Summary
בשילוב הדמיה אופטית וμCT במודל של עכברים של זיהום שתל אורתופדים, ניצול זן מהונדס bioluminescent של Staphylococcus aureus, סיפק את היכולת noninvasively ואורכים כדי לפקח על הדינמיקה של זיהום החיידקים, כמו גם את התגובה הדלקתית המקבילה ושינויים אנטומיים ב עצם.
Abstract
ההדמיה Multimodality התפתחה כגישה טכנולוגית נפוצה בשימוש הן במחקר קליני ופרה קליני. טכניקות מתקדמות המשלבות בהדמיה אופטית וμCT vivo לאפשר להדמיה של תופעות ביולוגיות בהקשר האנטומי. שיטות הדמיה אלה עשויות להיות שימושיות במיוחד ללחקור את תנאים שעצם ההשפעה. בפרט, זיהומי שתל אורתופדים הם בעיה חשובה בניתוח אורתופדים קליני. זיהומים אלה הם קשים לטיפול, כי biofilms חיידקים להיווצר על החומרים מושתלים בניתוח הזר, שמוביל לדלקת מתמשכת, דלקת עצם וosteolysis סופו של דבר העצם סביב השתל, אשר בסופו גורם להתרופפות שתל וכישלון. כאן, במודל עכבר של השתלה תותבת אורתופדים נגוע שימש שמעורב המיקום כירורגית של שתל קירשנר תיל לתוך תעלת intramedullary בירך בצורה כזו כי בסופו של דואר השתלxtended לתוך מפרק הברך. במודל זה, עכברי LysEGFP, זן עכבר שיש לו נויטרופילים EGFP-ניאון, הועסקו בשיתוף עם זן Staphylococcus aureus bioluminescent, אשר באופן טבעי פולט אור. החיידקים היו מחוסן למפרקי הברך של העכברים לפני סגירת האתר כירורגית. Bioluminescent בחי ודימות פלואורסצנטי שימשה לכמת את נטל החיידקים ותגובה דלקתית נויטרופילים, בהתאמה. בנוסף, ההדמיה μCT בוצעה באותו עכברים, כך שמיקום 3D של bioluminescent ואותות אופטיים ניאון יכול להיות שותף רשום עם תמונות μCT אנטומיים. כדי לכמת את השינויים בעצמות לאורך זמן, החיצוני עצם הנפח של עצמות הירך הדיסטלי נמדדו בנקודות זמן ספציפיות באמצעות תהליך פילוח גובה מבוסס חצי אוטומטי. יחדיו, השילוב של in vivo bioluminescent הדמיה ניאון / עם ההדמיה μCT עשוי להיות שימושי במיוחד fאו הניטור בלתי פולשני של הזיהום, תגובה דלקתית ושינויים אנטומיים בעצמות לאורך זמן.
Introduction
טכניקות הדמיה פרה קלינית Multimodality שכרוכה בשילוב של מידע אופטי ואנטומיים מאפשרות הדמיה וניטור של תופעות ביולוגיות ב3D 1-4. מאז ההדמיה μCT מאפשרת הדמיה המעולה של האנטומיה עצם, תוך שימוש בהדמית μCT בשיתוף של עם הדמיה אופטית מייצגת שילוב ייחודי שעשויה להיות שימושי במיוחד לחקירת תהליכים הכרוכים בביולוגית עצם 5-7. דוגמא תהיה להשתמש בטכניקות אלה כדי ללמוד זיהומי שתל אורתופדים, המייצגים סיבוך הרסני הבאים ניתוחים אורתופדיים 8,9. biofilms חיידקים להיווצר על העצמים הזרים מושתלים שמקדמים הישרדות של החיידקים על ידי המשרת כמחסום פיזי המונע מתאי מערכת חיסון חישת האנטיביוטיקה הזיהום וחוסם את הגישה לחיידקים 10,11. הזיהום הכרוני ומתמשך של רקמת מפרקים (דלקת מפרקים ספיגה)עצם ד (אוסטאומיאליטיס) גורם ספיגת עצם שמובילה להתרופפות של התותבת ו8,9 כישלון סופו של דבר. osteolysis periprosthetic וכתוצאה מכך זה קשור לתחלואה מוגברת ו12,13 תמותה.
בעבודה הקודמת שלנו, bioluminescent in vivo ודימות פלואורסצנטי שימש יחד עם X-ray והדמיה טומוגרפיה-מחושב מיקרו (μCT) במודל משותף זיהום תותב אורתופדים בעכברי 14-19. מודל זה מעורב הצבת טיטניום קירשנר תיל (K-wire) באופן כזה שסופו של דבר הקיצוץ של השתל הורחב במפרק הברך מעצמות הירך של עכברי 14-19. הבידוד של Staphylococcus aureus (זן bioluminescent Xen29 או Xen36) היה אז pipetted על פני השטח של השתל במפרק הברך לפני האתר כירורגית נסגר 14-19. בvivo הדמיה אופטית שימשה לזהות ולכמת את אותות bioluminescent, ש תואם את נוmber של חיידקים ברקמה משותפת ועצם הנגוע 14-19. בנוסף, in vivo הקרינה הדמיה של עכברי LysEGFP, אשר מחזיקים נויטרופילים ניאון 20, שימש לכמת את המספרים של נויטרופילים שהגרו למפרקי הברך הנגועים המכילים את שתלי K-תיל 14,19. לבסוף, שיטות הדמיה אנטומיים, כולל ההדמיה רנטגן ברזולוציה גבוהה והדמיה μCT, מותר 2D המתאים והדמיה אנטומית 3D של העצם המושפע על פני כל משך הזיהום כרוני, שבו אנו באופן שרירותי יסתיימו בדרך כלל בין 2 ל 6 שבועות לאחר ניתוח 16 , 18. באמצעות מודל זה, את היעילות של טיפול מקומי ומערכתי נגד חיידקים, תגובות חיסוניות הגנתיות ושינויים אנטומיים פתולוגיים בעצמות יכולה להיות מוערכת 14-18. בכתב היד הזה, פרוטוקולים מפורטים לשיטות הדמיה אופטיות וμCT במודל תותב אורתופדים זו משותף זיהום נמסרו כrepresentative מערכת ללמוד תהליכים ביולוגיים בהקשר האנטומי של העצם. אלה כוללים ניתוחים למודל זיהום משותף תותב אורתופדים בעכברים, 2D and 3D בהליכי הדמיה אופטית vivo (כדי לזהות אותות bioluminescent חיידקים ואותות נויטרופילים ניאון), רכישת μCT הדמיה וניתוח ושיתוף רישום של תמונות אופטיות 3D עם תמונות μCT.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל בעלי החיים טופלו בהתאם קפדן עם פרקטיקה של בעלי חיים טובים כהגדרתו בתקנות הפדרליות, כמפורט בצער בעלי החיים החוק (AWA), המדריך 1996 לטיפול והשימוש בחי מעבדה ומדיניות PHS להומניות טיפול ושימוש בחיות מעבדה ואת כל העבודה בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (# פרוטוקול: MO12M465).
.1 חיידקים Bioluminescent הכנת הבידוד של אמצע לוגריתמים
- bioluminescent Streak ס זן aureus Xen29 (או מתח bioluminscent אחר כגון Xen36) על גבי צלחות אגר סויה tryptic (מרק סויה tryptic באגר [1.5%]).
הערה: ס aureus Xen29 21 הוא ס מהונדס גנטי זן aureus המכיל אופרון לוקס שונה הנגזר מluminescens Photorhabdus, אשר משולב לתוך פלסמיד ילידים יציב שנמצא בזן חיידקים זה. מנוע אלהחיידקי ered constitutively לפלוט אור מתאי חיים ומטבולית פעילים. - לגדול מושבות על הצלחות על ידי דוגריהם על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 16 שעה (O / N).
- בחר CFU חיידקים בודד ותרבות ברועד TSB הנוזלי (240 סל"ד) למשך כ 16 שעה (O / N).
- בצע תת תרבות עם 1/50 דילול של O / תרבות N להשיג חיידקי שלב צמיחת אמצע לוגריתמים (משך כ 2 שעות).
- גלולה, resuspend ולשטוף את החיידקים פי 3 בPBS.
- להעריך את inocula החיידקים (1 x 10 3 CFU ב2 μl PBS) על ידי קביעת ספיגת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר.
- ודא CFU בבידוד לאחר culturing החיידקים O / N על צלחות.
2 ניתוחי עכבר
הערה: לניסוי הבאים, להשתמש בעכברי LysEGFP זכר בן שתים שבועות. עכברים אלו להחזיק משופרים חלבון ירוק ניאון (EGFP) לבטא בתאי מיאלואידית (אשר מורכבים מ 'ostly נויטרופילים) 20. לשמור על תנאים סטריליים בזמן ניתוח ואחרי הכנה כירורגית עם בטאדין ואלכוהול 70% על ידי הצבת כל עכבר על וילון סטרילי על גבי מים משטח קשים במחזור כרית חימום. השתמש בשמלה, כפפות סטריליות, מסכה ולעקר מכשירים.
- להרדים את העכבר באמצעות שאיפת 2% מisoflurane. השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. להעריך את הרמה המתאימה של הרדמה על ידי התבוננות קצב הנשימה, טונוס שרירים, קמצוץ הבוהן, רפלקס בקרנית וצבע של קרומים ריריים. כסה עכברים עם וילון ניתוח סטרילי עם חור באתר הניתוח בברך הימנית. העכבר צריך לקבל אמצעי חימום תומכים כדי לשמור על טמפרטורת גוף בעת הרדמה. מים C חמים 37 מעלות במחזור שמיכת מים במקטורן חמה או מים במחזור קשה תחנת עבודה מחוממת פלסטיק (ProStation, פטרסון, מדעי) הם דרכים טובות כדי למנוע היפותרמיה.
- הזרק buprenorphine (ניסוח מתמשך שחרור) (2.5 מ"ג / קילוגרם) תת עורי רק לפני הניתוח. מנות נוספות של עצירות ממושכות לשחרור עשויות להינתן ב3 מרווחי יום לפי צורך לשיכוך כאבים.
- לגלח את הברך האופרטיבית ומכין באמצעות שלושה סקראבס לסירוגין באמצעות בטאדין ואלכוהול 70%.
- בצע חתך קו האמצע בעור שמעל מפרק הברך ימין. להאריך את החתך בעור, כך שמנגנון פושטי יכול להיות מוגדר היטב.
- בצע arthrotomy parapatellar המדיאלי וsublux מנגנון פושטי גיד שריר הירך-patellar רוחבי עם מלקחיים Adson.
הערה: זה מביא את חריץ intercondylar של עצם הירך לעין רגיל. - ידני לקדד תעלת intramedullary באמצעות מחט 25 G ואחריו מחט 23 G.
הערה: כדי למנוע נזק לעצם ירך, יכולה לשמש פלטפורמת ייצוב. זה צריך להיות חשוב לטכניקה כדי למזער בר מקרי של עצם הירך. - הכנס Kirsc טיטניום כיתה רפואיתhner תיל (0.8 מ"מ קוטר) על ידי שימוש בטכניקת קיבוע, שמשמעותה לדחוף ידני אותו באמצעות בעל פינים, בכיוון מדרדר לתוך תעלת intramedullary.
הערה: טיטניום K-חוטים שמשו כהיו פחות חפצים לראות בתמונות μCT עם K-חוטי טיטניום לעומת K-חוטי נירוסטה 16. - חותך את הקצה של קירשנר התילים עם חותכי פינים, כך שסוף החתך של K-החוט מאריך כ 1 מ"מ לתוך חלל מפרק הברך.
- באמצעות micropipette, פיפטה 2 μl של 1 x 10 3 CFU של ס bioluminescent aureus Xen29 על הקצה של השתל בתוך חלל מפרק הברך.
הערה: יותר נפח מוביל לזיהום רקמות רחב יותר ופחות הדמיה בדידה.
הערה: בעכברים נגוע שליטה, להוסיף 2 μl של תמיסת מלח סטרילית ללא כל חיידקים. - להפחית מורכבת שריר ירך-פיקה חזרה לקו האמצע באמצעות מלקחיים ולסגור את הרקמה התת עורית שמעליה והעור באמצעות נספגיםתפרי subcuticular.
הערה: אל תשאיר את בעלי חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. אל תחזור חיה שעברה ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. - בסופו של הניסויים, מורדמים כל בעלי החיים באמצעות משאיפת פחמן דו חמצני על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים ועדת השימוש בג'ונס הופקינס. ודא מוות על ידי התבוננות בבעלי החיים לא מצליח להתאושש בתוך 10 דקות לאחר סיום חשיפת פחמן דו חמצני ונקע בצוואר הרחם.
.3 2D אופטי הדמיה (בחי Bioluminescent ופלורסנט הדמיה)
- הרדימי עכברי LysEGFP (2% isoflurane משאיפת למשל) ומניח אותם עם צד גחון לחדר הדמיה.
- בצע in vivo bioluminescent הדמיה באמצעות בעלי החיים שלמים האופטיים IVIS הספקטרום במערכת ההדמיה vivo. ראשית, בדוק פלורסנט ולאשר את הבחירה של f פתוחהבחירת ilter, שדה ראייה (FOV) C - סנטימטר 13, ולגלול זמן חשיפה עד לאוטומטי (הגדרת autoexposure). Autoexposure יתאים באופן אוטומטי בזמן רכישה (מהירות תריס), binning (binning פיקסל הדיגיטלית), וצמצם (צמצם) של המכשיר כדי לייעל את עוצמת אות, תוך הימנעות רוויה. לאחר מכן לחץ על רכישה כדי ללכוד את תמונת bioluminescent.
הערה: לקבלת ההדמיה in vivo bioluminescent, עכברי תמונה בין 1 ל - 5 דקות. - בצע רציף בדימות פלואורסצנטי vivo על ידי סימון התיבה שליד לפלורסנט. בחר את מסנן עירור 465 ננומטר ו520 מסנן פליטת ננומטר. לגלול זמן חשיפה עד לאוטומטי ובחר FOV C (שלב 3.2.1). לאחר מכן לחץ על רכישה כדי ללכוד את תמונת הקרינה.
הערה: לקבלת in vivo הדמיה ניאון, עכברי תמונה בין 0.5 שניות. - לכמת את אותות in vivo bioluminescent כשטף כולל (פוטונים / sec) באזור של העניין (ROI) באמצעות תוכנת תמונת חיים על ידי הרחבת הראשונהסעיף כלים ROI של צבעים הכלי.
- בחר את סמל העיגול ומספר ROIs שמתאים למספר בעלי החיים נושא בFOV. לשנות את גודל ההחזר על ההשקעה על מנת להקיף את האזור של עניין כלומר, דפוס דיפוזיה bioluminescent שנאסף.
- ROIs מדוד בחר בכלי ROI בלוח הכלי ואת ההחזר על ההשקעה מדידת החלון תופיע. ערכים סה"כ זיו (פוטונים / sec) מייצגים הסכום של פיקסלים bioluminescent בתוך את ההחזר על ההשקעה שנוצרה.
- בחר ALL SELECT וכרטיסיות COPY בפינה הימנית התחתונה של חלון זה תעביר את המידע ללוח ולאפשר הדבקה לתוך תוכניות שלאחר מכן לניתוח.
- לכמת את אותות in vivo ניאון ככולל יעילות קורנת ([פוטונים / שנייה] / [μW / cm 2]) בתוך אזור מעגלי של העניין (ROI) באמצעות תוכנת תמונת חיים.
- בתוך חלון תוכנת תמונת חיים, להרחיב את כלים ROI בלוח הכלי. בחרסמל העיגול ומספר ROIs אשר תואם את מספר בעלי החיים נושא בFOV.
- לשנות את גודל ההחזר על ההשקעה על מנת להקיף את האזור של העניין המתאים באופן הדוק לאות bioluminescent מרכישת התמונה הקודמת.
- ROIs מדוד בחר בכלי ROI בלוח הכלי ואת ההחזר על ההשקעה מדידת החלון תופיע.
הערה: יעילות קורנת סה"כ ([/ s פוטונים] / [μW / cm 2]) מייצגת את הסכומים של פיקסלים ניאון בתוך את ההחזר על ההשקעה. - בחר כרטיסיות כל והעתקה בפינה הימנית התחתונה של חלון זה יעביר את המידע ללוח ולאפשר הדבקה לתוך תוכניות שלאחר מכן לניתוח.
תמונת μCT 4 רכישה
- מניחים את עכברי LysEGFP מורדמים לחדר הדמיה.
הערה: חדר הדמיה זה נועד כדי להתאים בשתי מערכת IVIS ספקטרום ההדמיה וFX קוונטי in vivo μCT מערכת הדמיה כדי לאפשרשיתוף רישום של התמונות אופטיות וμCT. - פתח את תוכנת CT ובחר את std התפריט הקבוע מראש 60 מ"מ FOV הדינמי מהרשימה הנפתחת.
- הכנס את הכיסוי הגדול נשא וזרוע המתאם עבור הסעות ההדמיה לתוך המכשיר.
- הנח את הסעות ההדמיה עכבר לתוך זרוע המתאם אז לדחוף לתוך קדח הזרוע וסגור את הדלת. הפעל מצב חי (לחצן עין בלוח הבקרה) ולמקם את הנושא במיקום gantry 0 ° ו90 ° באמצעות ציר X ופקדי ציר Y כדי למרכז את בעלי החיים בחלון ללכוד X. לאחר מכן לכבות את המצב חי על ידי לחיצה על לחצן עין.
- לרכוש תמונת סריקה דינמית עם FOV 60 מ"מ על ידי לחיצה על כפתור CT הסריקה (בסמוך ללחצן מצב Live). לייצא את התמונה שנרכשה בפורמט DICOM והחנות במיקום שניתן לגשת מאוחר יותר.
הערה: במינון המשוער יהיה 26 mGy לסריקה. FOV 30 מ"מ יכול לשמש אם רזולוציה טובה יותר היא רצויה.
5.3D תמונה אופטית רכישה, גיבוש וμCT Co-רישום
- במקום להכניס הסעות הדמיה עכבר לספקטרום על ידי מיצוב הסעות ההדמיה המכילות את העכבר לעלון זה ולהבטיח את העכבר לא זז.
- שימוש בתמונת חיים, בחר הדמיה אשף ברכישת לוח הבקרה כדי להתחיל את אשף ההתקנה. כדי להתחיל, בחר פליטת אור, אז DLIT, ולאחר מכן בחר את "החיידקים" כתב מהתפריט הנפתח ומסנני הפליטה המתאימים למודל ייבחר באופן אוטומטי, במקרה זה, 500-620 ננומטר.
- בחר הבא, ולאחר מכן לייעד פרמטרים הרכישה ומידע נושא בחלון הסופי. באופן ספציפי, נושא הדמיה יהיה עכבר, הגדרות אוטומטיות תיבחר מאפשרות autoexposure על מנת למקסם את איכות אות, תוך הימנעות רוויה, ושדה צפייה יוגדר C - 13cm.
- סיום בחר בחלון הסופי וחלון הרצף של לוח הרכישה יהיהutomatically מאוכלסת ברצף DLIT. תהיה תמונה אחת שנרכשה למסנן פליטה נבחר וautoexposure יבחר הגדרות אופטימליות בכל אורך גל לפי בחירות אשף הדמיה. הרצף שנוצר כולל גם תמונת אור מובנה דרושה לדור משטח הנושא באמצעות כלי הטופוגרפיה משטח שיפורט להלן.
- בחר רצף לרכוש כדי לרכוש את נתוני DLIT.
- לאחר רכישת התמונה שלמה, ליצור את הטופוגרפיה המשטח. התחל על ידי הרחבת כרטיסיית הטופוגרפיה משטח מתחת לפלטת הכלי.
- בשלב הבא, בחר את הכיוון שמשקף במדויק את הצד של החיה שעומדת מול המצלמה או החלק העליון של מכשיר IVIS. לאחר מכן לחץ על צור Surface. לחתוך את האזור של FOV המכיל את בעלי החיים.
- לאחר מכן השתמשתי במסכה הסגולה להגדיר את גבולותיו של בעל החיים.
הערה: כלי המיסוך משתמש ניגוד צבע כל כך בעלי חיים עם פרווה או עור כהה לא להסוות כראוי מהיםכאחוז. - בחר סיום והמשטח יופיע באופן אוטומטי. שמור את התוצאה תחת לשונית הטופוגרפיה משטח לאחר מכן סגור את הכרטיסייה כפי שאנו כבר לא צריכים את זה.
- לשחזר את עמדת המקור אופטי 3D באמצעות אלגוריתמי שחזור האופטיים מפוזרים מיושמים בחי תמונה 22 על ידי הרחבת כרטיסיית DLIT 3D השיקום.
- תמונות שנרכשו עבור רצף DLIT מוצגות.
הערה: התוכנה באופן אוטומטי מאמתת איכות הנתונים שנרכשו ולבטל את בחירת תמונות כעמומות מדי או שבי רוויה היא הווה. בחר התחל בצד הימני התחתון. - במידת הצורך, ניתן להתאים את הסף עבור כל תמונת bioluminescent על ידי לחיצה כפולה ובאמצעות מחוון thresholding בצד השמאלי התחתון.
הערה: זו היא בעיקר כדי לכלול אות בעוצמה נמוכה יותר וזהירות צריך להיות מתורגלת כאשר thresholding גבוה יותר כמו זה עשוי להתאים עוצמה כוללת של המקור המשוחזר הסופי.
- תמונות שנרכשו עבור רצף DLIT מוצגות.
- פתח את הדפדפן של DICOM על ידי לחיצה על סמל 3D בסרגל הכלים בחלק העליון של התוכנה (שליש משמאל) ולחפש את תמונת Quantum FX רכשה בעבר.
- לטעון את התמונה לתוך 3D צפה בכרטיסיית תמונת חיים על ידי לחיצה כפולה על הקובץ ליבוא.
הערה: fiducial אמורה לזהות באופן אוטומטי ותגרום לתמונת μCT להיות רשומה עם התמונה האופטית 3D.
- לטעון את התמונה לתוך 3D צפה בכרטיסיית תמונת חיים על ידי לחיצה כפולה על הקובץ ליבוא.
- בטל את הבחירה במפת ההדמיה הטופוגרפיה משטח על ידי הרחבת כלי אופטיים 3D בצבעי הכלי וביטול בחירה של משטח נושא תצוגת שכותרת תיבת הסימון בכרטיסיית Surface.
- באופן ידני ליצור טבלת בדיקה לדמיין את השלד ואת שתל K-תיל הנראים בתמונה μCT באמצעות היסטוגרמה תחת לשונית הנפח של 3D Multi-Modaliסעיף כלים ty של צבעים הכלי.
- ההיסטוגרמה מייצגת את חלוקת עוצמות voxel בנתונים נפח 3D ואטימות הצבע שלהם. כדי לקבוע היכן רקמה המסוימת של עניין היא בהיסטוגרמה, להשתמש בכלי המחוון לסף טיוח עד הרקמה או מבנה גלוי.
- לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית בהיסטוגרמה כדי ליצור נקודות וליצור עקומה לבודד את האזור זה של היסטוגרמה. זה יחזור על עצמו לכל מבנה - שלד ואחרי שתל K-התיל וניתן לשמור כשולחן בדיקה לעתיד ניתוחים.
- רכיבים יכולים להיות מקודד בצבע, אם כך רצוי על ידי לחיצה כפולה כל נקודה שנוצרה בהיסטוגרמה ובחירת הצבע הרצוי מחלון pop up.
ויזואליזציה תמונה .6 μCT וניתוח
- השימוש בתוכנת Quantum FX, לבחור את התמונה של עניין ולהשיק Viewer. בחר בכלי הסיבוב ולכוון את התמונה לvisualiZE ציר האורך של עצם הירך. בחר בכלי המדידה ולמדוד את אורך עצם הירך.
- הפעל את Viewer 3D כדי ליצור הדמיות 3D. התאם את הסף כדי להראות השינויים באנטומיה עצם קשורים לזיהום שתל.
- החל גזיר מטוסים כך שטיוח 3D מוגבל לסעיף חתך הרצוי של האזור של עניין בירך הדיסטלי.
- הפעל את חבילת התוכנה לנתח 11.0. טען את הקובץ * .VOX ששימש ליצירת 3D טיוח.
- הפעל את כלי מחשבון תמונה. השתמש בכלי 'אזור Pad' כדי לחתוך את התמונה (להסיר מטוסים שאינם כוללים את עצם הירך).
- הפעל את כלי סעיפים אלכסוני. השתמש באפשרות 3 נקודות כדי למצוא נקודות באמצע הירך, trochanter הגדול יותר וסופו של הפינים. לעשות נקודות אלה מטוס אלכסוני וליצור תמונה עם פרוסות חדשות.
- הפעל את האזור של כלי ריבית. הצג את פרוסות transaxial. התאם את דקות והגדרת מקסימוםs כדי להציג את עצם קליפת המוח. צור קווי המתאר לפרוסות המתאימות לכמה פרוסות (עם מרווח של כ 5 פרוסות) לפרוסות המתאימות ל25% הדיסטלי של עצם הירך. השתמש בכלי 'הפץ האזורים' לשרבב בין קווי המתאר הללו וליצור אזור 3D של עניין. להציל את האזור הזה של ריבית כמפת אובייקט.
- הפעל את כלי 'אפשרויות לדוגמא ". בחר בתיבת הסימון למפת האובייקט שנוצרה פשוט ובחר לחצני בחירה לאפשרויות המתאימות. לחץ על לחצן 'קבע תצורה התחבר סטטיסטיקת' כדי לוודא שתיבת הסימון 'העצמה' נבחרה. לחץ על לחצן "תמונות לדוגמא" על מנת להפוך את המדידות בפועל.
- לייצא את מדידות נפח לתכנית ניתוח נתונים. לנרמל את כרכי עצם החיצוניים מנקודות זמן מאוחר יותר עד לנקודת הזמן צילמה הראשונה באמצעות הנוסחא: נפח Δ (%) = ([כרך (X יום) - חלק (יום 2)] / [כרך (יום 2)]) x 100 .
הערה: בנוסחה זו, "X" משתנה מייצגת את נקודת העניין בזמן. מספר התוצאה ייצג את השינוי בגודלו של עצם חיצוני בנפח של עצם הירך הדיסטלי לאורך זמן. - כדי להמחיש את אזור 3D של ריבית על החלק העליון של העצם, לטעון את תמונת CT בכלי 'עוצמה לדקלם'. טען את מפת האובייקט המכילה את אזור 3D של עניין. עבור אל 'View''Objects' ולהגדיר את 'מקורי' להיות 'ב'. פתח את החלון 'התצוגה המקדימה'. להפעיל את התפריט 'לדקלם סוגים' ובחר 'compositing אובייקט'.
- לחץ על כפתור ה 'הסף' והכלי ולהתאים את הספים להראות את מפת העצם והעצם. השתמש באותו טווח סף קבוע לכל נקודות הזמן. לחץ על כפתור ה 'הרוטציה' והגדר את הכיוון להיות נוף anterolateral אמיתי. לחץ על 'לדקלם' על מנת ליצור את העיבוד הסופי. שמור את טיוח מהנפח העיקרי "לדקלם "חלון.
Representative Results
בbioluminescent vivo ודימות פלואורסצנטי
במחקר הנוכחי, הפרוטוקול מתואר עבור דגם זה שפורסם בעבר של זיהום משותף תותב אורתופדים בעכברים 14-19, הכולל את המיקום כירורגית של שתל K-חוט טיטניום המשתרע מתעלת intramedullary בירך לתוך המפרק חלל 14-19. ס זן aureus bioluminescent Xen29 (1 x 10 3 CFU ב2 μl PBS) היה pipetted ישירות על גבי שתל טיטניום הסוף בברך לפני משותף סגירת האתר כירורגית 16. כדי להמחיש ולכמת את זרם הנטל ונויטרופילים חיידקי noninvasively בעכברי LysEGFP מורדמים, in vivo הדמיה אופטית של בעלי חיים שלמות בוצעה ברצף תמונת אותות bioluminescent מהחיידקים ואותות ניאון EGFP מנויטרופילים המסתננים באמצעות בעלי החיים שלמים האופטיים IVIS הספקטרום ב vivoמערכת הדמיה בשלושה ימים שלאחר ניתוח (כלומר, ימים 2, 14 ו28). אותות bioluminescent של עכברים נגועים Xen29 נותרו מעל אותות רקע של עכברים נגועים בדמה לתקופת הניסוי (איור 1 א, ג) 16. העבודה הקודמת שלנו הראתה שin vivo bioluminescent האותות מקורבים באופן הדוק המספרים של vivo לשעבר CFU המבודדים מהמפרק / רקמת העצם והחסיד לשתלים 17,18. בנוסף, אותות ניאון EGFP היו גבוהים יותר מאשר עכברים נגועים בזיוף בנקודות זמן מוקדם אבל פנו רמות רקע במהלך הזיהום (איור 2 ב, ג) 16.
שיתוף רישום 3D של in vivo אותות אופטיים עם תמונות μCT
כדי להמחיש את האותות האופטיים (אותות כלומר, bioluminescent חיידקים וניאון EGFP) בהקשר האנטומי של מפרקי הברך לאחר הניתוח אניn 3D, התמונות אופטיות שנוצרו באמצעות מערכת ההדמיה IVIS הספקטרום היו עם תמונות μCT נוצרו באמצעות מערכת ההדמיה Quantum FX μCT שיתוף רשום. שיתוף רישום זה יכול להיות מושלם, כי חדר ההדמיה העכבר יכול להיות מוכנס לתוך או מכונה כדי להבטיח שהעכברים היו בדיוק באותו הכיוון. כדי לאמת את הדיוק הזה, התוצאות הושוו עם רכישת תמונה בוצעה באמצעות ספקטרום-CT במערכת ההדמיה vivo IVIS המשלבת את שני השיטות למכשיר אחד ללא צורך בהעברה פיזית של בעלי החיים. כדי למפות את הנתונים האופטיים על גבי תמונות μCT ב3D, אנו מנוצלים אלגוריתם שחזור טומוגרפיה אופטית מפוזר 16. שחזור 3D התוצאה מוצג (סרט 1).
בנוסף, ההדמיה μCT אפשרה להדמיה וכימות של שינויים נלווים באיכות ובממדים של העצם שאירע במהלךהזיהום (איור 2) 16. כפי שדווח בעבר, חיצוני עצם הנפח של עצם הירך הדיסטלי גדל באופן משמעותי לאורך הזמן (איור 2 א) 16. כדי לכמת את השינויים הללו, ניתוח תמונת נפחית 3D בוצע על 25% הדיסטלי של פני השטח הבונים של עצם הירך והשינויים בעצמות הנפח לאורך הזמן היו מנורמלות הראשוני עצם הנפח. חיצוני עצם הנפח גדל באופן משמעותי בעכברים נגועים בהשוואה לעכברים נגוע בדמה (איור 2) 16. העלייה בהדיסטלי עצם הירך חיצוני הנפח הייתה סבירה בשל פגיעה בעצמות הנגרמת על ידי הזיהום של רקמה המשותפת ועצם, שנצפו באמצעות הדמיה μCT וניתוח היסטולוגית 16.
איור 1 2D in vivo bioluminescent ואותות ניאון. ס aureus Xen29 או לא חיידקים (נגוע) היו מחוסן למפרק הברך לאחר מיקום K-תיל והעכברים LysEGFP הם צילמו באמצעות מערכת ההדמיה IVIS ספקטרום 16. () ממוצע in vivo אותות bioluminescent כפי שנמדד על ידי שטף כולל (פוטונים / sec) ± SEM. (B) ממוצע ב/ (μW / cm 2) ± SEM. (C) הנציג בbioluminescent vivo ואותות ניאון מעולף על גבי צילום בשחור לבן vivo EGFP אותות ניאון, כפי שנמדד על ידי סך הכל יעילות קורנת (פוטונים / sec) תמונה של העכברים. המגבלה של זיהוי של נטל החיידקים באמצעות in vivo ההדמיה bioluminescent היא בין 1 x 10 2 ו1 x 10 3 CFU. * P <0.05, עמ '† <0.01, ‡ p <0.001 עכברים Xen29 נגועים לעומת עכברים נגועים בדמה (מבחן t של הסטודנט [שני זנב]). אנאלב הזה הוא דמות מייצגת, הכוללת נתונים שפורסמו בעבר נוצרו באמצעות Xen29 וצלמו עם מערכת ההדמיה IVIS לומינה XR 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ההדמיה איור 2 3D μCT. S. aureus Xen29 או לא חיידקים (נגוע) היו מחוסן למפרק הברך לאחר מיקום K-תיל ועכברי הדמיה באמצעות FX הקוונטים in vivo מערכת μCT. () הדמיות הנציג 3D μCT של Xen29 עכברי -infected (פנלים העליונים) ועכברים נגועים בדמה (לוחות נמוכים). אחוז (ב) לשינוי עצם נפח החיצוני (25% הדיסטלי של עצמות הירך) מנורמל לti הראשונילי נקודה (ממוצע ± SEM). * P <0.05, עמ '† <0.01, ‡ p <0.001 עכברים Xen29 נגועים לעומת עכברים נגועים בדמה (מבחן t של הסטודנט [שני זנב]). שים לב זה הוא דמות נציג הכוללת נתונים שפורסמו בעבר נוצרו באמצעות מתח bioluminescent ס aureus Xen29 וצלם עם FX in vivo μCT מערכת ההדמיה קוונטי 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. הנציג 3D שיתוף רישום האנטומי של אותות Xen29 bioluminescent ואותות ניאון EGFP-נויטרופילים בשילוב עם תמונות μCT. התמונות מסובבות על הציר האנכי.
Discussion
הדמיה Multimodality כגון טכניקות הדמיה לנצל בהדמיה אופטית vivo בשיתוף עם ההדמיה μCT מספקת גישה טכנולוגית חדשה המאפשרת הדמיית 3D, הכימות וניטור אורך של תהליכים ביולוגיים בהקשר האנטומי 1-4. הפרוטוקולים במחקר הנוכחי מספקים מידע מפורט כיצד in vivo bioluminescent ודימות פלואורסצנטי יכול להיות משולב עם ההדמיה μCT במודל אורתופדים תותב שתל זיהום בעכברים כדי לפקח על נטל החיידקים, דלקת neutrophilic ושינויים אנטומיים בעצמות noninvasively ואורכים מעל זמן. יחדיו, המידע שהושג על ידי שילוב של הדמיה אופטית ומבנית מייצג התקדמות טכנולוגית גדולה, אשר עשוי להיות טוב במיוחד מתאים ללמוד תהליכים ביולוגיים ומצבים פתולוגיים המשפיעים על מערכת השרירים והשלד.
עניין אחדממצא ing שיש לציין הוא ששמו לב שאותות ניאון EGFP-נויטרופילים ירדו לרמות רקע על ידי 14-21 ימים ונשארו ברמות רקע לתקופת הניסוי למרות נוכחותם של חיידקי bioluminescent. אין זה סביר כי קרינת רנטגן השפיעה הישרדות נויטרופילים כפי שאנו נצפו קינטיקה דומה של אותות נויטרופילים בעכברים שאינם מוקרן 19. בעבודה הקודמת שלנו היה מעורב מודל של ס ' פצעי aureus נגועים, חדירת נויטרופילים מעורבים שילוב של גיוס חזק נויטרופילים מהמחזור, הישרדות נויטרופילים ממושכות באתר של זיהום והביות של תאי KIT + אב למורסה, שבו הם נותנים באופן מקומי עלייה להבשיל נויטרופילים 23. סביר להניח כי תהליכים דומים תרמו לחדירת נויטרופילים בשתלו אורתופדי ס מודל זיהום aureus. למרות שלא ידוע מדוע אותות נויטרופילים ירד בorthopמודל זיהום aedic, יכול להיות שהתגובה החיסונית השתנתה לאורך זמן כמו זיהום זה התקדם מאקוטי לדלקת כרונית וזה נושא של חקירה בעתיד.
יש מגבלות במודל זה עכבר של זיהום משותף תותב אורתופדים וin vivo ההדמיה multimodality שיש לציין. ראשית, מודל עכבר זה הוא פשטני של הנהלים בפועל וחומרים המשמשים בניתוחים אורטופדיים בבני אדם 24. עם זאת, מודל זה עושה לשחזר את הזיהום הכרוני ודלקת שהתפתחה בעצמות ובמפרקי הרקמה כי הוא ראה בזיהומי שתל אורתופדים אנושיים 8,9. בנוסף, כדי לקבל את תמונות μCT, מינונים נמוכים יחסית של קרינת רנטגן שמשו כדי למזער את השפעות שליליות על בריאותם של בעלי החיים במהלך הזיהום. לרזולוציה טובה יותר של עצם, במינונים גבוהים יותר של קרינת X-ray יוכל לשמש עבור ההדמיה μCT על מורדמיםnimals. עם זאת, זה היה מונע את היכולת noninvasively ואורכים כדי לפקח על עצם השינויים לאורך משך הניסויים.
לסיכום, ההדמיה multimodality מעורבת שילוב של in vivo הדמיה האופטית של בעלי החיים שלמה עם ההדמיה μCT אנטומיים התירה מידע מקיף יותר על הזיהום והתגובה דלקתית. בנוסף, טכניקות אלה התירו להערכת ההשלכות של הזיהום והדלקת בעצמות ובמפרקי רקמות. עבודה בעתיד יכולה לנצל את היתרון של ההדמיה multimodality להעריך את יעילותם של טיפולים נוגדים חיידקים, תגובות חיסוניות, הפתוגנזה של מחלה והשינויים תגובתי בעצמות כפי שהחלנו לחקור 14-18. בנוסף, הדמיה multimodality יכולה להעריך בדיקות וקליעים נותבים כדי לאבחן הנוכחות של זיהום כפי שתוארה לעיל במודלים של בעלי חיים זיהום ירך, דלקת פן לב, להדביק ריאתייונים וזיהומים ביולוגי 25-28. לבסוף, השימוש בהדמית multimodality יכול להיות מורחבת מעבר למחלות זיהומיות ומשמש על פני תחומים, ובכלל זה אורתופדיה, ראומטולוגיה ואונקולוגיה, לחקור מצבים אחרים המשפיעים על מערכת השלד, כגון סרטן שלד, מחלה גרורתית, שברים ודלקת פרקים 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF משולם לעובדים של PerkinElmer, המייצר את מכשירי ההדמיה, ובלבד Xen29 bioluminescent ס זן aureus, ושילם עבור עלויות הפרסום של מאמר וידאו זה. יש לי המחברים שנותרו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית H & H לי מחקר Resident כירורגי חוקרים (ליאן), AO Foundation Start-Up S-12-03M מענק (לLSM) ומכונים לאומיים לבריאות מענק R01-AI078910 (לLSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
