Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.
सूक्ष्म पारिस्थितिकी में प्रमुख प्रश्नों में से एक "कौन है?" है इस सवाल विभिन्न उपकरणों का उपयोग कर दिए, लेकिन लंबे समय तक चलने वाले सोने के मानकों में से एक डोमेन स्तरीय पीसीआर द्वारा उत्पन्न 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) जीन amplicons दृश्य के लिए किया जा सकता है जीनोमिक डीएनए से amplifying प्रतिक्रियाओं. परंपरागत रूप से, यह क्लोनिंग और सेंगर (केशिका वैद्युतकणसंचलन) पीसीआर amplicons की अनुक्रमण द्वारा किया गया था. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन काफी सरल है और -16 rRNA जीन अनुक्रमण के लिए अनुक्रमण गहराई बढ़ गया है. benchtop sequencers की शुरूआत अब छोटे प्रयोगशालाओं दिन के एक मामले में घर में उनके -16 rRNA अनुक्रमण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है. इधर, एक benchtop अगली पीढ़ी Sequencer का उपयोग -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण के लिए एक दृष्टिकोण विस्तृत है. पर्यावरण डीएनए पहली अनुक्रमण एडेप्टर और बारकोड होते हैं कि प्राइमरों का उपयोग पीसीआर से परिलक्षित होता है. वे तो पायस पीसीआर के माध्यम से गोलाकार कण के लिए मिलकर कर रहे हैं. कणों कर रहे हैं lएक डिस्पोजेबल चिप पर oaded और चिप अनुक्रमण किया जाता है, जिसके बाद अनुक्रमण मशीन में डाला जाता है. दृश्यों, fastq प्रारूप में लिया फ़िल्टर और बारकोड पढ़ता का नमूना सदस्यता की स्थापना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. फिर आगे की सार्वजनिक रूप से उपलब्ध साधनों का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं पढ़ता फ़िल्टर और binned. पढ़ता है जहां एक उदाहरण विश्लेषण Mothur दिया जाता है सॉफ्टवेयर पैकेज के भीतर एक वर्गीकरण खोजने एल्गोरिथ्म के साथ वर्गीकृत किया गया. यहाँ उल्लिखित विधि सरल, सस्ता और सरल है और चल रहे जीनोमिक क्रांति से लाभ लेने के लिए छोटे लैब्स की मदद करनी चाहिए.
यह एक पर्यावरणीय नमूने में निहित आनुवंशिक जानकारी की सम्पूर्णता लक्ष्य के रूप में Metagenomic अनुक्रमण एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है. बन्दूक अनुक्रमण, बड़े डालने पुस्तकालयों और amplicon अनुक्रमण सहित metagenomic अनुक्रमण के विभिन्न जायके हैं. Amplicon अनुक्रमण आम तौर पर गठबंधन किया जा सकता है कि एक ही जीनोमिक क्षेत्र से अपेक्षाकृत सस्ती, तेज और पढ़ता उत्पादन करने में सक्षम होने का लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, amplicon अनुक्रमण के लिए डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह ज्यादातर मानकीकृत है. यह पीसीआर पर आधारित है हालांकि, बाद से, यह सब अधूरा विशिष्टता, अधूरा कवरेज और प्राइमर से संबंधित पूर्वाग्रहों पर सबसे अच्छा अर्द्ध मात्रात्मक इस दृष्टिकोण बनाता है जो 1,2, biases है. कई जीनोमिक क्षेत्रों कार्यात्मक जीन सहित amplicon अनुक्रमण के लिए लक्षित किया जा सकता है, लेकिन सबसे लोकप्रिय विकल्पों में एक समुदाय प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए इस तरह के -16 rRNA जीन के रूप में मार्कर जीन का उपयोग करने के लिए कर रहे हैं. परंपरागत रूप से, -16 rRNA जीन amplicon sequencing ई में क्लोनिंग शामिल है कि श्रम गहन तकनीक का उपयोग किया गया था कोलाई, कॉलोनी उठा और अलग प्लास्मिड पर सेंगर अनुक्रमण द्वारा पीछा प्लाज्मिड निकासी, और इसके परिणामस्वरूप, सबसे पढ़ाई नमूना प्रति 100 से कम क्लोन का विश्लेषण किया. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दो प्रमुख अग्रिमों लाया: सबसे महत्वपूर्ण बात अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं और, की भारी parallelization, टेम्पलेट्स के प्रतिरूप जुदाई एक मेजबान में जीन टुकड़े डालने की जरूरत के बिना. यह काफी -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण 3 के लिए एक "पुनर्जागरण" में जिसके परिणामस्वरूप, अब वापस कई पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन का एक नियमित विशेषता के रूप में है जो -16 rRNA जीन amplicons की अनुक्रमण, सरल बनाया गया है.
2005 4 में रॉश 454 अनुक्रमण के आगमन के बाद से, कई अन्य अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के बाजार पर दिखाई दिया है (उदाहरण के लिए, Illumina, ठोस, PacBio). पीठ टॉप अनुक्रम की अभी हाल ही में परिचयरुपये छोटे प्रयोगशालाओं के लिए बड़े अनुक्रमण केन्द्रों के लिए एक बार अनन्य अनुक्रमण क्षमता लाया. पांच benchtop मशीनों वर्तमान में उपलब्ध हैं: 454 जी एस जूनियर, आयन धार व्यक्तिगत जीनोम मशीन (PGM) और प्रोटॉन, और Illumina MiSeq और NextSeq 500 इन सभी sequencers कम की पेशकश सबसे पूर्ण से चलाने के लिए और डॉलर प्रति कम अड्डों प्रति पढ़ता है जबकि पैमाने sequencers, वे तेजी से, अधिक लचीला कर रहे हैं, और उनके कम अधिग्रहण और रन लागत छोटे शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए उन्हें सस्ती बनाता है. अध्ययन के इस प्रकार के आम तौर पर अनुक्रमण का एक चरम गहराई की आवश्यकता नहीं है क्योंकि benchtop sequencers विशेष रूप से अच्छी तरह से, पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन में amplicon, छोटे जीनोम और कम जटिलता metagenome अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं. उदाहरण के लिए, यह आम तौर -16 rRNA जीन अनुक्रमण की संख्या के अध्ययन के लिए बहु मिलियन डेटासेट 5 पढ़ता के रूप में एक ही पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं पढ़ता 1000 ~ के रूप में, नमूना प्रति पढ़ता सर्वोपरि नहीं है कि सहमति व्यक्त की है. वाले ने कहा कि, benchtop अगली generatio n sequencers अभी की अधिक से अधिक पैदावार के साथ अनुक्रम डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पन्न ~ 35 MBP (454 जी एस जूनियर), ~ 2 GBP (आयन टोरेंट PGM), ~ 10-15 GBP (आयन टोरेंट प्रोटोन), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) और सबसे पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए पर्याप्त से अधिक है जो ~ 100 GBP (Illumina अगला Seq 500),.
Benchtop sequencers का उपयोग -16 rRNA amplicons की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण हाल ही में वातावरण की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया गया है. उदाहरण के लिए, आयन धार PGM समुदाय के लिए इस्तेमाल किया गया है तेल रेत खनन प्रभावित अवसादों की, हाइड्रोकार्बन दूषित आर्कटिक मिट्टी 8,9 के एक्वाकल्चर सिस्टम 7, recirculating की, विशेष रूप से उच्च पीएच और कम पारगम्यता 6 था कि यूरेनियम खदान के अवशेष का विश्लेषण करती है और मानव और पशुओं के शव 13-16 से, दूषित मिट्टी 12 में लगाए विलो की और anaerobic digesters 17 के rhizosphere के Athabasca नदी 10,11 से biofilms,.
इस योगदान हम विस्तार एक benchtop अगली पीढ़ी Sequencer (आयन टोरेंट PGM) का उपयोग घर में -16 rRNA जीन amplicons दृश्य के लिए हमारे दृष्टिकोण में jove_content ">. डीएनए निष्कर्षण के बाद -16 rRNA जीन होते हैं जो डोमेन स्तरीय बैक्टीरियल प्राइमरों का उपयोग परिलक्षित कर रहे हैं अनुक्रमण एडेप्टर और अद्वितीय, नमूना विशिष्ट दृश्यों (बारकोड). amplicons एक equimolar अनुपात में, शुद्ध मात्रा निर्धारित और जमा कर रहे हैं. जमा नमूने तो clonally एक पायस पीसीआर में परिलक्षित और अनुक्रम रहे हैं. परिणामस्वरूप दृश्यों (सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जैव सूचना विज्ञान उपकरण का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं जैसे, Mothur).यहाँ प्रस्तुत विधि सरल और सस्ता है, और कई प्रयोगशालाओं metagenomic अनुक्रमण की शक्ति का उपयोग करने की अनुमति चाहिए. इसे इस्तेमाल अनुक्रमण मंच पर निर्भर करता है, एक बार पुस्तकालयों प्रक्रिया का सबसे automatized होने के साथ बहुत कम हाथों पर समय की आवश्यकता है, निर्माण कर रहे हैं. यहां इस्तेमाल अनुक्रमण मंच (आयन टोरेंट PGM) के लिए, पूरी प्रक्रिया काम के दो दिन के भीतर किया जा सकता है. पीसीआर 36 नमूनों की प्रवर्धन: 36 नमूनों की $ 25, जेल शुद्धि और PicoGreen डीएनए quantitation इस प्रकार है: (2013 सितम्बर) लिखने का फिलहाल, ऊपर विस्तृत उदाहरण से संबंधित अभिकर्मक लागत थे 125 डॉलर पायस पीसीआर एक जमा amplicon नमूने लिए : $ 550 या नमूना प्रति $ 15 या गुणवत्ता फ़िल्टर पढ़ें प्रति $ 0.0015 की कुल के लिए $ 250, $ 150 और अनुक्रमण अभिकर्मकों. यह कीमत साधन सेवा अनुबंध, साधन मूल्यह्रास, तकनीशियन वेतन और प्रयोगशाला अंतरिक्ष उपयोग शामिल नहीं है.
नमूनों में से प्रत्येक के लिए पढ़ता तम्बू "> सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक समान संख्या प्राप्त करने के लिए, एक equimolar अनुपात में सभी उत्पादों पूल करने के लिए है. PicoGreen मात्रा का ठहराव यहां इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य तरीकों हालांकि कम सही, उपयुक्त हो सकता है (जैसे, यूवी मात्रा का ठहराव, जेल आधारित मात्रा का ठहराव). यहां तक कि सबसे सही मात्रा का ठहराव और पूलिंग करके, नमूना प्रति पढ़ता की संख्या में कुछ परिवर्तनशीलता है, और तालिका 2 में विस्तृत विशिष्ट समय में, यह 4,380 से 32,750 के बीच है 10,338 की औसत पढ़ता के साथ पढ़ता है. नमूने (अधिक 40-50 की तुलना में) की बड़ी संख्या प्रसंस्करण, तो एक स्तंभ जेल शुद्धि एक कड़े आकार कटऑफ के साथ थाली या शुद्धि का उपयोग मोतियों में जेल शुद्धि द्वारा बदला जा सकता है (उदाहरण के लिए, AMPure मोती) .तिथि करने के लिए, -16 rRNA जीन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 454. आयन धार अनुक्रमण प्रौद्योगिकी धारणा बहुत समान है454 के लिए और दोनों प्रौद्योगिकियों अनुक्रमण त्रुटियों के एक ही प्रकार से ग्रस्त हैं. आश्चर्य नहीं कि यह आयन धार अनुक्रमण 454 अनुक्रमण 10 के लिए बहुत ही अनुक्रमण परिणाम में हुई है कि दिखाया गया था. हाल ही में, कई शोधकर्ताओं -16 rRNA जीन amplicon अनुक्रमण 18,19 के लिए Illumina प्रौद्योगिकी के उपयोग का पता लगाया है. किसी भी मामले में, यह विधि में हाल ही में वर्णित की तरह, इन अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए आवश्यक एडेप्टर और बारकोड मैच के लिए संलयन प्राइमर दृश्यों बदलकर Illumina MiSeq या 454 जी एस जूनियर जैसे अन्य benchtop sequencers के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए आसान होगा Illumina MiSeq 19 के लिए. वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ताओं कदम यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल का 1 और 2 का पालन करें और पायस पीसीआर और अनुक्रमण प्रदर्शन किया जाएगा, जहां एक अनुक्रमण केंद्र के लिए जमा amplicons भेज सकता है.
-16 RRNA जीन छंटनी और Mothur का उपयोग कर वर्गीकृत, लेकिन कई अन्य विश्लेषण पर प्रदर्शन किया जा सकता गया पढ़ता-16 RRNA जीन amplicons. उदाहरण के लिए, बीटा विविधता में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर प्रत्येक नमूना जोड़ी के बीच Unifrac दूरी की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता http://unifrac.colorado.edu/ 20. अल्फा विविधता सूचकांक और प्रत्येक नमूने की परिचालन वर्गीकरण इकाइयों की संख्या AmpliconNoise 21 तरह QIIME के भीतर उपकरण का उपयोग कर या Mothur भीतर HUSE एट अल. 22 और उपलब्ध द्वारा उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग कर की गणना की जा सकती है.
यहां इस्तेमाल किया प्राइमरों -16 rRNA जीन से चर क्षेत्रों 3 और 4 परिलक्षित है, लेकिन कई अन्य क्षेत्रों को निशाना बनाया जा सकता है. वर्तमान अध्ययन में, -16 rRNA जीन संयंत्र सामग्री से परिलक्षित थे और प्राइमर का चुनाव क्लोरोप्लास्ट -16 rRNA जीन 23,24 के प्रवर्धन से बचने के लिए किया गया था. उत्पाद की लंबाई, वर्गीकरण शक्ति और उपयोगिता 25,26 की अवधि में भिन्नता है कि उपलब्ध अन्य प्राइमरों की एक विस्तृत विविधता है. हालांकि, सभी मामलों में 200-400 बीपी मज़बूती प्रजातियों स्तर पर वर्गीकृत नहीं किया जा सकता -16 rRNA जीन की पढ़ता है, और विश्लेषण जीनस और उच्च वर्गीकरण के स्तर तक ही सीमित हैं. प्रजातियों स्तर जानकारी cpn60 और rpoB जीन 27,28 तरह की जरूरत है, अगर अन्य जीन अधिक उपयुक्त हो सकता है. विश्लेषणात्मक उपकरणों के सत्ता में अनुक्रमण और बढ़ जाती है की लागत में भविष्य कठोर बूंदों यह संभव बन्दूक metagenomics द्वारा -16 rRNA जीन अनुक्रमण बदलने के लिए कर सकता है, लेकिन तब तक -16 rRNA जीन अनुक्रमण पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान के सोने के मानक बनी हुई है.
The authors have nothing to disclose.
Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.
Reagent | Company | Catalog Number |
Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 |
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 |
Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 |
HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 |
Primers and probes | IDT | NA |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |