Summary
Combinado de imágenes ópticas y μCT en un modelo de ratón de infección implante ortopédico, la utilización de una cepa bioluminiscente ingeniería de Staphylococcus aureus, siempre que la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente la dinámica de la infección bacteriana, así como la respuesta inflamatoria correspondiente y cambios anatómicos en la hueso.
Abstract
Formación de imágenes multimodalidad ha surgido como un enfoque tecnológico común utilizado tanto en la investigación preclínica y clínica. Las técnicas avanzadas que combinan en imágenes ópticas y μCT vivo permiten la visualización de los fenómenos biológicos en un contexto anatómico. Estas técnicas de imagen pueden ser especialmente útiles para estudiar las condiciones que el hueso impacto. En particular, las infecciones de implantes ortopédicos son un problema importante en la cirugía ortopédica clínica. Estas infecciones son difíciles de tratar debido a las biopelículas bacterianas se forman en los materiales implantados quirúrgicamente extranjeras, lo que lleva a la inflamación persistente, la osteomielitis y la eventual osteolisis del hueso que rodea el implante, que finalmente resulta en el aflojamiento del implante y el fracaso. Aquí, se utilizó un modelo de ratón de un implante de prótesis ortopédica infectado que implicó la colocación quirúrgica de un implante de Kirschner hilos en un canal intramedular en el fémur de tal manera que el extremo del implante eXtended en la articulación de la rodilla. En este modelo, los ratones LysEGFP, una cepa de ratón que tiene los neutrófilos EGFP fluorescentes, fueron empleados en conjunción con un bioluminiscente cepa de Staphylococcus aureus, que emite luz natural. Las bacterias se inocularon en las articulaciones de las rodillas de los ratones antes de cerrar el sitio quirúrgico. In vivo bioluminiscente y fluorescente de formación de imágenes se utilizó para cuantificar la carga bacteriana y la respuesta inflamatoria de neutrófilos, respectivamente. Además, las imágenes μCT se realizó en los mismos ratones para que la ubicación 3D de las señales ópticas fluorescentes bioluminiscente y podría ser co-registrado con las imágenes anatómicas μCT. Para cuantificar los cambios en el hueso con el tiempo, el volumen de hueso exterior de los fémures distales se midió en puntos de tiempo específicos utilizando un proceso de segmentación basado contorno semi-automatizado. Tomados en conjunto, la combinación de formación de imágenes in vivo bioluminiscente / fluorescente con imágenes μCT puede ser especialmente útil fo la monitorización no invasiva de la infección, respuesta inflamatoria y los cambios anatómicos en el hueso a través del tiempo.
Introduction
Multimodalidad técnicas de imagen preclínica que implican la combinación de información óptica y anatómica permiten la visualización y monitoreo de los fenómenos biológicos en 3D 1-4. Desde μCT de imágenes permite la exquisita visualización de la anatomía del hueso, el uso de imágenes μCT en conjunción con de formación de imágenes ópticas representa una combinación única que podría ser especialmente útil para la investigación de procesos que involucran la biología ósea 5-7. Un ejemplo sería el uso de estas técnicas para estudiar infecciones de implantes ortopédicos, que representan una complicación desastrosa después de procedimientos quirúrgicos ortopédicos 8,9. Bacterias biopelículas se forman en los objetos extraños implantados que promueven la supervivencia de las bacterias al servir como una barrera física que evita que las células inmunes de la detección de la infección y bloquea el acceso a los antibióticos a las bacterias 10,11. La infección crónica y persistente del tejido de las articulaciones (artritis séptica) und hueso (osteomielitis) induce la resorción ósea que conduce al aflojamiento de la prótesis y 8,9 eventual falla. Esta osteolisis periprotésica resultante se asocia con una mayor morbilidad y mortalidad 12,13.
En nuestro trabajo anterior, se utilizó in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes, junto con los rayos X y tomografía micro-computarizada (μCT) en un modelo de infección de la articulación protésica ortopédica en ratones 14-19. Este modelo implicó la colocación de un alambre de titanio Kirschner-(K-hilos) de una manera tal que el extremo cortado del implante extendida en la articulación de la rodilla de los fémures de ratones 14-19. A continuación, un inóculo de Staphylococcus aureus (cepa bioluminiscente Xen29 o Xen36) se pipeteó sobre la superficie del implante en la articulación de la rodilla antes de la zona quirúrgica se cerró 14-19. In vivo de imágenes ópticas se utilizó para detectar y cuantificar las señales bioluminiscentes, que correspondió a la number de bacterias en el tejido de las articulaciones y el hueso infectado 14-19. Además, in vivo de fluorescencia de imágenes de los ratones LysEGFP, que poseen los neutrófilos fluorescentes 20, se utilizó para cuantificar el número de neutrófilos que emigraron a las articulaciones de la rodilla infectadas que contienen los implantes K-alambre 14,19. Por último, las modalidades de imágenes anatómicas, incluyendo imágenes de alta resolución de rayos X e imágenes μCT, permite respectiva 2D y 3D la imagen anatómica del hueso afectado por toda la duración de la infección crónica, que nos arbitrariamente terminar normalmente entre 2 y 6 semanas postoperatorias 16 , 18. Utilizando este modelo, la eficacia de la terapia antimicrobiana local y sistémico, las respuestas inmunes protectoras y cambios anatómicos patológicos en el hueso podría evaluarse 14-18. En este manuscrito, los protocolos de detalle de las modalidades de imágenes ópticas y μCT en este modelo de infección articulación protésica ortopédica fueron proporcionados como Representatisistema para estudiar los procesos biológicos en el contexto anatómico del hueso ve. Estos incluyen los procedimientos quirúrgicos para modelar una infección articulación protésica ortopédica en ratones, 2D y 3D en los procedimientos de imagen óptica in vivo (para detectar señales bioluminiscentes bacterianas y señales fluorescentes neutrófilos), adquisición y análisis de imágenes μCT y co-registro de imágenes ópticas en 3D con la imágenes μCT.
Protocol
Declaración de Ética: Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales como se define en las regulaciones federales según lo establecido en la Ley de Bienestar Animal (AWA), la Guía 1996 para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Política de PHS para el Humano Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y todos los animales de trabajo fue aprobado por el Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y el empleo Comisión (Protocolo #: MO12M465).
1. bacterias bioluminiscentes Preparación del inóculo de Mid-logarítmicas
- Bioluminiscente racha S. aureus cepa Xen29 (u otra cepa bioluminscent tales como Xen36) en placas de agar de soja tríptico (caldo de soja tríptico en agar [1,5%]).
NOTA: S. aureus Xen29 21 es un S. ingeniería genética aureus cepa que contiene un operón lux modificado derivado de Photorhabdus luminescens, que se integra en un plásmido nativo estable que se encuentra en esta cepa bacteriana. Estos motoresbacterias Ered constitutivamente emiten luz a partir de células vivas y metabólicamente activas. - Cultivar las colonias en las placas mediante su incubación a 37 ° C durante aproximadamente 16 h (O / N).
- Seleccione CFU bacteriana única y la cultura en agitación TSB líquido (240 rpm) durante aproximadamente 16 horas (O / N).
- Realizar una sub-cultura con 1/50 de dilución del cultivo O / N para obtener bacterias en fase de crecimiento a medio logarítmicas (duración de aproximadamente 2 horas).
- Pellet, volver a suspender y lavar las bacterias 3x en PBS.
- Estimar el inóculos bacterianos (1 x 10 3 UFC en 2 l de PBS) mediante la determinación de la absorbancia densidad óptica a 600 nm.
- Verifique la CFU en el inóculo después de cultivar las bacterias O / N en los platos.
2. mouse Procedimientos Quirúrgicos
NOTA: Para estos experimentos, utilice una de doce semanas de edad ratones macho LysEGFP. Estos ratones poseen una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) que expresan las células mieloides (que consisten en mayorm ente neutrófilos) 20. Mantener las condiciones estériles durante la cirugía y después de la preparación quirúrgica con betadine y alcohol al 70% mediante la colocación de cada ratón en un campo estéril en la parte superior de una superficie dura que circula agua almohadilla de calefacción. Utilizar bata, guantes estériles, mascarilla y esterilizar los instrumentos.
- Anestesiar al ratón usando una inhalación de 2% de isoflurano. Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Evaluar el nivel apropiado de anestesia mediante la observación de la frecuencia respiratoria, el tono muscular, pizca dedo del pie, reflejo corneal y el color de las membranas mucosas. Cubra los ratones con un paño quirúrgico estéril con un agujero en el sitio de la cirugía en la rodilla derecha. El ratón debe recibir medidas de apoyo de calefacción para mantener la temperatura del cuerpo, mientras que bajo anestesia. Caliente 37 ° C el agua que circula en una manta con camisa de agua caliente o una estación de trabajo de circulación de agua dura se calienta plástico (ProStation, Patterson, la Ciencia) son buenas maneras de prevenir la hipotermia.
- Inyectar buprenorphine (formulación de liberación sostenida) (2,5 mg / kg) por vía subcutánea justo antes de la cirugía. Dosis adicionales de buprenorfina de liberación sostenida pueden administrarse a intervalos de 3 días, según sea necesario para la analgesia.
- Afeitarse la rodilla operativa y preparar utilizando tres matorrales alternas utilizando betadine y alcohol al 70%.
- Realice una incisión en la piel que recubre la articulación de la rodilla derecha. Extender la incisión de la piel de modo que el mecanismo extensor puede estar bien definida.
- Realizar una artrotomía medial parapatellar y subluxarse mecanismo extensor tendón del cuádriceps-patelar lateralmente con una pinza Adson.
NOTA: Esto devuelve la escotadura intercondílea del fémur en plena vista. - Escariar manualmente el canal intramedular utilizando una aguja de 25 G seguida de una aguja 23 T.
Nota: Para evitar daños en el fémur, una plataforma de estabilización se puede utilizar. Esto debería ser importante para la técnica para reducir al mínimo una fractura accidental del fémur. - Inserte un Kirsc titanio de grado médicoHübner hilos (0,8 mm de diámetro) usando una técnica de ajuste a presión, lo que implica empujar manualmente usando un soporte de pasador, en una dirección retrógrada en el canal intramedular.
NOTA: Titanium agujas de Kirschner se utilizaron como hubo menos artefactos observados en las imágenes μCT con titanio agujas de Kirschner en comparación con los de acero inoxidable agujas de Kirschner 16. - Cortar el extremo de la Kirschner hilos con cortadores de perno de modo que el extremo cortado del alambre de Kirschner se extiende aproximadamente 1 mm en el espacio de la articulación de la rodilla.
- Utilizando una micropipeta, pipetas 2 l de 1 x 10 3 UFC de S. bioluminiscente aureus Xen29 en la punta del implante dentro del espacio de articulación de la rodilla.
NOTA: Más volumen lleva a la contaminación de los tejidos más ancho y menos de imagen discreta.
NOTA: En los ratones no infectados de control, añadir 2 l de solución salina estéril sin cualquier bacteria. - Reducir el complejo cuádriceps-patelar volver a la línea media con unas pinzas y cerrar el tejido subcutáneo y la piel suprayacente usando absorbiblesuturas subcuticulares.
NOTA: No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. - Al final de los experimentos, sacrificados todos los animales que utilizan carbón inhalación de dióxido según las directrices de la Johns Hopkins Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Verifique la muerte mediante la observación de que el animal no se recupera en 10 minutos después de que termine la exposición de dióxido de carbono y la dislocación cervical.
3. 2D Optico (En vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes)
- Anestesiar LysEGFP ratones (por ejemplo, 2% de isoflurano inhalación) y colocarlos con el lado ventral hacia arriba en una cámara de imágenes.
- Lleve a cabo in vivo bioluminiscente de imágenes usando el animal entero óptica IVIS Spectrum sistema de imágenes en vivo. En primer lugar, comprobar luminiscentes y confirmar la elección de un f abiertoselección ilter, campo de visión (FOV) C - 13 cm, y desplácese hacia abajo para tiempo de exposición Automático (ajuste de exposición automática). La exposición automática se ajusta automáticamente el tiempo de adquisición (velocidad de obturación), hurgar en la basura (binning píxel digital), y f-stop (apertura) del instrumento para optimizar la intensidad de la señal, evitando la saturación. Luego haga clic en Adquirir para capturar la imagen bioluminiscente.
NOTA: Para obtener imágenes in vivo bioluminiscente, los ratones de imagen entre 1 - 5 min. - Realizar secuencial en imágenes fluorescentes vivo marcando la casilla al lado de fluorescente. Elija el filtro de excitación 465 nm y 520 nm filtro de emisión. Desplácese hacia abajo para el tiempo de exposición automático y seleccione FOV C (Paso 3.2.1). Luego haga clic en Adquirir para capturar la imagen de fluorescencia.
NOTA: Para vivo de imágenes de fluorescencia, los ratones de imagen entre 0,5 seg. - Cuantificar los in vivo señales bioluminiscentes como flujo total (fotones / s) en una región de interés (ROI) mediante Vivir software de imagen mediante la ampliación de la primeraSección Herramientas de ROI de la paleta de herramientas.
- Seleccione el icono del círculo y el número de regiones de interés que se corresponden con el número de animales sometidos en el campo de visión. Cambiar el tamaño de la ROI para abarcar la región de interés es decir, el patrón de difusión bioluminiscente recogió.
- Aparece seleccione ROIs Medida en Herramientas de ROI en la paleta de herramientas y la ventana de medición del ROI. Totales valores de radiancia (fotones / seg) representan la suma de los píxeles dentro de la ROI bioluminiscentes generado.
- Elija Seleccionar todo y pestañas de la copia en la esquina inferior derecha de esta ventana se transferirá la información en el portapapeles y permitir pegar en programas posteriores para su análisis.
- Cuantificar las señales fluorescentes in vivo como la eficiencia radiante total ([fotones / s] / [mW / cm 2]) dentro de una región circular de interés (ROI) usando el software Image habitable.
- Dentro de la ventana del software Living Imagen, expanda Herramientas de ROI en la paleta de herramientas. Seleccioneel icono del círculo y el número de regiones de interés que corresponde al número de animales sometidos en el campo de visión.
- Cambiar el tamaño de la ROI para abarcar la región de interés que corresponde estrechamente a la señal bioluminiscente de la adquisición de la imagen anterior.
- Aparece seleccione ROIs Medida en Herramientas de ROI en la paleta de herramientas y la ventana de medición del ROI.
NOTA: Total de Eficiencia Radiante ([fotones / s] / [mW / cm 2]) representa la suma de píxeles fluorescentes dentro de la ROI. - Seleccione Todos y Copiar pestañas en la esquina inferior derecha de esta ventana se transferirá la información en el portapapeles y permitir pegar en programas posteriores para su análisis.
4. μCT Image Acquisition
- Coloca los ratones anestesiados LysEGFP en una cámara de imágenes.
NOTA: Este cámara de imágenes está diseñado para encajar tanto en el sistema de formación de imágenes IVIS Spectrum y el Quantum FX in vivo μCT sistema de imágenes para permitirco-registro de las imágenes ópticas y μCT. - Abra el software CT y seleccione el menú preestablecido 60 mm std FOV dinámico en el menú desplegable.
- Inserte la cubierta de gran calibre y el brazo adaptador para el servicio de transporte de imágenes en el instrumento.
- Coloque el traslado de imágenes del ratón en el adaptador brazo empuje el brazo en el agujero y cierre la puerta. Activar el modo Live (el Botón del ojo en el Panel de control) y la posición del sujeto en la posición de 0 ° y 90 ° de pórtico con el eje X y controles del eje Y para centrar el animal en la ventana X captura. A continuación, apague el modo en vivo haciendo clic en el botón de ojos.
- Adquirir una imagen de la exploración dinámica con el campo de visión de 60 mm haciendo clic en el botón CT Scan (al lado del botón de modo en vivo). Exportar la imagen adquirida en el formato DICOM y guárdela en un lugar que se puede acceder más tarde.
NOTA: La dosis aproximada será de 26 mGy por exploración. Un FOV 30 mm se puede utilizar si se desea una mejor resolución.
5.3D de imagen óptica Adquisición, Formación y μCT Co-registro
- Coloque el traslado de inserción de imagen del ratón en el Spectrum situando la lanzadera de imágenes que contiene el ratón en este prospecto y garantizar el ratón no se mueve.
- El uso de imagen de estar, seleccione Asistente de imagen en el panel de control de adquisición para comenzar el asistente de configuración. Para empezar, elija bioluminiscencia, luego DLIT y, a continuación, seleccione los reporteros "Bacterias" en el menú desplegable y los filtros de emisión adecuados para el modelo será elegido de forma automática, en este caso, 500 - 620 nm.
- Seleccione Siguiente y luego designar a los parámetros de adquisición e información sujeta en la ventana final. En concreto, Imaging Asunto será Mouse, Configuración Auto serán seleccionados permitiendo la exposición automática para maximizar la calidad de la señal, evitando la saturación y el campo de visión se establecerá en C - 13 cm.
- Seleccione Finalizar en la última ventana y la ventana de secuencia del panel de Adquisición será unutomatically poblada con la secuencia DLIT. Habrá una imagen adquirida por filtro de emisión elegido y la exposición automática escogerá los ajustes óptimos en cada longitud de onda según las selecciones del Asistente de imagen. La secuencia generada también incluye una imagen de luz estructurada necesaria para la generación de superficie sujeto a través de la herramienta de topografía de la superficie se detalla a continuación.
- Seleccione Secuencia Acquire para adquirir los datos DLIT.
- Después de la adquisición de la imagen se completa, generar la topografía de la superficie. Comience por la ampliación de la ficha Topografía de superficie bajo la paleta de herramientas.
- A continuación, seleccione la orientación que refleje con precisión la parte del animal frente a la cámara o la parte superior del instrumento IVIS. Luego haga clic en Generar Superficie. Recortar la región del FOV que contiene el animal.
- A continuación, utilice la máscara púrpura para definir los límites de la animal.
NOTA: La herramienta de enmascaramiento utiliza contraste de color para que los animales con pelaje oscuro o piel no enmascarar adecuadamente desde el stage. - Seleccione Finalizar y la superficie aparecerá automáticamente. Guardar el resultado en la ficha Topografía superficial a continuación, cierre la pestaña como ya no lo necesitaremos.
- Reconstruir la posición de la fuente óptica 3D usando los algoritmos de reconstrucción ópticas difusas aplicadas en Vivir imagen 22 mediante la ampliación de la ficha DLIT Reconstrucción 3D.
- Se muestran imágenes adquiridas para la secuencia DLIT.
NOTA: El software comprueba automáticamente la calidad de los datos adquiridos y anular la selección de las imágenes consideradas demasiado tenue o en la saturación está presente. Seleccione Inicio en la parte inferior derecha. - Si es necesario, se puede ajustar el umbral para cada imagen bioluminiscente haciendo doble clic y mediante el control deslizante de umbral en la parte inferior izquierda.
NOTA: esto es principalmente para incluir señal de menor intensidad y hay que ser practicado cuando thresholding superior ya que puede ajustar la intensidad global de la fuente reconstruida final.
- Se muestran imágenes adquiridas para la secuencia DLIT.
- Abra el navegador DICOM haciendo clic en el icono 3D en la barra de herramientas en la parte superior del software (tercero desde la izquierda) y la búsqueda de la imagen Quantum FX adquirido previamente.
- Cargue esta imagen en la Sala Imagen Vista 3D pestaña haciendo doble clic en el archivo de importación.
NOTA: El fiduciario debe ser detectada automáticamente y el resultado en la imagen μCT se ha registrado en la óptica de la imagen 3D.
- Cargue esta imagen en la Sala Imagen Vista 3D pestaña haciendo doble clic en el archivo de importación.
- Desmarque la topografía de la superficie de visualización del mapa al ampliar Equipamiento Óptico 3D en la paleta de herramientas y anulando la selección de la casilla de verificación Mostrar la etiqueta Asunto de superficie en la pestaña de superficie.
- Crear manualmente una tabla de búsqueda para visualizar el esqueleto y el implante de Kirschner que son visibles en la imagen μCT usando el histograma en la ficha Volumen del 3D Multi-Modalisección Herramientas ty de la paleta de herramientas.
- El histograma representa la distribución de las intensidades de voxel en los datos volumétricos en 3D y su opacidad color. Para determinar dónde el tejido particular de interés es en el histograma, utilice la herramienta de control deslizante para la prestación de umbral hasta que el tejido o estructura es visible.
- Luego haga clic derecho en el histograma para generar puntos y formar una curva para aislar esa zona del histograma. Esto se repetirá para cada estructura - esqueleto seguido por el implante de Kirschner y se puede guardar como una tabla de consulta para futuros análisis.
- Los componentes pueden ser codificados por color si así lo desea haciendo doble clic en cualquier punto generado en el histograma y seleccionar el color que desee en la ventana emergente.
6. μCT Visualización y Análisis de Imágenes
- Utilizando el software de Quantum FX, seleccione la imagen de interés y poner en marcha el Visor. Seleccione la herramienta de rotación y reorientar la imagen para visualize el eje longitudinal del fémur. Seleccione la herramienta de medición y medir la longitud del fémur.
- Inicie el Visor 3D para generar representaciones 3D. Ajustar el umbral para mostrar los cambios en la anatomía del hueso asociados con la infección del implante.
- Aplicar planos de recorte de modo que la representación 3D se limita a la sección transversal deseada de la zona de interés en el fémur distal.
- Inicie el paquete de software Analizar 11.0. Cargue el archivo * .vox que se utilizó para crear un renderizado en 3D.
- Inicie la herramienta Calculadora de imagen. Utilice la herramienta 'Región Pad' para recortar la imagen (quitar aviones que no incluyen el fémur).
- Inicie la herramienta Secciones oblicua. Utilice la opción 3 puntos para encontrar puntos en la mitad del fémur, trocánter mayor y el extremo del pasador. Hacer estos puntos un plano oblicuo y generar una imagen con nuevos cortes.
- Lanzamiento de la Región de herramienta de interés. Mostrar las rebanadas transaxiales. Ajustar el mínimo y el valor máximos para visualizar el hueso cortical. Crear contornos para las rodajas correspondientes durante varias rodajas (con un intervalo aproximado de 5 rebanadas) para las rodajas correspondientes a la distal 25% del fémur. Utilice la herramienta de "Propagar las Regiones para interpolar entre estos contornos y crear una región 3D de interés. ¡Guarda esta región de interés como un objeto de mapa.
- Inicie la herramienta de 'Opciones de muestra'. Seleccione la casilla de verificación del objeto de mapa que acaba de crear y seleccione los botones de selección para las opciones apropiadas. Haga clic en el botón "Configurar Log Estadísticas 'para confirmar que se ha seleccionado la casilla de verificación' Volumen '. Haga clic en el botón 'Imágenes de Muestra "para hacer las mediciones reales.
- Exportar las mediciones de volumen en un programa de análisis de datos. Normalizar los volúmenes óseos exteriores de puntos de tiempo posteriores a la primera punto de tiempo de imágenes utilizando la fórmula: Volumen Δ (%) = ([Volumen (día X) - Volumen (día 2)] / [Volumen (día 2)]) x 100 .
NOTA: En esta fórmula, la variable "X" representa el lugar de interés vez. El número resultante representará el cambio en el tamaño del volumen de hueso exterior del fémur distal a través del tiempo. - Para visualizar la región de interés en 3D en la parte superior del hueso, cargar la imagen de la TC en la herramienta 'Volume Render'. Cargue el objeto de mapa que contiene la región 3D de interés. Ir a 'View''Objects ", fije la' original 'para ser' On '. Abra la ventana "Vista previa". Inicie el menú 'Render Tipos' y seleccione 'composición de objetos'.
- Haga clic en el botón 'Threshold' y la herramienta y ajustar los umbrales para mostrar el mapa de hueso y objeto. Utilice el mismo rango de umbral fijo para todos los puntos de tiempo. Haga clic en el botón "Rotación" y establecer la orientación para ser un verdadero vista anterolateral. Haga clic en "Render" para generar el renderizado final. Guarde la prestación de la principal 'VolumenRender 'ventana.
Representative Results
En bioluminiscente vivo e imágenes fluorescentes
En el presente estudio, el protocolo se describe para este modelo publicado previamente de una infección conjunta de prótesis ortopédica en ratones 14-19, que implica la colocación quirúrgica de un implante de K-alambre de titanio que se extiende desde un canal intramedular en el fémur en la articulación espacio de 14 a 19. S. aureus cepa bioluminiscente Xen29 (1 x 10 3 UFC en 2 l de PBS) se pipeteó directamente en la parte superior del implante de titanio fin en la articulación de la rodilla antes de cerrar el sitio quirúrgico 16. Para visualizar y cuantificar la carga bacteriana y neutrófilos afluencia de forma no invasiva en ratones anestesiados LysEGFP, se realizó de imágenes ópticas animal completamente en vivo secuencialmente imagen las señales bioluminiscentes de las bacterias y las señales fluorescentes EGFP de los neutrófilos que infiltran utilizando el animal completamente óptica IVIS Spectrum en vivosistema de imágenes en tres días del postoperatorio (es decir, días 2, 14 y 28). Las señales bioluminiscentes de ratones infectados por Xen29 mantuvieron por encima de las señales de fondo de ratones sham-infectados durante la duración del experimento (Figura 1 A, C) 16. Nuestro trabajo anterior demostró que las señales bioluminiscentes in vivo aproximadas estrechamente el número de CFU ex vivo aislados del / tejido óseo conjunta y adherente a los implantes 17,18. Además, las señales fluorescentes EGFP fueron mayores que los ratones de simulacro infectadas en los puntos de tiempo tempranos, pero se acercaron a los niveles de fondo durante el curso de la infección (Figura 2B, C) 16.
Co-registro 3D de las señales ópticas en vivo con imágenes μCT
Para visualizar las señales ópticas (señales es decir, bioluminiscentes bacteriana y fluorescentes EGFP) en el contexto anatómica de las articulaciones de la rodilla post-quirúrgicas in 3D, las imágenes ópticas generadas utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum fueron co-registradas con imágenes μCT generados usando el sistema de imágenes de Quantum FX μCT. Esta co-registro podría lograrse porque la cámara de imágenes de ratón podría ser insertado en cualquiera de las máquinas para asegurar que los ratones estaban en la misma orientación exacta. Para verificar esta precisión, los resultados se compararon con una adquisición de imágenes realizado mediante el CT Spectrum-in vivo del sistema de formación de imágenes IVIS que integra ambas modalidades en un instrumento sin requerir reubicación física del animal. Para asignar los datos óptica sobre las imágenes μCT en 3D, se utilizó una tomografía óptica difusa algoritmo de reconstrucción 16. La reconstrucción 3D resultante se muestra (Película 1).
Además, las imágenes μCT permite la visualización y cuantificación de los consiguientes cambios en la calidad y dimensiones de los huesos que se produjo durantela infección (Figura 2) 16. Como se informó anteriormente, el volumen de hueso exterior del fémur distal aumentó considerablemente con el tiempo (Figura 2A) 16. Para cuantificar estos cambios, se realizó análisis de imagen volumétrica 3D en el distal 25% de la superficie ósea de fémur y los cambios en el volumen de hueso con el tiempo se normalizaron al volumen inicial del hueso. El volumen de hueso exterior aumentó considerablemente en los ratones infectados en comparación con ratones infectados de manera simulada (Figura 2B) 16. El aumento en el volumen de hueso fémur distal exterior era probablemente debido a daño óseo causada por la infección del tejido y el hueso articular, que se observaron utilizando μCT de formación de imágenes y el análisis histológico 16.
Figura 1. 2D in vivo señales fluorescentes y bioluminiscentes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y ratones LysEGFP fueron imágenes utilizando el sistema de imágenes IVIS Spectrum 16. (A) Media in vivo señales bioluminiscentes medida por flujo total (fotones / seg) ± sem. (B) La media in vivo EGFP señales fluorescentes, medido por el total de la eficiencia radiante (fotones / s) / (mW / cm 2) ± sem. (C) Representación en vivo bioluminiscente y señales fluorescentes superpuestos en una fotografía en blanco y negro imagen de los ratones. El límite de detección de la carga bacteriana in vivo usando bioluminiscente de imágenes es de entre 1 x 10 2 y 1 x 10 3 UFC. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Por favor,en cuenta que es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados usando Xen29 y fotografiados con el sistema de imágenes IVIS Lumina XR 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. 3D μCT imágenes. S. aureus Xen29 o no bacterias (no infectados) se inocularon en la articulación de la rodilla después de la colocación de Kirschner y los ratones fueron imágenes utilizando el Quantum FX en vivo sistema μCT. (A) Representante representaciones 3D μCT de Xen29 ratones infectado con (paneles superiores) y los ratones sham infectados (paneles inferiores). (B) Porcentaje de cambio de volumen de hueso exterior (25% distal de los fémures) normalizada a la TI inicialme punto (media ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 ratones infectados Xen29 frente a los ratones sham-infectados (prueba t de Student [dos colas]). Tenga en cuenta que esto es una figura representativa que incluya los datos publicados previamente generados utilizando la cepa bioluminiscente S. aureus Xen29 y fotografiada con el FX en vivo μCT sistema 16 imágenes Quantum. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1 . Representante 3D co-registro anatómico de las señales bioluminiscentes Xen29 y las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos en combinación con las imágenes μCT. Las imágenes se giran en el eje vertical.
Discussion
La multimodalidad de imágenes tales como las técnicas de imagen que utilizan en imágenes ópticas vivo en conjunción con las imágenes μCT proporciona un nuevo enfoque tecnológico que permite la visualización 3D, la cuantificación y el seguimiento longitudinal de los procesos biológicos en un contexto anatómico 1-4. Los protocolos en el presente estudio proporcionan información detallada de cómo in vivo bioluminiscente y fluorescente de imágenes pueden ser combinadas con imágenes μCT en un modelo de infección ortopédica protésica del implante en ratones para monitorizar la carga bacteriana, inflamación neutrofílica y cambios anatómicos en el hueso de forma no invasiva y longitudinalmente más tiempo. En su conjunto, la información obtenida mediante la combinación de imágenes ópticas y estructural representa un importante avance tecnológico, que puede ser especialmente adecuado para estudiar los procesos biológicos y las condiciones patológicas que afectan al sistema músculo-esquelético.
Un interéshallazgo ción que debe señalarse es que se observó que las señales fluorescentes-EGFP neutrófilos disminuyó a los niveles de fondo por 14 a 21 días y se mantuvo en los niveles de base para la duración del experimento a pesar de la presencia de bacterias bioluminiscentes. Es poco probable que la irradiación de rayos X afectado la supervivencia de neutrófilos como se observó una cinética similar de las señales de neutrófilos en ratones no irradiados 19. En nuestro trabajo anterior que implica un modelo de S. heridas infectadas aureus, la infiltración de neutrófilos participan una combinación robusta de reclutamiento de neutrófilos de la circulación, la supervivencia prolongada de los neutrófilos en el sitio de infección y el homing de las células progenitoras KIT + para el absceso, donde localmente dan lugar a madurar neutrófilos 23. Es probable que los procesos similares contribuyeron a la infiltración de neutrófilos en el implante ortopédico S. modelo de infección aureus. Aunque se desconoce por qué las señales de neutrófilos disminuyó en el orthopmodelo de infección aédico, podría ser que la respuesta inmune cambió con el tiempo como esta infección progresó de una infección aguda a crónica y este es un tema de investigación futura.
Existen limitaciones con este modelo de ratón de infección articular protésica ortopédica y el vivo de imágenes multimodalidad en que debe señalarse. En primer lugar, este modelo de ratón es una simplificación de los procedimientos reales y los materiales utilizados en cirugía ortopédica en seres humanos 24. Sin embargo, este modelo hace recapitular la infección crónica y la inflamación resultante en el hueso y tejido de las articulaciones que se ve en las infecciones de implantes ortopédicos humanos 8,9. Además, para obtener las imágenes μCT, se utilizaron dosis relativamente bajas de irradiación de rayos X para minimizar los efectos adversos sobre la salud de los animales durante el curso de la infección. Para mejorar la resolución de hueso, dosis más altas de radiación de rayos X podría ser utilizado para obtener imágenes de μCT en un sacrificadosnimals. Sin embargo, esto eliminaría la capacidad de supervisar de forma no invasiva y longitudinalmente los cambios en el hueso largo de la duración de los experimentos.
En conclusión, las imágenes multimodalidad que implica la combinación de imágenes ópticas animal completamente en vivo con imágenes μCT anatómica ha permitido obtener información más completa sobre la infección y la respuesta inflamatoria. Además, estas técnicas han permitido la evaluación de las consecuencias de la infección y la inflamación en el hueso y tejido de las articulaciones. El trabajo futuro podría aprovecharse de formación de imágenes multimodalidad para evaluar la eficacia de las terapias antimicrobianas, las respuestas inmunes, la patogénesis de la enfermedad y los cambios reactivos en el hueso como hemos comenzado a investigar 14-18. Además, las imágenes multimodalidad podría evaluar sondas y marcadores para diagnosticar la presencia de una infección como se describió previamente en modelos animales de una infección del muslo, endocarditis, Infect pulmonariones y las infecciones de biomateriales 25-28. Por último, el uso de la proyección de imagen multimodalidad podría expandirse más allá de las enfermedades infecciosas y se utiliza en todas las disciplinas, incluyendo ortopedia, reumatología y oncología, para investigar otras condiciones que impactan el sistema músculo-esquelético, como el cáncer óseo, enfermedad metastásica, las fracturas y la artritis 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF se pagan los empleados de PerkinElmer, que fabrica los instrumentos de imagen, siempre que el Xen29 bioluminiscente S. aureus cepa, y pagó por los gastos de publicación de este video-artículo. El resto de los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un programa de H & H Lee Investigación Residente Quirúrgico Eruditos (a JAN), una Fundación AO Start-Up subvención S-12-03M (a LSM) y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-AI078910 (a LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
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