פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך גרורתי.
סרטן השחלות גרורות על ידי שפיכה לתוך נוזל הצפק ופיזור לאתרי דיסטלי בתוך הצפק. תרבויות חד שכבתי במדויק לא מודל ההתנהגויות של תאי סרטן בתוך סביבת nonadherent, כמו תאי הסרטן לצבור מטבע לתוך מבנים תאיים אשר תורמים לתהליך גרורתי על ידי הצמדת ולפולש הצפק ליצירת גידולים משניים. למודל בשלב חשוב זה של גרורות סרטן שחלות, אגרגטים רב תאיים, או spheroids, יכול להיות שנוצר משורות תאי סרטן השחלות הוקמו נשמרו בתנאי nonadherent. כדי לחקות את microenvironment הצפק נתקל על ידי תאי גידול in vivo, מודל שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial הוקם בי preformed הספרואידים הם מצופים על גבי monolayer תא mesothelial אדם, נוצרו מעל מחסום מטריקס. שיטות לאחר מכן פותחו באמצעות נתח סלולרי בזמן אמת לביצוע אמיתי כמותייםמדידות זמן של הקיבולת פולשני של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים. גישה זו מאפשרת למדידה רציפה של פלישה על פני תקופות זמן, שבו יש מספר יתרונות על פני מבחני נקודת סיום מסורתיים ותמונה מיקרוסקופית זמן אמת מפרכת יותר ניתוחים ארוכות. בקיצור, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך מחסומי mesothelial ומטריצה לאורך זמן.
יש לו סרטן השחלות שיעור התמותה הגבוה ביותר מכל סוגי סרטן גינקולוגיות 1. ברחבי העולם, יש ~ 230,000 מקרים ומעל 100,000 מקרי מוות כתוצאה מהמחלה בכל שנה 1. רוב המטופלים (> 75%) מאובחנים לאחר הסרטן כבר שלח גרורות, כאשר הטיפול הוא מסובך עוד יותר על ידי התנגדות מוגברת לכימותרפיה והתחזית היא ענייה 2. יש חולים עם מחלה גרורתית III-IV שלב שיעורי הישרדות לאחר 5 שנים של רק 30-40% 3. לפיכך, יש צורך דחוף בהבנה טובה יותר של ההתנהגויות הסלולר שבבסיס גרורות סרטן השחלות על מנת לטפל במחלה מתקדמת בצורה יעילה.
המודל הנוכחי של גרורות סרטן השחלות מציע כמה שלבים בתהליך גרורתי, כל אחד מהם מתרחש בmicroenvironment שונה אשר משפיע על גידול התנהגות. תאי סרטן השחלות גרורות לראשונה להשיל מאתר הגידול הראשוני ולשרוד בnonadherמדינה אף אוזן גרון בתוך נוזל הצפק כתאים בודדים או מבנים תאיים תלת ממדים, המכונה אגרגטים או הספרואידים 2,4,5 רב תאיים. תאים אשר אינו מהווים הספרואידים בהשעיה רגישים יותר לanoikis 2,4,5. Spheroids גם תערוכה עלה התנגדות chemotherapeutics, תורם למחלה שיורית וההישנות הבאה של 2,4,5 הסרטן. שלב קריטי שני בגרורות סרטן השחלות הוא המעבר של אגרגטים מאשכולות חופשיים צף לגידולים משניים שהוקמו בתוך הקיר וomentum 5,6 הצפק. תאי תאי אינטראקציות ותא מצע היו מעורבות בהיווצרות המצרפי, הישרדות, ודבקות במטריצה תאית (ECM) המיוצרת על ידי mesothelial רירית 4-11 הצפק. עדיין, התהליכים האלה הם הבינו היטב.
כדי להגדיר את המנגנונים מעורבים בהפצה של סרטן השחלות, הספרואידים יכולים להיות generated משורות תאי הסרטן שהוקמו תוך שימוש בשיטות תרבות nonadherent, שמירה על תאים בתרחיף או על ידי הוספת methylcellulose לתקשורת תרבות 12,13 או על ידי תאי culturing על צלחות נמוכות מצורפים 2,14. כאשר בתרבית באופן זה, תאי סרטן השחלות יותך אגרגטים או spheroids תאיים שתערוכת תכונות סלולריות, מולקולריות, ויוכימיים דומות לאלו של אגרגטים גידול נמצאו בvivo 2,14. לאחר היווצרות, הספרואידים ניתן לקצור מאוחר יותר ממדיום nonadherent וreplated על גבי מגוון רחב של משטחים מוצקים ללימודים תפקודיים נוספים. זה מייצג מראש על מבחני בתרבות monolayer, שלא במדויק מודל ההתנהגויות של תאי סרטן שחלות גרורות בתוך סביבה nonadherent כגון נוזל intraperitoneal.
הקיבולת פולשני של הספרואידים סרטן ניתן להעריך במבחני נקודת סיום מסורתיים בבוידן תאים 2 </sup>, אך גישה זו יכול להיות מטעה, שכן פלישת תאי סרטן השחלות היא תהליך דינמי לאורך זמן. שיטה האחרונה בזמן אמת כבר המציאה באמצעות וידאו מיקרוסקופיה זמן לשגות של פינוי תא mesothelial ידי הפולשים spheroids סרטן השחלות 15,16; עם זאת, ניתוח נתוני זמן לשגות זה זמן רב ויכול להיות סובייקטיבית. בזאת, שיטה מהירה, כמותית להערכת ההתנהגויות פולשני של spheroids סרטן השחלות בזמן אמת הוא תאר. ראשית, מודל תא אליפטית-mesothelial הוקם המייצג את השלב של גרורות סרטן השחלות כאשר הספרואידים תאיים לצרף ולפלוש הצפק ליצירת גידולים משניים. אז מתודולוגיה למנתח בזמן אמת נייד (RTCA; ראה טבלת חומרים לפרטים חברה) הותאמה לביצוע מדידות בזמן אמת כמותי של היכולת פולשנית של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים ונבדקו במודל זה.
בRTCA במחוונים, תגובות הסלולר נמצאות תחת פיקוח ברציפות במהלך assay, ללא הצורך בתוויות חיצוניות, על ידי מדידת שינויים בעכבה חשמלית. יש צלחות תרבות שתוכננו במיוחד microelectrodes מצופה זהב שנמצא מתחת קרום microporous בממשק שבין התאים העליונים ותחתונים של 2 (צלחות 'CIM') תאיים כן. המיקום של האלקטרודות בתא התחתון מאפשר מדידה של שינויים בעכבה חשמלית כמו תאים לפלוש דרך ECM או ECM / מחסום סלולארי. ממשק הקרום בין 2 התאים של כל אחד גם צלחת CIM מצופה ראשית עם רכיב ECM של עניין. במערכת המודל של תאים אליפטית-mesothelial, הממשק הוא מצופה בשכבה של Matrigel (ראה טבלת חומרים לפרטים חברה), לחקות את ECM המורכב שבבסיס mesothelial הבטנה של הצפק, ואחריו monolayer מחוברות של mesothelial אדם " תאי יעד '. לבסוף, spheroids סרטן השחלות מראש יצר הם מודעותטוליפ אין. תאים אליפטית סרטן השחלות פעיל חייבים לפלוש דרך שכבת תאי היעד ומטריקס להגיע לחדר התחתון ולשנות קריאות עכבה חשמליות. תאי מטרה בכוחות עצמם גם נבחנים כדי לוודא שהם לא לפלוש דרך שכבת מטריקס ומתאימים לשימוש בassay זה.
תאי סרטן השחלות פולשים אינטראקציה עם מגוון רחב של סוגי תאים על פני השטח של הצפק, כוללים fibroblasts, adipocytes, ותאי mesothelial, והוא חשב שתקשורת דו כיוונית בין התאים הסרטניים ותאי הצפק כדי לשחק תפקיד מפתח בהנעת התהליך גרורתי 2. ברגע שמשתלט עליו, הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא בקלות להתאמה לחקר האינטראקציות הללו בתוך microenvironment הצפק, למשל, באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM טובה או מניפולציה גנטית של הסרטן או שורות תאי הצפק. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בתאים סרטניים בשחלות עיקריות שנקטפו זה עתה ממיימת הממארת ו / או תאים ראשוניים של הצפק כדי לקבל תובנות ישירות לאותות רגולציה ואינטראקציות הסלולר המסדירות את הקמתה של נגע גרורתי בחלל הצפק <sעד> 2.
שימוש במכשיר RTCA כדי למדוד את הקיבולת פולשני של תאים או הספרואידים אחד מציע מספר יתרונות על פני מבחני קונבנציונליים אחת נקודות קצה וזמן לשגות תמונת מנתח. המכשיר מודד RTCA פלישה סלולרית במרווחי זמן מוגדרים ברציפות במהלך assay, אשר יכולות להיות שעות או ימים. זה מאפשר קביעת שינויים בשער של פלישה לאורך זמן, שמתגבר על המגבלות של מבחני נקודת סיום אחת. כך, למשל, בוחן את נתוני פלישה משורות תאי הסרטן השונים בנקודתי קצה אחד (איור 2), למשל, 3 שעות, היה עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי KGN וOVCA433 תאים היו הרבה יותר פולשנית מאשר OVCA429 תאים. יתרון נוסף של טכנולוגיה זו הוא כי מכשיר RTCA מודד את השינויים בעכבה חשמלית. משמעות דבר היא כי מבחני ניתן להפעיל ללא תיוג תאים עם סוכן חיצוני, אשר עשוי להיות השפעות בלתי צפויות על פן תאotype או פונקציה. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר לומדים תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים ממיימת הממארת, שבה היא הכרחי כדי לשמור על מניפולציות למינימום כדי למנוע החדרת שינויים מולקולריים ופנוטיפי שאינם משקפים את האופי שלהם in vivo 2. יתר על כן, שימוש במכשיר RTCA מאפשר האיסוף של נתונים כמותיים בזמן אמת, שלא רק ימנע את הזמן רב ניתוחים הקשורים למיקרוסקופיה זמן לשגות, אלא גם מאפשר הקביעה המהירה של חלונות הניסיונית מפתח עבור assay אופטימיזציה. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר משווה את ההשפעות של מגוון גורמים בפלישת אליפטית, גורמים שונים כיכולים להפעיל את ההשפעה המקסימלי שלהם בנקודות זמן שונים, או עם פרופילים שונים באופן משמעותי לאורך זמן.
למרות שפרוטוקול זה ניתן לשינויים (לדוגמא, שימוש במטריצה שונה ECM, שורות תאי הסרטן שונות, או cel היעד שונהls), אם כך, חשוב לציין כי תנאי ניסוי שונים צריכים קודם להיות מותאמים. לדוגמא, לפני תחילת לימודים של פלישת אליפטית, המספר האופטימלי של תאים סרטניים / צלחת CIM גם צריך קודם כל שייקבע על ידי assay של titrations מספר התא בתרבות שכבה. המספר האופטימלי של הספרואידים להשתמש לכל טוב אז המבוסס על ניתוח זה. לדוגמא, בשיטה הנוכחית, הספרואידים מהווים כ 3,000 תאים כל אחד כאשר נוצרו ראשון. אם titrations מספר התא הראשוני עולה כי 30,000 תאים בmonolayer הם אופטימליים לזיהוי בפלישת מנתח, אז 10 הספרואידים מתווספים לכל צלחת CIM כן. יתר על כן, בעת ביצוע ניסויי תרבות משותפת, חשוב ללמוד את ההתנהגויות של monolayer התא 'היעד' בנפרד על מנת לקבוע אם תאים אלה מטבעם פולשניים, כמו זה יכול לבלבל את התוצאות. בדוגמא שהפגינה, הספרואידים סרטן הם מצופים בחלקו העליון של תא monola LP9yer, עם ובלי FBS מתווסף לתחתית גם chemoattractant. במקביל, תאים בתרבית LP9 לבד, מתחת לכל מצב טיפול.
באופן דומה, כאשר לומדים את הקיבולת פולשני של תאים והספרואידים, חשוב גם לבחון את יכולות הנדידה שלהם, כמו גם על מנת להבחין בין שתי ההתנהגויות (כלומר פלישה דורשת עיכול מפרקי החלבונים של מחסום ECM תוך הגירה לא). כדי לעשות זאת, ישמיט את מחסום ECM (שלבי 3.1.1 – 3.1.3) ולנהל את assay במקביל למחסום ECM במקום. המדד 'הפלישה' האחרון יכול להיות מתוקן למידה 'הנדידה' לשעבר, אם תרצה בכך. לבסוף, חשוב לציין כי המידע שנצבר מאמצעים של עכבה חשמלית הוא מוגבל בהיקפה: ברגע שהתאים פלשו לתוך התא התחתון, שינויים בהתקשרות שלהם, מתפשט, והתפשטות בחלק התחתון של הקרום עשויים לתרום לשינויים ב ריאה עכבה dings. לכן, במתודולוגיה זו היא אינפורמטיבי ביותר הפועל בשיתוף עם מבחני אחרים של כדאיות אליפטית תא, הדבקה, הגירה, ומורפולוגיה על מנת להעריך באופן מקיף התנהגויות תא אליפטית. לדוגמא, באופן אידיאלי, על מנת להבין באופן מלא אינטראקציות אליפטית-mesothelial, צריכים גם להיות צילמו שיתוף תרבויות נפרדות מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב הסטנדרטי, כך שהערכות איכותיות של מורפולוגיה אליפטית ובריאות יכולות להתבצע במקביל למבחני RTCA כמותית של פלישה. אם שלב התיוג האופציונלי מתבצע, אז ההתנהגויות של תאים סרטניים בודדים ניתן לקבוע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהם disaggregate מאליפטית ואינטראקציה עם תאי mesothelial ללא תווית. יתרון נוסף של fluorescently תיוג תאי הסרטן כאשר שיתוף culturing עם סוג תא שני הוא שאז זה אפשרי כדי לוודא שרק תאי הסרטן פלשו דרך המחסומים הניידים וECM.
<p class="jove_content"> לסיכום, שיטה זו מייצגת ניתוח כמות תפוקה גבוהה של פלישה אליפטית סרטן השחלות של מחסומי mesothelial וECM. באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM גם, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך mesothelial ומחסומי מטריצה מעל זמן.The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן לאומית למדע קאס והרפואה גרנט; (MB); מועצה לאומית לבריאות ומחקר הרפואי של אוסטרליה פרויקט גרנט (KLS, 338,516); ועל ידי תכנית תמיכת תשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני (אוסטרליה).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |