Abstract
En av de store spørsmålene i mikrobiell økologi er "hvem er det?" Dette spørsmålet kan besvares ved hjelp av ulike verktøy, men en av de langvarige gullstandard er å sekvensere 16S ribosomalt RNA (rRNA) genet amplikonene generert av domenenivå PCR reaksjoner forsterke fra genomisk DNA. Tradisjonelt ble dette utført av kloning og Sanger (kapillær elektroforese) sekvensering av PCR amplikonene. Ankomsten av neste generasjons sekvensering har enormt forenklet og økt sekvense dybde for 16S rRNA gensekvensering. Innføringen av stasjonære sequencere nå kan små laboratorier for å utføre sine 16S rRNA sekvensering i huset i løpet av noen dager. Her er en tilnærming for 16S rRNA-genet amplicon sekvensering ved hjelp av en benkeplate Bøk neste generasjons sequencer detaljert. Miljø DNA blir først forsterket av PCR ved hjelp av primere som inneholder sekvense adaptere og strekkoder. De blir deretter koplet til sfæriske partikler via emulsjon PCR. Partiklene er loaded på en engangs-brikken, og brikken blir satt inn i sekvenseringsmaskin hvoretter sekvensering er utført. Sekvensene blir hentet i fastq format, filtrert og strekkodene blir brukt til å etablere prøven medlemskap i leser. Den filtrerte og binned leser blir deretter analysert videre med offentlig tilgjengelige verktøy. Et eksempel analyse der leser ble klassifisert med en taksonomi-finding algoritme innen programvarepakken Mothur er gitt. Metoden skissert her er enkel, billig og grei og skal hjelpe mindre laboratorier for å dra nytte av den pågående genomisk revolusjon.
Introduction
Metagenomic sekvensering er en svært kraftig teknologi som det er rettet mot helheten av den genetiske informasjonen i en miljøprøve. Det finnes ulike varianter av metagenomic sekvensering, inkludert hagle sekvensering, stor innsats biblioteker og amplicon sekvensering. Amplikon sekvensering har fordelen av å være relativt billig, rask og i stand til å produsere leser fra en enkelt genomisk region som kan være generelt justert. I tillegg er arbeidsflyten dataanalyse for amplikon sekvense hovedsakelig standardisert. Men siden det er basert på PCR, har den alle skjevheter knyttet til ufullstendig spesifisitet, ufullstendig dekning og primer penner 1,2, noe som gjør denne tilnærmingen semi-kvantitativ i beste fall. Flere genomiske regioner kan være målrettet for amplicon sekvense inkludert funksjonelle gener, men de mest populære alternativene er å bruke markørgener som 16S rRNA-genet til å generere et fellesskap profil. Tradisjonelt 16S rRNA-genet amplicon Sequencing ble utført ved hjelp av arbeidsintensive teknikker som inkluderte kloning i E. coli koloni plukking og plasmid ekstraksjon etterfulgt av Sanger-sekvensering av de isolerte plasmider, og følgelig, de fleste studiene analysert færre enn 100 kloner per prøve. Neste-generasjons sekvense brakt to store framskritt: massiv parallellisering av sekvense reaksjoner og, viktigst, klonal separasjon av maler uten behov for å sette inn genfragmenter i en vert. Dette har forenklet enormt sekvensering av 16S rRNA-genet amplikonene, som nå er tilbake som en rutinemessig funksjon i mange miljø mikrobiologi studier, noe som resulterer i en "renessanse" for 16S rRNA-genet amplicon sekvense tre.
Siden advent av Roche 454 sekvensering i 2005 4, har flere andre neste generasjons sekvensering teknologier dukket opp på markedet (f.eks, Illumina, Solid, PacBio). Mer nylig, innføring av benk-topp-sekvensenrs brakt til små laboratorier sekvensekapasitet gang eksklusivt til store sekvensesentre. Fem stasjonære maskiner er for tiden tilgjengelige: 454 GS Junior, den Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) og Proton, og Illumina MiSeq og NextSeq 500. Mens alle disse sequencere tilbyr mindre leser per kjøring og færre baser per dollar enn de fleste full skala sequencere, de er mer fleksibel, rask, og deres lave oppkjøps og kjøre kostnader gjør dem rimelig for små akademiske laboratorier. Stasjonære sequencers er spesielt godt egnet for amplikon, lite genom og lav kompleksitet metagenome sekvense i miljøstudier mikrobiologi, fordi denne type studier generelt krever ikke en ekstrem dybde på sekvensering. For eksempel er det generelt enighet om at for 16S rDNA-sekvenseringsstudier antall leser per prøve er ikke av vesentlig betydning, da ~ 1000 leser kan generere de samme mønstre som flere millioner leser datasettene 5. Når det er sagt, benkeplate Bøk neste generatio n sequencere fortsatt generere store mengder sekvensdata, med maksimal avkastning av ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) og ~ 100 GBP (Illumina Neste Seq 500), som er mer enn nok for de fleste miljø mikrobiologi studier.
Neste-generasjons sekvensering av 16S rRNA amplikonene bruker stasjonære sequencere har nylig blitt brukt til en rekke miljøer. For eksempel har den Ion Torrent PGM blitt brukt for samfunnet analyser av uran gruveavfall som hadde spesielt høy pH og lav permeabilitet 6 av resirkuleringsteknologi 7, av hydrokarbonforurenset arktiske jord 8,9, av oljesand gruve berørt sedimenter og biofilm fra Athabasca River 10,11, av rhizosphere av piletrær plantet i forurenset jord 12, av mennesker og dyr organer 13-16 og anaerobe råtne 17.
jove_content "> I dette bidraget vi detalj vår tilnærming med å sekvensere 16S rRNA-genet amplikonene i huset ved hjelp av en benkeplate Bøk neste generasjons sequencer (Ion Torrent PGM). Etter DNA-ekstraksjon, 16S rRNA gener blir forsterket ved hjelp av domenenivå bakterielle primere som inneholder sekvense adaptere og unike, sample-spesifikke sekvenser (strekkoder). Are The amplikonene renset, kvantifiseres og samlet på en ekvimolar ratio. Den samleprøver blir deretter clonally forsterkes i en emulsjon PCR og sekvensert. anholding sekvenser analysert ved hjelp av offentlig tilgjengelige bioinformatikk ( f.eks Mothur).Protocol
1. 16S rRNA Gene Amplicon Library Forberedelse av Fusion Method
- Tine primere (forward, F343-Iona-MIDXX: 5'- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; revers, R533-IonP1: 5'- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG PÅ ET TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; dristige: Ion Torrent spesifikke adaptere, uthevelse: sekvense nøkkelen for kalibrering signal intensitet i begynnelsen av sekvense run; vanlig skrift: malspesifikke primere, X ... X: 10 bp strekkode, se tabell 1 for noen strekkode sekvenser), 2x HotStartTaq Plus mester mix og prøvene. Bland grundig før bruk, bortsett fra konsentrat-blanding som skal blandes forsiktig.
- Forbered en PCR mix (20 mikroliter reaksjoner) med 0,5 mikrometer av motsatt primer, 0,4 mg / ml Bovine Serum Albumin (BSA) og 1x HotStartTaq Plus Master mix. Legg 18.5 mL av master mix til each PCR-rør.
- Legg til en fremre primer (0,5 mikroliter 20 mM) med en annen strekkode for hver av prøvene som skal bli sekvensert sammen. Tilsett 1 ul prøve (1-10 ng / mL) for å PCR-røret.
- Plasser rørene i en PCR-maskin og kjøre det følgende program: innledende denaturering ved 95 ° C i 5 min; 25 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 45 sekunder; sluttforlengelse ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter kan oppbevares ved 4 ° CO / N eller frosset inntil bruk.
2. Amplicon Rensing, Kvantifisering og Pooling
- Forbered en 2% agarosegel ved hjelp av de største Combs tilgjengelig. Tilsett 5 ul av 6x gel laste fargestoff til reaksjonen, og belastningen på gelen, separering av hver prøve etter en tom godt. Kjør gelen ved 70 V i 50 min.
- Ta et bilde av gel og kutte båndene (forventet størrelse rundt 250 bp: 190 bp produkt pluss 63 bp adaptere og strekkoder) ved hjelp av en ren skalpell.
- Tall hver PCR-produkt med PicoGreen og foreta fortynninger for å oppnå en stamløsning på 5 x 10 molekyler 9 / mikroliter (ca. 1 ng / mL). Hvis noen prøver viser lavere forsterkning, justere fortynninger til en lavere konsentrasjon, med tanke på at den laveste konsentrasjonen egnet for påfølgende prosedyrer er 1.57 x 10 7 molekyler / mikroliter (26 pm).
- Pool 10 mL av hver fortynnet PCR-produkt for å oppnå en ekvimolar pool av prøvene. Forbered ett eget basseng for hver av de planlagte sekvense løp. De sammenslåtte PCR-produkter kan holdes i fryseren inntil bruk.
3. Emulsion PCR og sekvensering
- Utfør emulsjon PCR:
- Fortynn de sammenslåtte PCR produktene til 26 pM i et volum på 25 pl. Tine reagenser fra en Ion PGM mal kit.
- Forbered emulsjonen PCR mix (reagenser følger med i pakken) i en PCR hette og legge de samlede PCR produktene og Sphere partikler (følger med) på benken. Bland godt og sett blandingen i en filterpatron og nøye toppen med emulsjon olje (følger med).
- Sakte reversere filterpatronen og belastningen på den automatiserte emulsjon PCR apparat (f.eks Ion One Touch 2 instrument). Velg riktig program og starte prosedyren.
- Etter den automatiserte emulsjon PCR er fullført, fjern supernatanten fra prøverør og hente sfære partikler på bunnen av rørene. Suspender kuler i 100 mL av vaskeløsning (følger med settet) og ta en 2,0 mL delmengde for bibliotek kvantifisering.
- Utfør biblioteket kvantifisering.
- Bland 100 mL av SSPE buffer (150 mM NaCl, 10mm Napo 4, 1mM Na 2 -EDTA) med 2 mL av Adapter B'-Fam (5'- FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') probe og 2 ul av adapter A-Cy5 (5'- Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') probe. Legg 52 pl av denne blanding til 2,0 pl alikvot tatt i trinn 3.2, og legge til 2 mL av vaskeløsning (fra malen kit) til de gjenværende 52 ul som en blank for kvantifisering.
- Inkuber ved 95 ° C i 2 min, og deretter ved 37 ° C i 2 min. Overfør blandinger i 1,5 ml rør.
- Tilsett 1,0 ml av TEX-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), bland og sentrifuger ved 15 500 x g i 3 min ved RT. Fjern supernatanten og la 20 ul i hvert rør. Gjenta denne vaskeprosedyren to ganger.
- Legg 180 mL av TEX buffer, resuspender pelleted partikler og overfør til 500 mL qubit rør.
- Måle fluorescens for FAM og Cy5 bruker en qubit apparater og beregne forholdet mellom positive kuler ved hjelp av kalkulatoren tilgjengelig på Ion Community nettsted.
- Rikere resten av kulen partikler for positive kuler (som inneholder amplifisert DNA) ved bruk av et automatisert system anrikning (f.eks Ion One Touch Enrichment System).
- Pipettes reagenser i de aktuelle brønnene i den medfølgende 8-brønn stripe: Vel 1: sfære partikler fra trinn 3.2; Vel 2: pre-vasket myone Streptavidin C1 perler (13 mikroliter); Vel 3, 4 og 5: vaskeløsning (angitt i malen kit); Vel 6: tom; Brønn 7: smelte-off-oppløsning (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Vel 8: tom.
- Installer et tips på pipettering arm og en 0,2 ml tube for prøvetaking. Start instrumentet. Ved slutten av anrikning, tilsett 10 pl av nøytraliserende oppløsning (tilgjengelig). De anrikede perler kan holdes et 4 ° C i opp til 15 dager.
- Initialisere sekvense instrument:
- Koble til sekvense instrument og forberede en sekvense kjøre plan, angi detaljene i sekvense løp.
- Install vaskeløsningen # 2 (gitt i Ion PGM sekvense kit), vaskeløsningen # 1 (350 mL 100 mM NaOH) og auto-pH bufferløsning (følger med).
- Start initialisering prosedyre og når du blir bedt om legge til dATP, dGTP dCTP og dTTP nukleotider (følger med) i sine respektive 50 ml rør. Skru rørene på sekvensering maskin og fortsette initialiseringsprosedyren. Når initialiseringen er fullført, starter oppkjøringen prosedyren umiddelbart.
- Forbered prøver for sekvensering og laste chip:
- Samle anrikede kuler fra trinn 3.4 ved bunnen av røret ved sentrifugering ved 15 500 xg i 1.5 min. Fjern supernatanten forlate nøyaktig 3 pl.
- Tilsett 3 mL av sekvense primer (forutsatt i sekvense kit), blandes grundig ved pipettering opp og ned for å resuspendere partiklene. Inkuber ved 95 ° C i 2 min, og deretter ved 37 ° C i 2 min.
- Tilsett 1 mL av polymerase (følger med), bland godt og incubspiste ved RT i 5 min. Fortsett å laste det enzym-sfæren blandingen på sekvenseringsbrikken innen 30 min.
- Under inkubasjon, laste sekvense brikke på sequencer og utføre en chip kvalitetskontroll. Fjern væsken fra brikken ved sentrifugering og laste prøven i brikken ved sakte pipeting nedover enzym-sfæren blanding (7 mL) og å unngå innføring av bobler i brikken.
- Sentrifuger brikken tre ganger i 1 min i en mikrosentrifuge. Endre retningen av chip på hver sentrifugering og bland ved å pipettere opp og ned mellom hvert løp.
- Laste chip i instrumentet og starte kjøringen.
4. Grunnleggende Sequence Data Analysis
- Koble til sekvensedataserver og laste ned fastq fil. Lag en tabulatordelt "oligos" fil som inneholder primer og strekkode informasjon (se eksempel i tabell 1). Last ned Greengenes referansefiler fra MotHur hjemmeside ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
- Lansere Mothur og utføre analyser:
- Konverter fastq filen til en fasta og en kvalitet-fil ved hjelp av følgende kommando: fastq.info (fastq = test.fastq)
- Bestem gruppemedlemskap for hver sekvens og trim sekvensene ved hjelp av følgende kommando: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T)
- De forskjellige alternativer kan bli modifisert i henhold til den ønskede stringens
- Klassifisere sekvenser i greengenes taksonomi ved hjelp av følgende kommando: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, group = test.groups, mal = gg_99_otus.fasta, taksonomi = gg_99_otus.tax, cutoff = 50)
Representative Results
Etter rensing på gelen, med 25 sykluser med PCR-amplifikasjon, amplifikasjonsproduktene er vanligvis ved en konsentrasjon på 0,2 til 10,0 ng i 50 pl vann. Dette kan variere vidt avhengig av utgangs-DNA-konsentrasjon, type av prøve og rensesett som brukes. Det anbefales å holde antall PCR-sykluser til lavest mulig for å unngå chimera dannelse og redusere forsterkningsskjevheter, husk at alle prøver skal forsterkes ved å bruke samme antall sykluser. For å minimere antall polyklonale leser og tomme kuler og maksimere antall leser, bør qubit forholdet være mellom 0,1 og 0,3 og FAM fluorescens bør være over 200. Ved hjelp av en 314-brikke på en Ion Torrent PGM, er den gjennomsnittlige produksjonen rundt 0,3-0,5 M god kvalitet leser etter filtrering av resultatene i Mothur. Tabell 2 viser en typisk fordeling av antall leser etter hvert trinn av prosedyren for en kjøring som inneholder 36 multiplekset miljømentale prøver forsterket med primere rettet mot V3-4 regionen 16S og analysert ved hjelp Mothur. I Mothur, den trim.seqs prosedyre generere en "* .trim.fasta" fil som inneholder sekvenser som passerte kvalitetsfiltre og en "* .scrap.fasta" som inneholder sekvenser som ikke bestod kvalitetsfiltre sammen med årsaken for avvisning i sekvensen spissen. Når leveres med strekkoder i "oligos" fil, vil denne kommandoen også generere en "* .groups" fil som inneholder gruppen medlemskap i hver sekvens basert på strekkodesekvensen. Den classify.seqs prosedyren genererer en ".tax.summary" som kan åpnes i Excel. Denne fil inneholder en oppsummering av den taksonomiske tilhørighet (i linjer) for hver av prøvene (i kolonner). Denne filen kan brukes til nedstrøms statistiske analyser og for å visualisere fellesskap sammensetning ved forskjellige taksonomiske nivåer. Den ".taxonomy" filen inneholder detaljert taksonomisktilhørighet for hver sekvens. Den gjennomsnittlige fellesskap komposisjon ved rekken / klasse nivå av alle 36 prøvene er vist i figur 1.
Figur 1. Gjennomsnittlig samfunnet komposisjon ved phylum / klassenivå på tvers av alle prøvene.
| frem | TACGGRAGGCAGCAG | |
| strekkode | CTAAGGTAAC | Sample01 |
| strekkode | TAAGGAGAAC | Sample02 |
| AAGAGGATTC | Sample03 | |
| strekkode | TACCAAGATC | Sample04 |
| strekkode | CAGAAGGAAC | Sample05 |
| strekkode | CTGCAAGTTC | Sample06 |
| strekkode | TTCGTGATTC | Sample07 |
| strekkode | TTCCGATAAC | Sample08 |
| strekkode | TGAGCGGAAC | Sample09 |
| strekkode | CTGACCGAAC | Sample10 |
Tabell 1. Eksempel "oligos" fil for bruk i Mothur.
| # Av leser | % Av forrige trinn | Avg. per prøve | |
| Antall brønner | 1262519 | - | 35070 |
| Brønner med perler | 1114108 | 88.20% | 30947 |
| Perler med maler | 1112746 | 99.90% | 30910 |
| Monoklonale perler | 826805 | 74.30% | 22967 |
| God kvalitet leser (Utgang fra sequencer) | 782204 | 94.60% | 21728 |
| Pass Mothur filtre (min. Avg. Kvalitet score på 20 over en 50bp vindu, min. Lengden på 150bp) | 372168 | 47.60% | 10338 |
| Klassifisert til phylum nivå i GreenGenes (50% konfidensintervall terskel) | 342171 | 91.90% | 9505 |
| Klassifisert på familienivå i GreenGenes (50% konfidensintervall terskel) | 316512 | 92.50% | 8792 |
| Klassifisert til slekten nivå i GreenGenes (50% konfidensintervall terskel) | 289899 | 91.60% | 8053 |
Tabell 2. Antall lesninger fremstilt fra et typisk løp for 36 miljøprøver multiplekset på en Ion counter 314 chip.
Discussion
Metoden som presenteres her er enkel og billig, og bør tillate mange laboratorier for å få tilgang til kraften i metagenomic sekvensering. Selv om det varierer avhengig av sekvenseplattform som brukes, når bibliotekene er konstruert svært lite hands-on tid er nødvendig, med det meste av prosessen blir automatisert. For sekvense plattformen som brukes her (Ion Torrent PGM), kan hele prosedyren utføres innen to dager med arbeid. På tidspunktet for å skrive (september 2013), reagens- kostnader knyttet til eksemplet beskrevet ovenfor var som følger: PCR forsterkning av 36 prøver: $ 25, gel rensing og PicoGreen DNA kvantifisering av 36 prøver: $ 125, emulsjon PCR for en pooled fragment prøve : $ 150 og sekvense reagenser: $ 250, for totalt $ 550 eller $ 15 per prøve eller $ 0,0015 per kvalitets filtrert lese. Denne prisen inkluderer ikke instrument servicekontrakt, instrument avskrivninger, tekniker lønn og laboratorieplass bruk.
telt "> En av de viktigste trinn er å samle alle produkter i en ekvimolar forhold, for å kunne hente lik antallet avlesinger for hver av prøvene. PicoGreen kvantifisering ble brukt her, men også andre metoder kan være passende, skjønt mindre nøyaktige (for eksempel UV-kvantifisering, gel-basert kvantifisering). Selv ved å gjøre den mest mulig nøyaktig kvantifisering og pooling, det er en viss variasjon i antall leser per prøve, og i det typiske kjøre beskrevet i tabell 2, er det i området fra 4380 til 32750 leser, med et gjennomsnitt på 10 338 leser. Hvis behandlingen stort antall prøver (mer enn 40 til 50), kan enkelt kolonne gel rensing erstattes av gel-rensing i plate eller rensing ved hjelp av perler med en strengstørrelse cutoff (f.eks AMPure perler) .Til dags dato er det mest brukte neste generasjons sekvensering teknologi for 16S rRNA-genet 454. Den Ion Torrent sekvensering teknologi som brukes i denne protokollen er konseptuelt svært liktil 454, og begge teknologier er utsatt for samme type sekvensfeil. Ikke overraskende ble det vist at Ion Torrent sekvense resulterte i sekvense resultatene svært lik 454 sekvense 10. Nylig har mange forskere utforsket bruk av Illumina teknologi for 16S rRNA-genet amplicon sekvense 18,19. I alle fall ville det være lett å tilpasse gjeldende protokoll for andre stasjonære sequencere som Illumina MiSeq eller 454 GS Junior ved å endre fusjons primer sekvenser å matche adaptere og strekkoder trengs for disse sekvensering teknologier, som i metoden nylig beskrevet for Illumina MiSeq 19. Alternativt kunne forskerne følge trinn 1 og 2 i protokollen detaljert her og sende de samlede amplikonene til en sekvensering senter hvor emulsjonen PCR og sekvensering vil bli utført.
16S rRNA-genet leser ble trimmet og klassifisert ved hjelp Mothur, men mange andre analyser kan utføres på16S rRNA-genet amplikonene. For eksempel kan beta mangfold evalueres ved å beregne Unifrac avstandene mellom hver prøve paret ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i http://unifrac.colorado.edu/ 20. Alpha diversitetsindekser og antall operative taksonomiske enheter av hver prøve kan beregnes ved hjelp av verktøy innen QIIME som AmpliconNoise 21 eller ved hjelp av prosedyren skissert av Huse et al. 22 og tilgjengelig innen Mothur.
Primere som brukes her forsterket de variable områder 3 og 4 fra 16S rRNA-genet, men mange andre regioner kan bli målrettet. I denne studien ble 16S rRNA gener forsterket fra plantemateriale og valg av primer ble gjort for å unngå forsterkning av kloroplast 16S rRNA-genet 23,24. Det er et bredt utvalg av andre primere tilgjengelige som varierer i term av produktlengden, taksonomisk kraft og nytten 25,26. Men i alle tilfeller 200-400 bp leser av 16S rRNA-genet kan ikke pålitelig klassifisert på artsnivå, og analysene er begrenset til slekten og høyere taksonomiske nivåer. Andre gener kan være mer hensiktsmessig hvis artsnivå informasjon er nødvendig, som cpn60 og rpoB gener 27,28. Fremtidige drastiske fall i kostnadene for sekvensering og øker i kraft av analytiske verktøy kan gjøre det mulig å erstatte 16S rRNA-genet sekvensering ved å hagle metagenomikk, men inntil da 16S rRNA gensekvensering fortsatt gullstandarden for miljømikrobiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 | |
| Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 | |
| Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 | |
| HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 | |
| Primers and probes | IDT | NA | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |
References
- Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
- Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
- Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
- Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
- Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
- Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
- Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
- Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
- Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
- Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
- Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
- Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
- Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
- Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
- Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
- Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
- Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
- Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
- Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
- Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
- Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
- Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
- Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
- Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
- Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).
