando l'Spectrum CT-in vivo IVIS sistema di imaging che integra sia le modalità in un unico strumento senza richiedere trasferimento fisico dell'animale. Per mappare i dati ottici sulle immagini μCT in 3D, abbiamo utilizzato una tomografia ottica algoritmo di ricostruzione diffusa 16. La ricostruzione 3D risultante è mostrato (filmato 1).
Inoltre, l'imaging μCT permesso la visualizzazione e la quantificazione dei cambiamenti conseguenti nella qualità e le dimensioni delle ossa che si sono verificati durantel'infezione (Figura 2) 16. Come precedentemente riferito, il volume esterno osso del femore distale sostanzialmente aumentata nel tempo (Figura 2A) 16. Per quantificare queste modifiche, analisi di immagini 3D volumetrica è stata eseguita sulla distale 25% della superficie ossea del femore e le variazioni del volume osseo nel tempo sono stati normalizzati per il volume osseo iniziale. Il volume osseo esterno sostanzialmente aumentato nei topi infetti rispetto ai topi sham-infetti (Figura 2b) 16. L'aumento del volume del femore distale esterno era probabilmente dovuta a un danno osseo causata da infezione del tessuto osseo e articolare, che sono stati osservati usando μCT di imaging e di analisi istologica 16.
Figura 1 2D in vivo bioluminescenti e segnali fluorescenti. S. aureus Xen29 o senza batteri (non infetti) sono stati inoculati in ginocchio dopo il posizionamento K-filo e topi LysEGFP sono stati ripresi utilizzando il sistema di imaging IVIS Spectrum 16. (A) Media in vivo segnali bioluminescenti misurata in termini di flusso totale (fotoni / sec) ± sem. (B) media in vivo EGFP segnali fluorescenti misurata in totale efficienza luminosa (fotoni / sec) / (W / cm 2) ± sem. (C) Rappresentante in bioluminescenti vivo e segnali fluorescenti sovrapposti su una fotografia in bianco e nero immagine dei topi. Il limite di rivelazione della carica batterica utilizzando imaging in vivo bioluminescente è compreso tra 1 e 2 x 10 1 x 10 3 CFU. * P <0.05, † p <0.01, ‡ p <0,001 Xen29 topi infettati contro topi sham-infettati (t-test di Student [a due code]). Si prega dinotare che questo è una figura rappresentativa che comprende dati precedentemente pubblicati generati utilizzando Xen29 e ripreso con il sistema di imaging IVIS Lumina XR 16. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 3D μCT di imaging. S. aureus Xen29 o senza batteri (non infetti) sono stati inoculati in ginocchio dopo il posizionamento K-filo e topi sono stati ripresi utilizzando il Quantum FX in vivo del sistema μCT. (A) Rappresentante 3D rendering di μCT Xen29 topi -infected (pannelli superiori) e sham-infettati topi (pannelli inferiori). (B) Percentuale di variazione volume osseo esterno (distale il 25% dei femori) normalizzati al ti inizialeme punto (media ± SEM). * P <0.05, † p <0.01, ‡ p <0,001 Xen29 topi infettati contro topi sham-infettati (t-test di Student [a due code]). Si prega di notare che questa è una figura rappresentativa che comprende dati precedentemente pubblicati generati utilizzando il ceppo bioluminescente S. aureus Xen29 e ripreso con la FX in vivo μCT sistema di imaging Quantum 16. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1 . Rappresentante 3D anatomica co-registrazione dei segnali bioluminescenti Xen29 ei segnali fluorescenti EGFP-neutrofili in combinazione con le immagini μCT. Le immagini vengono ruotate sull'asse verticale.
Discussion
Multimodalità di imaging come ad esempio tecniche di imaging che utilizzano in vivo imaging ottico in combinazione con l'imaging μCT fornisce un nuovo approccio tecnologico che permette la visualizzazione 3D, la quantificazione e il monitoraggio longitudinale dei processi biologici in un contesto anatomico 1-4. I protocolli di questo studio forniscono informazioni dettagliate su come in vivo bioluminescenti e di imaging fluorescente può essere combinato con l'imaging μCT in un impianto protesico ortopedico modello di infezione nei topi per monitorare la carica batterica, infiammazione neutrofila e cambiamenti anatomici nel midollo non invasivo e longitudinalmente su tempo. Nel loro insieme, le informazioni ottenute dalla combinazione di imaging ottico e strutturale rappresenta un importante progresso tecnologico, che può essere particolarmente adatto per lo studio dei processi biologici e patologici che colpiscono il sistema muscolo-scheletrico.
Un interesseconstatazione zione che deve essere sottolineato è che abbiamo osservato che i segnali fluorescenti EGFP-neutrofili scendono a livelli di fondo da 14-21 giorni e sono rimasti a livelli di fondo per tutta la durata dell'esperimento, nonostante la presenza di batteri bioluminescenti. E 'improbabile che l'irradiazione di raggi X influenzato la sopravvivenza dei neutrofili, come abbiamo osservato cinetiche simili dei segnali neutrofili nei topi non irradiati 19. Nel nostro precedente lavoro che coinvolge un modello di S. ferite infette aureus, infiltrazione di neutrofili coinvolto una combinazione di robusta reclutamento dei neutrofili dalla circolazione, la sopravvivenza dei neutrofili prolungato nel sito di infezione e l'homing delle cellule progenitrici + KIT per l'ascesso, dove localmente danno luogo a maturare neutrofili 23. E 'probabile che processi simili hanno contribuito a infiltrazione di neutrofili nel impianto ortopedico S. modello di infezione aureus. Anche se non si sa il motivo per cui i segnali neutrofili diminuiti nel Orthopmodello di infezione aedic, potrebbe essere che la risposta immunitaria è cambiato nel corso del tempo come questa infezione progredito da una acuta infezione cronica, e questo è un argomento di indagine futura.
Ci sono limitazioni con questo modello murino di infezione protesi articolare ortopedica e la multimodalità di imaging in vivo che dovrebbe essere notato. In primo luogo, questo modello di topo è una semplificazione delle procedure reali e materiali utilizzati in chirurgia ortopedica negli esseri umani 24. Tuttavia, questo modello fa ricapitolare l'infezione cronica e conseguente infiammazione nel tessuto osseo e articolare che si vede nelle infezioni umane impianti ortopedici 8,9. In aggiunta, per ottenere le immagini μCT, relativamente basse dosi di raggi X irradiazione sono stati usati per ridurre al minimo eventuali effetti negativi sulla salute degli animali durante il corso dell'infezione. Per una migliore risoluzione delle ossa, dosi più elevate di radiazioni a raggi X potrebbero essere utilizzati per l'imaging μCT su eutanasia unnimals. Tuttavia, questo eliminerebbe la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente i cambiamenti ossei per la durata degli esperimenti.
In conclusione, l'imaging multimodale che coinvolge l'intera combinazione di imaging ottico animali in vivo con l'imaging anatomico μCT ha permesso di informazioni più complete sulla infezione e risposta infiammatoria. Inoltre, queste tecniche hanno permesso la valutazione delle conseguenze della infezione e infiammazione nel tessuto osseo e delle articolazioni. I lavori futuri potrebbe approfittare di imaging multimodale per valutare l'efficacia delle terapie antimicrobiche, le risposte immunitarie, patogenesi della malattia e dei cambiamenti reattivi nelle ossa, come abbiamo iniziato a indagare 14-18. Inoltre, l'imaging multimodale potrebbe valutare sonde e rivelatori per diagnosticare la presenza di un'infezione come precedentemente descritto in modelli animali di infezione coscia, endocardite, infettano polmonareioni e infezioni biomateriale 25-28. Infine, l'uso di immagini multimodalità potrebbe essere esteso al di là di malattie infettive e utilizzato attraverso le discipline, tra cui ortopedia, reumatologia e oncologia, di indagare altre condizioni che l'impatto del sistema muscolo-scheletrico, come il cancro scheletrico, malattia metastatica, fratture e artrite 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF sono pagati i dipendenti di PerkinElmer, che produce gli strumenti di imaging, a condizione che il Xen29 bioluminescente S. ceppo aureus, e pagato per le spese di pubblicazione di questo video-articolo. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Surgical Resident Research Scholars Program H & H Lee (a gennaio), un AO Foundation Start-Up concessione S-12-03M (a LSM) e un National Institutes of Health sovvenzione R01-AI078910 (a LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
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