Summary
Ovarian cancer cell invasion in mesothelial slemhinnan i peritoneum är en dynamisk process med tiden. Med hjälp av en realtid analysator, kan den invasiva kapacitet av äggstockscancerceller i en sfäroid-mesotelcell co-kultur-modellen kvantifieras under långa tidsperioder, som ger inblick i faktorer som reglerar metastaserande process.
Abstract
Äggstockscancer metastaser genom att kasta in i peritonealvätska och dispergering till distala platser inom bukhinnan. Monolager kulturer inte exakt modell beteenden av cancerceller i en nonadherent miljö, som cancerceller i sig aggregera in flercelliga strukturer som bidrar till den metastatiska processen genom att fästa till och invadera peritoneal foder för att bilda sekundära tumörer. För att modellera detta viktiga skede av äggstockscancer metastaser, flercelliga aggregat, eller sfäroider, kan genereras från etablerade äggstockscancercellinjer som upprätthålls i enlighet med icke-vidhäftande förhållanden. För att efterlikna den peritoneala microenvironmenten påträffas av tumörceller in vivo genomfördes en sfäroid-mesothelial samodling modell upprättas där förformade sfäroider stryks ut på toppen av en mänsklig mesotelcell monoskiktet, bildat över en extracellulär matrisbarriär. Metoder har sedan utvecklats med hjälp av en realtidscell analysator för att genomföra kvantitativa realtidsmätningar av den invasiva kapacitet av olika äggstockscancercellinjer som odlats som sfäroider. Detta tillvägagångssätt möjliggör kontinuerlig mätning av invasion under långa perioder, vilket har flera fördelar jämfört med traditionella endpoint analyser och mer arbetskrävande realtids mikroskopi bildanalyser. Kort sagt, gör denna metod en snabb, fastställande av faktorer som reglerar samspelet mellan äggstockscancer sfäroida celler invaderar genom mesotel och matrisbarriärer över tid.
Introduction
Äggstockscancer är den högsta dödligheten av alla gynekologiska cancerformer 1. I hela världen finns det ~ 230.000 fall och över 100.000 dödsfall till följd av sjukdomen varje år 1. De flesta patienter (> 75%) diagnostiseras när cancern redan har metastaserat, när behandlingen kompliceras ytterligare av ökad resistens mot kemoterapi och prognosen är dålig 2. Patienter med stadium III-IV metastaserad sjukdom har 5 årsöverlevnaden för endast 30-40% 3. Således finns det ett akut behov av en bättre förståelse av de cellulära beteenden som ligger bakom äggstockscancer metastaser för att effektivt behandla avancerad sjukdom.
Den nuvarande modellen för äggstockscancer metastaser föreslår flera steg i metastaserande process, som var och en förekommer i en särskild mikromiljö vilket påverkar tumörbeteende. Metastaserande äggstockscancer celler initialt fälls från den primära tumören platsen och överleva i en nonadherent tillstånd i peritonealvätska som enskilda celler eller tredimensionella flercelliga strukturer, benämnd flercelliga aggregat eller sfäroider 2,4,5. Celler som inte utgör spheroids i suspension är mer mottagliga för anoikis 2,4,5. Spheroids uppvisar också ökad resistens mot kemoterapeutika, bidrar till kvarvarande sjukdom och efterföljande återfall av cancern 2,4,5. Ett andra viktigt steg i äggstockscancer metastaser är övergången av aggregat från fritt flytande kluster till etablerade sekundära tumörer inom peritoneal väggen och omentum 5,6. Cell-cell och cell-substrat interaktioner har varit inblandade i aggregatbildning, överlevnad och anslutning till den extracellulära matrisen (ECM) som produceras av mesothelial slemhinnan i bukhinnan 4-11. Än så länge är dessa processer dåligt kända.
För att definiera de mekanismer som är involverade i spridningen av äggstockscancer, kan spheroids vara geneated från etablerade cancercellinjer med användning av icke-adherenta kulturmetoder, bibehålla celler i suspension antingen genom tillsats av metylcellulosa till odlingsmediet 12,13 eller genom att odla celler på låga fastsättningsplattoma 2,14. När de odlas på detta sätt, ovarian cancerceller montera in multicellulära aggregat eller sfäroider, vilka uppvisar liknande cellulära, molekylära och biokemiska egenskaper som motsvarar dem hos tumöraggregat påträffats in vivo 2,14. Efter bildandet kan spheroids därefter skördas från nonadherent medium och replated på en mängd olika fasta ytor för ytterligare funktionella studier. Detta utgör ett framsteg jämfört med analyser i monolager kultur, som inte exakt modell beteenden av äggstockscancerceller metastaserande inom en icke vidhäftande miljö såsom intraperitoneal vätska.
Den invasiva kapacitet av cancer spheroids kan bedömas i traditionella endpoint analyser i Boyden kammare 2 15,16; Men, är analys av tid förfaller uppgifter tidskrävande och kan vara subjektiv. Häri är en snabb, kvantitativ metod för att bedöma de invasiva beteenden av äggstockscancer sfäroider i realtid beskrivs. För det första var en sfäroid-mesotelcell modell form som utgör det skede av äggstockscancer metastaser när flercelliga sfäroider fäster och invaderar peritoneal foder för att bilda sekundära tumörer. Sedan metodik för en Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Material tabellen för företagsinformation) anpassades för att genomföra kvantitativa realtid mätningar av invasiva kapacitet olika äggstockscancercellinjer som odlats som sfäroider och testade i denna modell.
I RTCA imentet, är cellulära svar övervakas kontinuerligt under loppet av en analys, utan behov av exogena etiketter, genom att mäta förändringar i elektriska impedansen. Speciellt utformade odlingsplattor har guldbelagda mikroelektroder placerade under ett mikroporöst membran i gränssnittet mellan den övre och nedre kammare i en 2 chambered väl ("CIM-plattor). Placeringen av elektroderna i den undre kammaren möjliggör mätning av förändringar i elektrisk impedans som celler invaderar via en ECM eller ECM / cellbarriären. Membranet gränssnittet mellan de två kamrarna i varje CIM platta väl är först belagd med ECM-komponenten av intresse. I sfäroid-mesotelcell modellsystem är gränssnittet belagd med ett lager av Matrigel (se Material tabell för företagsinformation), för att efterlikna komplexa ECM underliggande mesothelial slemhinnan i bukhinnan, följt av ett sammanflytande monoskikt av humana mesotelceller ' mål-celler. Slutligen förformad äggstockscancer sfäroiderna är added. Äggstockscancer sfäroida celler måste aktivt invadera genom målceller lagret och matris för att nå den nedre kammaren och förändra elektriska impedans avläsningar. Målceller som sådana bedöms också att säkerställa att de inte invadera genom matrisskiktet och är lämpliga för användning i denna analys.
Protocol
1. Beredning av celler, media och reagens
- Framställning av Metylcellulosa innehållande medium
- Lös upp 1,5 g metylcellulosa i 100 ml steril Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (inga tillsatser) i en 250 ml kolv.
- Värm lösningen på låg i en mikrovågsugn i 5 min; se till att undvika att koka över.
- När metylcellulosa pulver är semi-upplöst, tillsätt ren magnetomrörare och media för att ta volymen till 125 ml.
- Blanda, invertera, och rör om vid rumstemperatur under 1,5 timmar, följt av omrörning vid 4 ° C över natten.
- Fördela lösningen lika i fyra 50 ml rör och centrifugera i 1,5 h vid 2300 x g..
- Samla den klara, mycket trögflytande supernatanten (ca 90-95% av lager), delprov i sterila 50 ml rör, och förvara vid 4 ° C i upp till 3 månader.
- Kultur och märkning av celler
- Behåll äggstockscancercellinjer i monolager i en tissue kultur inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2 i lämplig tillväxtmedier (DMEM för KGN cellerna 17 och MCBD110: M199 för OVCA429 och OVCA433 cellinjer 18) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L -glutamin och 1% penicillin-streptomycin.
- Bibehåll LP9 humana mesotelceller i M199: Hams F12-medium innehållande 15% FBS, 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 400 ng / ml hydrokortison, i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Seed celler i önskad kolven storlek och växa till cirka 75% sammanflytning. Skörda celler genom trypsinering använder 0,05% trypsin / EDTA, centrifugering vid 186 x g under 5 min, och tvätta cellpelleten två gånger med PBS.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer.
- Valfri Fluorescerande Cell märkningsmetod
- Resuspendera cancerceller vid en slutlig koncentration av 1 x 10 6 celler / ml i 1 ml förvärmd PBS/0.1% BSA.
- Lägg 2 | il av 5 mM förråds Cell Trace CSFE lösning (eller annan föredragen celletiketten som kvarhålles långtid) till cellerna vid en slutlig koncentration av 10 | iM och inkubera vid 37 ° C under 10 till 15 min i ett vattenbad.
- Släck reaktionen med 1 ml iskallt medium innehållande 10% FBS och re-pellet genom centrifugering. Återsuspendera i 10 ml av den lämpliga förvärmt tillväxtmedium (se steg 1.2.1).
- Seed celler i en 75 cm 2-filter-capped kolv och odling vid 37 ° C, 5% CO2.
- Kontrollera celler under ett fluorescensmikroskop för att kontrollera att nivån på fluorescensmärkning är tillräcklig för detektion. När cellerna når cirka 75% sammanflytning, skörd och räknas som i steg 1.2.3 och 1.2.4 ovan.
2. Generering av spheroids i Metylcellulosa
- Beräkna volymen av äggstockscancerceller från punkt 1 behövs för sfäroid generationen (totalt 300.000 celler krävs för varje fullt 96-brunnar experiment). Ingente: Om du använder olika cellinjer än presenteras här, kan celltäthet för likformig sfäroid generation måste optimeras för varje linje.
- För beräkning av spädning av celler i metylcellulosa medier, först subtrahera cellvolym krävs (steg 2,1) från 15 ml.
- Tillsätt 3 ml metylcellulosa stamlösning (för att göra 20% metylcellulosa slutlig) till en volym av odlingsmedium lämpliga för varje cell-linje, som är lika med 15 ml minus cellvolymen och blanda försiktigt genom inversion.
- Lägg 300.000 celler i metylcellulosa medium och blandas noggrant genom att vända försiktigt.
- Pipettera 150 ul av blandningen cell / metylcellulosa / media (för en summa av 3000 celler / brunn) i varje brunn i en 96-brunnars konkav bottnad odlingsplatta och odling vid 37 ° C, 5% CO2 under 1-4 dagar eller tills enhetliga spheroids bildar (1 sfäroid / väl typiskt observeras).
3. RTCA Cell Invasion Analyser
NEJTE: Impedans avläsningar uttrycks som cellindex (Cl), en dimensionslös parameter, som är en relativ förändring i uppmätt cell impedans representerar cellens status. För analys, importera data till ett kalkylblad, till exempel Microsoft Excel.
- Plansch Framställning
- Att arbeta i grupper om 4 brunnar i taget, tillsätt 50 l matris (utspätt 1:10 i serumfritt odlingsmedier) i varje brunn på den övre kammaren av en 16-väl RTCA CIM platta så att den totala ytan är täckt . Avlägsna 30 pl matris omedelbart, men långsamt, för att bli av med överflödig vätska.
- Inkubera plattan vid 37 ° C under 4 h före användning i en vävnadsodlingsinkubator.
- Tillsätt 30 | il av serumfritt medium (SFM) som är lämpliga för varje cancercelllinje till den övre kammaren, och 160 | il medium med eller utan serum (per din experimentell design) till den undre kammaren.
- Montera CIM plattan genom att klicka på den nedre kammaren in i den övre kammaren och equilibråt i en 37 ° C inkubator under 1 h i en vävnadsodlingsinkubator.
- Programmering av RTCA Instrument
- Öppna RTCA-programmet och välj "Layout"-fliken. Markera alla experimentella brunnar.
- Högerklicka på brunnar och välj "Aktivera brunnar '; fyll sedan i experimentella förhållanden och cellnamn som önskat.
- För att lägga till åtgärder eller understeg till programmet väljer du "Schedule"-fliken och högerklicka på "Lägg till ett steg". Det första steget är en förprogrammerad bakgrund svep, som automatiskt ingår i programmet en gång "lägga ett steg" väljs.
- Ange de önskade program information för steg 2 i RTCA-programmet, som kommer att spela in avläsningar under etableringen av LP9 monolager. Lägg till tidsintervallen mellan impedans avläsningar genom att välja fliken "Intervall" och skriva in '15 min ". Lägg experimentell varaktighet genom att välja "Varaktighet" fliken end in en tid mellan 12-24 timmar.
- För att lägga till efterföljande steg, väljer du "Schedule"-fliken och högerklicka på "Lägg till ett steg" och skriv in uppgifter om de ytterligare åtgärder, som ovan. Steg 3 av RTCA-programmet kommer att rikta instrumentet för att ta avläsningar under spheroid invasion; ange '5 min "under" Intervall "-fliken och '48 hr" under "Varaktighet" fliken.
- Välj "Plate" på menyraden och spara.
- Generering av LP9 Monolayer och Mätning av Sfäroid Invasion
- Placera CIM plattan i RTCA instrumentet och öppna programmet från steg 3.2 ovan. Före lägga celler, välj "Kör" i menyraden och sedan "Start". En bakgrund svep kommer automatiskt att utföras (Steg 1 i RTCA mjukvaruinstruktioner).
- Ta CIM plåten från instrumentet efter bakgrunds svep och placera i en vävnadsodling huva.
- Plate 50,000 LP9 celler suspenderade i 160 l SFM i den övre kammaren i varje CIM platta också.
- Placera plattan i den RTCA instrumentet och ta avläsningar varje 15 min under det att LP9 monoskiktet etablerar över natten (Steg 2 av RTCA programmet).
- Harvest cancer sfäroider genereras enligt steg 2 "Generation av sfäroider i metylcellulosa", ovan.
- Aseptiskt, skär 1 mm utanför upp i en 1 ml pipettspets och använda för att försiktigt hämta innehållet i varje brunn. Överföring till ett sterilt rör.
- Centrifugera sfäroider vid 120 xg under 8 minuter, och ta bort metylcellulosa medium genom försiktig uppsugning.
- Tvätta spheroids två gånger med PBS, centrifugera vid 120 xg under 8 minuter till pellets spheroids efter varje tvätt.
- För varje experimentell väl, resuspendera totalt 10 spheroids i 160 l av medium utan FBS.
- Pausa RTCA experimentet genom att välja "Kör" från menyraden och kontroll &# 8216; Paus ". Ta CIM plåten från instrumentet och placera i en vävnadsodling huva. Sug bort media från varje brunn och ersätta med sfäroid-innehållande media (10 sfärer i 160 l) eller färsk media för LP9-bara kontrollbrunnar.
- Återgå plattan till RTCA instrumentet. Välj "Kör" i menyraden och kontrollera "Avbryt steg". Programmet kommer att gå vidare till nästa steg automatiskt. För att återuppta försöket, välj "Kör" från menyraden och kolla "Start / Fortsätt '. Steg 3 i RTCA-programmet kommer att inleda.
- Dataanalys
- För att bestämma nivån av sfäroid cell invasivitet, subtrahera de värden som erhållits för LP9 cellslager endast från de enskilda avläsningar som erhålls för äggstockscancercellinjer vid varje tidpunkt.
- För att plotta 'sfäroid invasionen', normalisera alla värden till den tidpunkt vid vilken de sfäroider tillsattes till plattan, av setting denna tidpunkt till '0 '.
Representative Results
Äggstockscancer sfäroider kan genereras från många olika typer av cellinjer genom odling av dem i suspension eller genom att skörda primära tumörceller från malign ascites 2,14. Här två epitelial äggstockscancercellinjer, OVCA433 och OVCA429, samt en äggstocks granulosa celltumörlinje, KGN, har använts för att generera sfäroider (Figur 1A). I detta förfarande odlas celler i rundbottnade brunnar medan suspenderades i medium som gjorts viskös genom tillsats av metylcellulosa. Under dessa förhållanden är många ovarian cancerceller uppvisar en inneboende förmåga att aggregera för att bilda sfäroider 13. Efter odling över natten suspenderad i metylcellulosa / medier, alla tre cellinjerna bildade kompakt sfäroida strukturer på cirka 400-500 nm i diameter (Figur 1A). Samtidigt är RTCA CIM plattan framställes, för det första genom att belägga det porösa membranet gränssnitt med matris och sedan ett sammanflytande monoskikt av humana mesothelial celler (figur 1b). När bildas, spheroids överförs sedan till den förberedda CIM plattan. Skördade cancer sfäroider pläteras ovanpå LP9 monoskiktet och utvärderas såsom beskrivs nedan. Bilder under normala fas mikroskopi (eller i lysrörs mikroskopi, om det valfria steget cellmärkning följdes) av parallella kulturer tas regelbundet för att underlätta tolkningen av RTCA data (Figur 1C).
Det är upplysande att bedöma både den basala nivån av invasion av en cancercell linje, liksom chemoattractant-inducerad invasionen. Normalt är basal invasivitet mäts genom tillsats av SFM till både de övre och nedre kamrarna. Komplett medium (10% FBS), som innehåller många potentiella kemoattraherande ämnen, används i det aktuella exemplet för att undersöka "kemoattraherande-inducerad 'invasion (figur 2). Parallella studier av enbart LP9 mesotelceller bekräftade att dessa celler är minimalt ivasive över 2 dagar under antingen basal eller "kemoattraktant" inducerade förhållanden och därmed var en bra cell som ska användas i sam-kulturanalyser med äggstockscancerceller (Figur 2A och 2B). Däremot ovarian cancer sfäroider alstrade med användning av någon av de tre cellinjer uppvisade förmågan att invadera mot ett kemoattraherande (FBS) (figurerna 2A-2C). Den stora fördelen med att använda RTCA realtids instrument jämfört med traditionella slutpunktsanalyser är att förändringar i cell / sfäroid beteende kan kvantifieras med tiden. Över 2 dagars-analysen, det KGN, OVCA429 och OVCA433 cellinjer alla uppvisade förmågan att invadera mot en kemoattraktant (indikeras genom att öka index cell) men låga basala nivåer av invasion (figur 2C). Cellinjerna uppvisade likartade frekvenser av invasion, såsom indikeras av de parallella kurvornas lutning (figur 2C); Men det OVCA429 kurvan uppvisade en högre övre asymptoten,vilket indikerade en högre maximal grad av invasion jämfört med andra cellinjer. Dessutom cellinjer uppvisade skillnader i deras tid till starten av invasionen, med KGN cellerna snabbt invaderar cellen och matrisbarriärer samt OVCA433 och OVCA429 celler som tar 3-5x längre att invadera, respektive (figur 2D). Viktigt är deras beteenden vid början av invasionen var inte prediktiva för deras totala kapacitet för invasion (figur 2C och 2D). Detta tyder på olika inneboende kraft cancercellinjer men kan också tyda på att olika faktorer kan reglera tidiga och sena invasiva beteenden sfäroider.
Figur 1 Sfäroid generation och modell av experimentell inrättas A:.. Jagmagiker enligt faskontrastmikroskopi av sfäroider bildas i metylcellulosa / media (överst) och i matchande cellinje odlas som ett monolager (botten) B:. Schematisk visar RTCA 2 kamrar CIM plattan väl inrättats, där förformade äggstockscancer sfäroider stryks ut på toppen av ett monoskikt av en LP9 mesothelial skikt / matrisbarriären i den övre kammaren och media ± FBS som ett kemoattraherande tillsätts till den nedre kammaren. Elektroder nedanför gränssnittet för 2 kammare åtgärden ökar elektrisk impedans som fler celler invaderar igenom hindren för den nedre kammaren C:. Images of KGN spheroids ovanpå LP9 monolager i faskontrastmikroskopi (vänster) eller fluorescensmikroskopi (höger). Skala barer = 100 ìm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
.. Figur 2 Realtidsäggstockscancer sfäroid invasionen uppgifter A - B: Representativa resultat från en RTCA invasion analys genomförts med och utan FBS i den nedre kammaren i en CIM platta också. KGN cellinvasion jämförs med LP9 mesotelcellerna. Resultaten visas som medelvärde ± SD Cell index från tredubbla brunnar vid 24 h tidpunkt (A) och över en hel två dagars analysperioden (B) C - D:. En jämförelse av den invasiva kapacitet KGN, OVCA429 och OVCA433 cell linjer avbildas under en 24 h period (C) och i mer detaljerat sätt över en 2,5 h period (D).
Discussion
Invaderande äggstockscancerceller samverkar med en rad olika celltyper vid ytan av bukhinnan, inklusive fibroblaster, adipocyter och mesotelcellerna, och dubbelriktad kommunikation mellan cancerceller och peritonealceller tros spela viktiga roller i att driva den metastaser process 2. När behärskar, är lätt att anpassa till studiet av dessa interaktioner inom peritoneal mikro det protokoll som beskrivs häri, t.ex. genom tillsättning av exogena cytokiner, tillväxtfaktorer, eller specifika inhibitorer till den övre eller nedre kamrarna i CIM plattan väl eller genmanipulation av cancer eller peritoneala cellinjer. Dessutom kan denna metod användas med primära äggstockstumörceller skördade nyligen från malign ascites och / eller primära peritonealceller att få direkt inblick i de regulatoriska signaler och cellulära interaktioner som styr etableringen av en metastatisk lesion i bukhålan Användning av RTCA instrument för att mäta den invasiva kapacitet av enstaka celler eller sfäroider erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella enkelslutpunktsanalyser och tidsförlopp bildanalyser. Den RTCA Instrumentet mäter cellulär invasion vid definierade intervall kontinuerligt under loppet av en analys, som kan vara timmar eller dagar. Detta möjliggör bestämning av förändringar i graden av invasionen över tiden, som övervinner de begränsningar av enskilda endpoint analyser. Till exempel undersöker invasionen data från de olika cancercellinjer vid ett enda endpoint (figur 2), till exempel, 3 timmar, kan ha lett till den felaktiga slutsatsen att KGN och OVCA433 celler var långt mer invasiv än OVCA429 celler. En annan fördel med denna teknik är att den RTCA instrumentet mäter förändringar i elektrisk impedans. Det innebär att analyser kan köras utan att märka celler med en exogen agent, vilket kan få oönskade effekter på cell Phenotype eller funktion. Detta blir särskilt viktigt när man studerar primära äggstockscancerceller som härrör från malign ascites, med vilka det är viktigt att hålla manipulationer till ett minimum för att undvika att införa molekylära och fenotypiska förändringar som inte är reflekterande av sin in vivo art 2. Vidare användning av RTCA instrument möjliggör insamling av kvantitativa data i realtid, som inte bara undviker tidskrävande analyser i samband med time-lapse mikroskopi men även möjliggör snabb bestämning av viktiga experimentella fönster för analysoptimering. Detta är särskilt användbart när man jämför effekterna av en rad faktorer på sfäroid invasionen, kan så olika faktorer utövar sin maximala effekter vid olika tidpunkter eller med mycket olika profiler över tiden. Även om detta protokoll är mottaglig för förändringar (t.ex. användning av olika ECM matris, olika cancercellinjer, eller olika mål cells), om att göra så, är det viktigt att notera att olika experimentella betingelser först måste optimeras. Till exempel, innan du påbörjar studier av sfäroid invasionen, det optimala antalet cancerceller / CIM platta väl bör först fastställas genom analys av cellnummer titreringar i monolager kultur. Det optimala antalet sfäroider att använda per brunn är då baserat på denna analys. Till exempel i den nuvarande metoden, spheroids omfatta cirka 3.000 celler vardera när först genereras. Om initiala cellnummer titreringar visar att 30.000 celler i monolager är optimala för detektion i invasionen analyser, då 10 spheroids läggs per CIM platta väl. Dessutom, när de gör co-kultur experiment, är det viktigt att studera beteenden i "mål" cell monolager för sig, för att avgöra om dessa celler är till sin natur invasiv, eftersom det kan förbrylla resultaten. I exemplet visat är cancer sfäroider pläteras ovanpå en LP9 cell Monolayer, med och utan FBS sattes till botten samt en chemoattractant. Parallellt LP9 celler odlas ensam, under varje behandlingstillstånd. På samma sätt, när man studerar den invasiva kapacitet av celler och sfäroider, är det också viktigt att undersöka sina flytt kapacitet samt för att skilja de två beteenden (dvs. invasion kräver den proteolytiska nedbrytningen av en ECM barriär medan migration inte). För att göra detta, utelämna ECM barriären (steg 3.1.1 - 3.1.3) och genomföra analysen parallellt med ECM barriären på plats. Den senare "invasion" åtgärd kan korrigeras honom "migration" åtgärd, om så önskas. Slutligen är det viktigt att notera att den information de fått från åtgärder av elektrisk impedans är begränsad: en gång celler har invaderat in i den nedre kammaren, kan förändringar i sin infästning, spridning, och spridning på undersidan av membranet bidra till förändringar i impedans reaDings. Därför är denna metod mest informativa när den används tillsammans med andra analyser av sfäroid cellviabilitet, adhesion, migration, och morfologi för att på ett heltäckande bedömning sfäroida cell beteenden. Till exempel, i bästa fall, att till fullo förstå sfäroida-mesothelial interaktioner, separata samkulturer bör också avbildas med jämna mellanrum vid standard fasmikroskopi så att kvalitativa bedömningar av sfäroid morfologi och hälsa kan göras parallellt med kvantitativa RTCA analyser av invasion. Om steget valfria märkningen utförs, då de beteenden av enskilda cancerceller kan bestämmas under fluorescensmikroskopi som de frigöras från sfäroid och interagera med de omärkta mesotelcellerna. En extra fördel med fluorescent märkning av cancerceller när samodling med en andra celltyp är att det då är möjligt att bekräfta att endast de cancerceller har invaderat genom cell-och ECM-barriärer.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en CASS Foundation Science and Medicine Grant; (MB); en National Health & Medical Research Council of Australia Project Grant (KLS, 338.516); och av den viktorianska regeringens Operational Infrastruktur Support Program (Australien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
